JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

سيجد الباحثون الجدد في مجال الوراثة اللاجينية أن CUT&Tag بديل أسهل بكثير لمقايسات ChIP. استفادت CUT&Tag بشكل كبير من الدراسات اللاجينية على مجموعات الخلايا النادرة والأولية ، مما أدى إلى توليد بيانات عالية الجودة من عدد قليل جدا من الخلايا. يصف هذا البروتوكول إجراء فحوصات H3K4me1 CUT&Tag على الخلايا العضلية للفأر المعزولة من عضلات الأطراف الخلفية للفأر.

Abstract

تهدف ورقة البروتوكول هذه إلى تزويد الباحثين الجدد بالتفاصيل الكاملة لاستخدام الانقسام تحت الأهداف والوسم (CUT&Tag) لتحديد المواقع الجينومية لعوامل ربط الكروماتين وعلامات الهستون ومتغيرات الهستون. تعمل بروتوكولات CUT&Tag بشكل جيد للغاية مع الخلايا العضلية للفأر والخلايا الجذعية العضلية المعزولة حديثا (MuSCs). يمكن تطبيقها بسهولة على العديد من أنواع الخلايا الأخرى طالما يمكن تجميد الخلايا بواسطة حبات Concanavalin-A. بالمقارنة مع CUT &Tag ، فإن فحوصات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) هي تجارب تستغرق وقتا طويلا. تتطلب فحوصات ChIP المعالجة المسبقة للكروماتين قبل استخدام المادة اللونية للترسيب المناعي. في ChIP عبر الربط (X-ChIP) ، تتضمن المعالجة المسبقة للكروماتين الربط المتقاطع والصوتنة لتفتيت الكروماتين. في حالة ChIP الأصلي (N-ChIP) ، يتم تحقيق الكروماتين المجزأ عادة عن طريق هضم نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase). يقدم كل من صوتنة وهضم MNase بعض التحيز لتجارب ChIP. يمكن الانتهاء من فحوصات CUT &Tag في خطوات أقل وتتطلب خلايا أقل بكثير مقارنة ب ChIPs ولكنها توفر معلومات أكثر غير متحيزة حول عوامل النسخ أو علامات الهستون في مواقع جينومية مختلفة. يمكن أن يعمل CUT&Tag مع ما لا يقل عن 5000 خلية. نظرا لحساسيتها العالية وإشارة الخلفية الأقل من ChIPs ، يمكن للباحثين توقع الحصول على بيانات ذروة موثوقة من عدة ملايين من القراءات بعد التسلسل.

Introduction

تم اختراع اختبار CUT &Tag للتعويض عن بعض العيوب العلنية في ChIPs1. عيبان رئيسيان ل ChIPs هما 1) التحيز الذي تم تقديمه عند تجزئة الكروماتين و 2) عدم الكفاءة للعمل مع أرقام الخلايا المنخفضة. تعتمد مقايسات X-ChIP إما على صوتنة أو هضم MNase للحصول على شظايا الكروماتين ، بينما يستخدم N-ChIP في الغالب هضم MNase للحصول على النيوكليوسومات. يظهر Sonication تحيزا نحو مواقع الكروماتين المسترخية مثل مناطق المروج2 ، وعلى ما يبدو ، يعمل هضم MNase أيضا بشكل أكثر كفاءة على ألياف الكروماتين المريحة. علاوة على ذلك ، أفاد البعض أن هضم MNase يظهر أيضا تحيزا يعتمد على تسلسل الحمض النووي3. لذلك ، في خطوة إعداد المدخلات لمقايسات ChIP ، من المستحيل الحصول على شظايا الكروماتين من جميع أنواع المواقع الجينومية بطريقة عشوائية تماما. علاوة على ذلك ، عادة ما تولد مقايسات ChIP إشارات خلفية أعلى مقارنة ب CUT &Tag وتتطلب قراءات أكثر من 10 أضعاف من CUT &Tag لإبراز مكان القمم1،4،5. وهذا يفسر لماذا يجب أن تبدأ تجارب ChIP بخلايا أكثر بكثير من CUT&Tag. هذه ليست مشكلة عند دراسة خطوط الخلايا حيث يمكن تمريرها بشكل متكرر لتحقيق عدد خلايا مرتفع جدا. ومع ذلك ، فإن اختبار ChIP ليس بالتأكيد أداة جينية قوية لدراسة مجموعات الخلايا الأولية النادرة أو الثمينة ، على الرغم من أن الخلايا الأولية تحمل بوضوح آثارا عملية وطبية أكثر.

