Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы демонстрируем трехступенчатую модель органоида (двумерное [2D] расширение, 2D-стимуляция, трехмерное [3D] созревание), предлагающую многообещающий инструмент для фундаментальных исследований сухожилий и потенциальный метод без каркасов для тканевой инженерии сухожилий.

Аннотация

Сухожилия и связки (Т/Л) являются сильными иерархически организованными структурами, объединяющими опорно-двигательный аппарат. Эти ткани имеют строго организованный коллагеновый тип I-богатый внеклеточный матрикс (ECM) и клетки T/L-линии, в основном расположенные параллельными рядами. После травмы Т/Л требуют длительного времени для реабилитации с высоким риском неудачи и часто неудовлетворительными результатами восстановления. Несмотря на недавние достижения в исследованиях биологии Т/Л, одна из нерешенных проблем заключается в том, что в области Т/Л все еще отсутствует стандартизированный протокол дифференцировки, который способен повторить процесс образования Т/Л in vitro. Например, костная и жировая дифференцировка мезенхимальных клеток-предшественников требует только стандартной двумерной (2D) клеточной культуры и добавления специфических стимулирующих сред. Для дифференцировки в хрящи необходимо трехмерное (3D) культивирование гранул и добавление TGFß. Однако дифференцировка клеток в сухожилие требует очень упорядоченной 3D-модели культуры, которая в идеале также должна подвергаться динамической механической стимуляции. Мы создали 3-ступенчатую (расширение, стимуляция и созревание) органоидную модель для формирования 3D-палочковидной структуры из самоорганизующегося клеточного листа, которая обеспечивает естественную микросреду со своими собственными ECM, аутокринными и паракринными факторами. Эти палочковидные органоиды имеют многослойную клеточную архитектуру в богатой ВКМ и могут быть довольно легко обработаны для воздействия статической механической нагрузки. Здесь мы продемонстрировали 3-этапный протокол с использованием коммерчески доступных дермальных фибробластов. Мы смогли показать, что этот тип клеток образует крепкие и богатые ВКМ органоиды. Описанная процедура может быть дополнительно оптимизирована с точки зрения питательных сред и оптимизирована для динамической осевой механической стимуляции. Таким же образом альтернативные клеточные источники могут быть проверены на их способность образовывать органоиды Т/Л и, таким образом, подвергаться дифференцировке Т/Л. В целом, устоявшийся подход к 3D Т/Л органоидам может быть использован в качестве модели для фундаментальных исследований сухожилий и даже для безкаркасной инженерии Т/Л.

Введение

Сухожилия и связки (T/L) являются жизненно важными компонентами опорно-двигательного аппарата, которые обеспечивают необходимую поддержку и стабильность организма. Несмотря на свою критическую роль, эти соединительные ткани склонны к дегенерации и травмам, вызывая боль и нарушение подвижности1. Более того, их ограниченное кровоснабжение и медленная способность к заживлению могут привести к хроническим травмам, в то время как такие факторы, как старение, повторяющиеся движения и неправильная реабилитация, еще больше увеличивают риск дегенерации и травм. Традиционные методы лечения, такие как отдых, физиотерапия и хирургич....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться с использованием асептических методов.

1. Культура и предварительное расширение NHDF

  1. Быстро разморозьте криофлакон, содержащий криоконсервированные нормальные дермальные фибробласты человека (NHDF, 1 x 106 клеток) при 37 °C до тех пор, пока они почти не разморозятся.
  2. Медленно добавьте в клетки 1 мл предварительно подогретой среды для роста фибробластов 2 (готовый к применению набор, включающий базальную среду, 2% эмбриональную телячью сыворотку (FCS), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и инсулин) с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина (ручка/....

Результаты

Модель 3D Т/Л органоида была ранее создана и продемонстрирована здесь путем реализации коммерчески приобретенных NHDF (n=3, 3 органоида на донора, NHDF использовались в пассажах 5-8). Рабочий процесс модели обобщен на рисунке 1. На рисунке 2 показаны репрезентатив.......

Обсуждение

Результаты, продемонстрированные в этом исследовании, дают ценную информацию о создании и характеристике 3D-модели органоида NHDF для изучения тканей T/L. 3-ступенчатый протокол привел к образованию 3D-палочковидных органоидов, которые демонстрируют типичные черты ниши T/L. Эта модель ранее .......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Д.Д. и С.М.-Д. признательно за грант BMBF «CellWiTaL: Воспроизводимые клеточные системы для исследования лекарств — беспослойная лазерная печать высокоспецифичных одиночных клеток в трехмерных клеточных структурах», предложение No 13N15874. D.D. и V.R.A. признают грант EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS «Целостное обучение исследований остеоартрита следующего поколения» GA Nr. 101034412. Все авторы выражают благодарность г-же Беате Гейер за техническую помощь.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acid  Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany  A8960
10 cm adherent cell culture dishSigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430167
10 cm non-adherent petri dish Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430591
Cryo-mediumTissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands  4583
Cryomold standard Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands4557
D(+)-Sucrose AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, GermanyA2211
DMEM high glucose medium Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany DMEM-HA
DMEM low glucoseCapricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  DMEM-LPXA
Fetal bovine serum Anprotec, Bruckberg, Germany AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2 PromoCell, Heidelberg, Germany  C-23020
Inverted microscope with high resolution cameraZeissNAZeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  NEAA-B
Metal pins EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic 04.31
Normal human dermal fibroblasts  PromoCell, Heidelberg, Germany C-12302
Paraformaldehyde AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A3813
Penicillin/streptomycin Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany15140122
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P4417
TGFß3 R&D Systems, Wiesbaden, Germany  8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  TRY-1B

Ссылки

  1. Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
  2. Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

2083D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены