Демонстрация самоорганизующейся культуры клеточных листов и ручная генерация 3D-органоида, похожего на сухожилие/связку, с использованием дермальных фибробластов человека

Резюме

В данной работе мы демонстрируем трехступенчатую модель органоида (двумерное [2D] расширение, 2D-стимуляция, трехмерное [3D] созревание), предлагающую многообещающий инструмент для фундаментальных исследований сухожилий и потенциальный метод без каркасов для тканевой инженерии сухожилий.

Аннотация

Сухожилия и связки (Т/Л) являются сильными иерархически организованными структурами, объединяющими опорно-двигательный аппарат. Эти ткани имеют строго организованный коллагеновый тип I-богатый внеклеточный матрикс (ECM) и клетки T/L-линии, в основном расположенные параллельными рядами. После травмы Т/Л требуют длительного времени для реабилитации с высоким риском неудачи и часто неудовлетворительными результатами восстановления. Несмотря на недавние достижения в исследованиях биологии Т/Л, одна из нерешенных проблем заключается в том, что в области Т/Л все еще отсутствует стандартизированный протокол дифференцировки, который способен повторить процесс образования Т/Л in vitro. Например, костная и жировая дифференцировка мезенхимальных клеток-предшественников требует только стандартной двумерной (2D) клеточной культуры и добавления специфических стимулирующих сред. Для дифференцировки в хрящи необходимо трехмерное (3D) культивирование гранул и добавление TGFß. Однако дифференцировка клеток в сухожилие требует очень упорядоченной 3D-модели культуры, которая в идеале также должна подвергаться динамической механической стимуляции. Мы создали 3-ступенчатую (расширение, стимуляция и созревание) органоидную модель для формирования 3D-палочковидной структуры из самоорганизующегося клеточного листа, которая обеспечивает естественную микросреду со своими собственными ECM, аутокринными и паракринными факторами. Эти палочковидные органоиды имеют многослойную клеточную архитектуру в богатой ВКМ и могут быть довольно легко обработаны для воздействия статической механической нагрузки. Здесь мы продемонстрировали 3-этапный протокол с использованием коммерчески доступных дермальных фибробластов. Мы смогли показать, что этот тип клеток образует крепкие и богатые ВКМ органоиды. Описанная процедура может быть дополнительно оптимизирована с точки зрения питательных сред и оптимизирована для динамической осевой механической стимуляции. Таким же образом альтернативные клеточные источники могут быть проверены на их способность образовывать органоиды Т/Л и, таким образом, подвергаться дифференцировке Т/Л. В целом, устоявшийся подход к 3D Т/Л органоидам может быть использован в качестве модели для фундаментальных исследований сухожилий и даже для безкаркасной инженерии Т/Л.

Введение

Сухожилия и связки (T/L) являются жизненно важными компонентами опорно-двигательного аппарата, которые обеспечивают необходимую поддержку и стабильность организма. Несмотря на свою критическую роль, эти соединительные ткани склонны к дегенерации и травмам, вызывая боль и нарушение подвижности¹. Более того, их ограниченное кровоснабжение и медленная способность к заживлению могут привести к хроническим травмам, в то время как такие факторы, как старение, повторяющиеся движения и неправильная реабилитация, еще больше увеличивают риск дегенерации и травм. Традиционные методы лечения, такие как отдых, физиотерапия и хирургич....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться с использованием асептических методов.

1. Культура и предварительное расширение NHDF

1. Быстро разморозьте криофлакон, содержащий криоконсервированные нормальные дермальные фибробласты человека (NHDF, 1 x 10⁶ клеток) при 37 °C до тех пор, пока они почти не разморозятся.
2. Медленно добавьте в клетки 1 мл предварительно подогретой среды для роста фибробластов 2 (готовый к применению набор, включающий базальную среду, 2% эмбриональную телячью сыворотку (FCS), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и инсулин) с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина (ручка/....

Результаты

Модель 3D Т/Л органоида была ранее создана и продемонстрирована здесь путем реализации коммерчески приобретенных NHDF (n=3, 3 органоида на донора, NHDF использовались в пассажах 5-8). Рабочий процесс модели обобщен на рисунке 1. На рисунке 2 показаны репрезентатив.......

Обсуждение

Результаты, продемонстрированные в этом исследовании, дают ценную информацию о создании и характеристике 3D-модели органоида NHDF для изучения тканей T/L. 3-ступенчатый протокол привел к образованию 3D-палочковидных органоидов, которые демонстрируют типичные черты ниши T/L. Эта модель ранее .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B