في حين أن إجراء ChIP الطويل والمعقد لا يشجع بعض الباحثين على تعلم أو استخدام هذه التقنية ، فإن الناس أكثر راحة مع المقايسات الأسهل مثل الكيمياء المناعية (ICC) أو التألق المناعي (IF). يشبه اختبار CUT &Tag بشكل أساسي عملية تجارب ICC و IF ولكنه يحدث فقط في أنبوب اختبار. لا يحتاج CUT&Tag إلى كروماتين مجزأ ليبدأ به ، وبدلا من ذلك ، يجب أن يكون الجينوم سليما لربط الأجسام المضادة1. في اليوم الأول من تجربة ChIP ، يقضي الباحثون عادة ما يصل إلى 4 ساعات في تحضير الكروماتين المجزأ من النوى باستخدام صوتنة أو هضم MNase قبل خلط قطع الكروماتين القصيرة مع حبات الأجسام المضادة 4,5. في تناقض ملحوظ ، فإن عبء العمل في اليوم الأول لإجراء CUT &Tag هو مجرد شل حركة الخلايا إلى حبات Concanavalin-A ثم إضافة الجسم المضاد الأساسي إلى حبات الخلية. هذا يتطلب فقط ~ 40 دقيقة1.

ومن الجدير بالذكر أن الانقسام تحت الأهداف والإطلاق باستخدام النيوكلياز (CUT&RUN) هو بديل مهم ل CUT&Tag. تم إنشاء CUT &RUN بناء على آلية عمل مماثلة ل CUT&Tag. في CUT&Tag ، توجه الأجسام المضادة ترانسبوزاز pA / G-Tn5 إلى جميع المواقع التي يقوم فيها كل إنزيم بقطع قطعة من الكروماتين وفي الوقت نفسه وضع علامة عليها باستخدام محولات صنع المكتبة ، بينما في CUT &RUN ، يتم لعب دور pA / G-Tn5 بواسطة pA / G-MNase الذي يؤدي فقط جزء القطع من المهمة6. لذلك ، بالمقارنة مع CUT &Tag ، يتطلب CUT &RUN خطوة إضافية وهي لصق محولات صنع المكتبة على قطع الحمض النووي المجزأة pA / G-MNase 7,8. نظرا لأوجه التشابه العالية بين CUT&Tag و CUT&RUN ، فإن الباحثين المطلعين على CUT&Tag سوف يتكيفون بسهولة مع أداء CUT &RUN بكفاءة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى وجود بعض الاختلافات الطفيفة بين CUT &Tag و CUT &RUN. تستخدم بروتوكولات CUT &RUN عادة التركيز المادي للملح (~ 150 mM) في خطوات الغسيل ، بينما في CUT &Tag ، يكون مخزن الغسيل المؤقت 300-Dig غنيا بالملح. لذلك ، فإن CUT &Tag جيد في التحكم في الخلفية عند تحديد سمات / متغيرات الهستون أو عوامل النسخ ، حيث ترتبط هذه البروتينات بشكل مباشر وقوي بالحمض النووي1. قد يواجه CUT&Tag مشاكل عند تنميط العوامل المرتبطة بالكروماتين التي لا تربط الحمض النووي مباشرة وتظهر تقاربا ضعيفا مع الكروماتين. قد تؤدي خطوات الغسيل عالية الملح في CUT&Tag إلى تجريد العوامل المرتبطة بالكروماتين ولا تسبب أي إشارات في الإخراج النهائي. على الرغم من وجود حالات ناجحة حيث يمكن استخدام CUT&Tag لتعريف بعض البروتينات غير الهستونية / غير النسخية9 ، ما زلنا نوصي ب CUT &RUN عبر CUT&Tag لتعريف البروتينات المرتبطة بالكروماتين المرتبطة بشكل ضعيف.

بعد بلوغ الثدييات مرحلة البلوغ، لا تزال أنسجة عضلاتها الهيكلية تحتوي على خلايا جذعية عضلية. أثناء إصابة العضلات ، يمكن تنشيط هذه الخلايا الجذعية والخضوع لتوسيع عدد الخلايا والتمايز لتجديد ألياف العضلات التالفة10. تعرف هذه الخلايا الجذعية باسم الخلايا الجذعية / الساتلية العضلية (MuSCs). بعد عزل MuSCs من أو تنشيطها مرة واحدة عن طريق إصابة العضلات ، فإنها تبدأ في التكاثر وتصبح الأرومات العضلية.

للحصول على MuSCs من هضم العضلات الهيكلية للفأر ، غالبا ما تستخدم علامات سطح MuSC مثل Vcam1 (Cd106) و Cd34 و α7-integrin (Itga7) بشكل فردي أو في مجموعات لإثراء MuSCs أثناء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) 11. لقد ثبت أن Cd31- / Cd45- / Sca1- / Vcam1 + هو على الأرجح أفضل مزيج علامات للحصول على >95٪ MuSCsنقية 12. يمكن ل FACS عزل MuSCs النقية مباشرة بعد هضم العضلات الطازجة. ومع ذلك ، إذا كان التصميم التجريبي لا يتطلب MuSCs نقية عند عزلها مباشرة ، فإن الطلاء المسبق يكون أكثر فعالية من حيث التكلفة من FACS للحصول على >90٪ من الخلايا العضلية النقية (ذرية MuSC).

لا تتكاثر MuSCs المعزولة حديثا من الفئران بكفاءة في وسائط Ham's F10 المكملة بمصل الأبقار الجنيني (FBS). لتوسيع عدد خلايا MuSCs بشكل أفضل والحصول على عدد كاف من الخلايا العضلية ، يجب استخدام مصل نمو الأبقار (BGS) بدلا من FBS. ومع ذلك ، إذا لم يكن BGS متاحا ، فيمكن خلط وسائط Ham's F10 الكاملة (التي تحتوي على حوالي 20٪ FBS) مع حجم متساو من الوسائط الشرطية للخلايا التائية لتعزيز توسع الخلايا العضلية13 بشكل كبير. لذلك ، سيصف هذا البروتوكول أيضا تحضير وسائط MuSC المكيفة لوسائط الخلايا التائية.

الأهم من ذلك ، يوفر هذا البروتوكول مثالا كاملا على إجراء فحوصات H3K4me1 CUT &Tag على الأرومات العضلية للفأر المعزولة من عضلات الأطراف الخلفية للفأر. يرجى ملاحظة أن هذا البروتوكول ينطبق أيضا على أنواع الخلايا الأخرى وعلامات الهستون ومتغيرات الهستون ، ويحتاج القراء فقط إلى تحسين أرقام الخلايا أو كميات الأجسام المضادة لحالاتهم بناء على إثراء علامات أو متغيرات هيستون المحددة التي يدرسونها.

من أجل استخدامها في CUT&Tag أو CUT&RUN، يجب دمج Tn5 أو MNase مع البروتين A أو البروتين G لصنع pA-Tn5 أو pG-Tn5 أو pA-MNase أو pG-MNase. على ما يبدو ، يمكن دمج كل من البروتين A والبروتين G على هذه الإنزيمات في نفس الوقت لتوليد pA / G-Tn5 أو pA / G-MNase. يظهر البروتين A والبروتين G تقاربات تفاضلية مع IgGs من أنواع مختلفة. ومن ثم، فإن دمج البروتين A والبروتين G تماما في الإنزيم يمكن أن يتغلب على هذه المشكلة ويجعل الإنزيم متوافقا مع الأجسام المضادة من أنواع متعددة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق المعروضة في هذه المخطوطة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في مختبر قوانغتشو. تم إيواء الفئران المستخدمة لتوليد النتائج التمثيلية لهذه المخطوطة وصيانتها وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في مختبر قوانغتشو.

1. عزل الأرومة العضلية من عضلات الفأر الخلفية (مثال على استخدام 1 ماوس)

  1. تمييع حمض الخليك الجليدي مع ddH2O إلى 0.02 M والأوتوكلاف عليه.
  2. تمييع الكولاجين (من ذيل الفئران) إلى 0.1 ملغ / مل مع 0.02 M حمض الخليك.
  3. أضف محلول الكولاجين هذا إلى أطباق الاستزراع لتغطية قاع الطبق في حاضنة خلايا 37 درجة مئوية طوال الليل.
  4. قبل الاستخدام ، قم بإزالة محلول الكولاجين وغسل الطبق مرتين باستخدام 1x PBS. يمكن إعادة استخدام محلول الكولاجين لمدة 8-10 مرات.
  5. التضحية بفأر عمره 8-12 أسبوعا. (الفئران المسنة لديها غلة ضعيفة من MuSCs و myoblasts.)
  6. عزل ووضع جميع عضلات الأطراف الخلفية من الماوس في طبق 10 سم.
  7. استخدم 1x PBS (مع البنسلين / الستربتومايسين) لشطف العضلات 4 مرات. بعد كل شطف ، قم دائما بنقل العضلات إلى طبق جديد.
  8. بعد الشطف النهائي ، قم بإزالة برنامج تلفزيوني وفرم العضلات بالمقص.
  9. أضف 6 مل من 1x PBS تحتوي على dispase II (1.1 U / mL) وكولاجيناز II (830 U / mL) لهضم العضلات المفرومة ، ويجب أن يستمر الهضم لمدة ~ 1.5 ساعة.
  10. لإجراء عملية الهضم ، انقل العضلات المفرومة إلى أنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية أو اترك العضلات المفرومة مباشرة داخل الطبق وضعها في حاضنة خلايا CO2 37 درجة مئوية.
  11. في حالة استخدام حاضنة الخلايا للهضم ، هز الطبق كل 15-30 دقيقة لخلط الهضم جيدا.
    ملاحظة: يجب تصنيع Dispase II أولا كمخزون 11 وحدة / مل مع وسائط DMEM (بدون مصل) ، ويجب صنع كولاجيناز II كمخزون 10000 وحدة / مل مع 1x PBS.
  12. عند اكتمال عملية الهضم ، استخدم ماصة بلاستيكية سعة 10 مل لطرد الأنسجة المهضومة لأعلى ولأسفل عدة مرات لتجانس خليط الهضم جيدا.
  13. أضف 10 مل من وسائط نمو MuSC / Myoblast لإبطاء عملية الهضم. يمكن العثور على تفاصيل حول تحضير وسائط نمو MuSC / Myoblast في القسم 2.
  14. قم بتشغيل الخليط من خلال مصفاة 70 ميكرومتر. استخدم 1x PBS لشطف لوحة الهضم وتشغيل هذا البرنامج الرسولي من خلال المصفاة أيضا ، من أجل جمع كل الخلايا في لوحة الهضم.
  15. أجهزة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 10 دقائق وتجاهل طاف مع فراغ.
  16. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 20 مل من 1x PBS وقم بتشغيل الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر.
  17. أجهزة الطرد المركزي في 350 × غرام لمدة 5 دقائق وإزالة طاف مع فراغ.
  18. استخدم 20 مل من وسائط نمو MuSC / Myoblast لإعادة تعليق الخلايا وزرع الخلايا في طبق بلاستيكي عادي مقاس 10 سم. لا يمكن أن تلتصق MuSCs بقاع اللوحة خلال هذا الوقت وستظل عائمة في الغالب في الوسائط.
    ملاحظة: هذا هو الطلاء المسبق الأول على الألواح البلاستيكية.
  19. بعد 1.5 ساعة ، هز الطبق لفترة وجيزة وانقل السائل إلى طبقين مغلفين بالكولاجين مقاس 10 سم ، يحتوي كل طبق على 10 مل من الثقافة. الآن ، سوف تلتصق MuSCs وتنمو على الألواح المطلية بالكولاجين. تغيير الوسائط بعد 2 أيام. يتم تحضير الألواح المطلية بالكولاجين كما في الخطوات 1-4 من هذا القسم.
  20. بعد يوم آخر ، قم بتمرير الخلايا: قم بإزالة الوسائط ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS ، وقم بإضفاء الطابع البرمجي على الخلايا.
  21. استخدم وسائط نمو MuSC / Myoblast لطرد الخلايا من الألواح ، ونقل الخلايا إلى لوحة بلاستيكية جديدة ، واحتضانها في حاضنة الخلايا لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: هذا هو الطلاء المسبق الثاني على الألواح البلاستيكية.
  22. صب الثقافة في لوحة بلاستيكية جديدة واحتضانها في حاضنة الخلايا لمدة 20 دقيقة أخرى.
    ملاحظة: هذا هو الطلاء المسبق الثالث على الألواح البلاستيكية.
  23. ثم قسم المادة الطافية في الطبق إلى 8 أطباق مغطاة بالكولاجين مقاس 10 سم لزراعة الخلايا. نسبة المرور هنا هي 2: 8 (1: 4). بعد ثلاث مرات من الطلاء المسبق الموصوف أعلاه ، يمكن أن تصل الخلايا العضلية إلى أكثر من 90٪ نقية. لذلك ، بعد هذه النقطة ، ليست هناك حاجة إلى اللوحة المسبقة عند مرور المزيد من الخلايا العضلية.

2. تحضير وسائط نمو MuSC / Myoblast (مثال على التحضير من 5 فئران)

  1. التضحية ب 5 فئران برية شابة وصحية ، وعزل الطحال ، وشطف الطحال مرة واحدة باستخدام 1x PBS (مع البنسلين / الستربتومايسين).
  2. استخدم المقص لإزالة الأجزاء / البقع الداكنة على الطحال ، إن وجدت. تخلص من الطحال إذا تحول معظمه إلى اللون الأسود.
  3. ضع كل الطحال ال 5 في مصفاة 40 ميكرومتر أعلى أنبوب سعة 50 مل.
  4. افتح عبوة حقنة معقمة سعة 1 مل ، واسحب المكبس ، وتخلص من البرميل.
  5. في مصفاة 40 ميكرومتر ، أمسك السدادة المطاطية واستخدم مسند الإبهام للمكبس لطحن وفصل أنسجة الطحال إلى خلايا مفردة. احرص على عدم لمس وتلويث بقية الإبهام في المكبس عند تمزيق عبوة المحقنة.
  6. أثناء طحن الطحال ، استخدم أحيانا 1x PBS لغسل خلايا الطحال المنفصلة في أنبوب 50 مل أسفل المصفاة.
  7. بعد أن يتم طرد جميع خلايا الطحال في أنبوب سعة 50 مل من خلال المصفاة ، قم بطرد الأنبوب عند 500 × جم لمدة 10 دقائق.
  8. استخدم 1 مل من 1x مخزن مؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء لإعادة تعليق الحبيبات. تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة ~ 1 دقيقة.
    ملاحظة: يحتوي 10x محلول تحلل خلايا الدم الحمراء على 155 مللي متر NH4Cl و 10 mM NaHCO3 و 1 mM EDTA ملح ثنائي الصوديوم في ddH2O. قم بالتصفية للتعقيم ، ولا تقم بالأوتوكلاف. تمييع مع ddH2O إلى 1x قبل الاستخدام.
  9. املأ أنبوب 50 مل ب 1x PBS لوقف عملية تحلل خلايا الدم الحمراء.
  10. قم بتصفية تعليق الخلية مرة أخرى باستخدام مصفاة 40 ميكرومتر ، ثم جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق.
  11. أعد تعليق الخلايا التي تحتوي على 2 مل من الوسائط الكاملة RPMI-1640 (وسائط RPMI-1640 مع 10٪ FBS والبنسلين / الستربتومايسين) مع سحب لطيف للغاية.
  12. أضف المزيد من الوسائط الكاملة RPMI-1640 إلى الأنبوب واخلطها جيدا. قم بتوزيع تعليق الخلية في عشر قوارير ثقافة T75. يجب أن يكون حجم الاستزراع النهائي في كل قارورة استزراع T75 20 مل.
  13. أضف 10 ميكرولتر من مخزون Concanavalin-A في كل قارورة ثقافة T75 واخلطها جيدا. ينشط Concanavalin-A تكاثر الخلايا التائية.
    ملاحظة: مخزون Concanavalin-A هو 4 مجم / مل ويتم تحضيره عن طريق إذابة Concanavalin-A في 1x PBS. يتم استخدام Concanavalin-A نفسه هنا ، ولا تخلط بينه وبين حبات Concanavalin-A المستخدمة في فحوصات CUT &Tag لاحقا.
  14. بعد 48 ساعة ، استكمل كل قارورة T75 ب 20 مل أخرى من الوسائط الكاملة RPMI-1640 بحيث يصل الحجم الإجمالي إلى 40 مل.
  15. بعد 24 ساعة أخرى ، اجمع كل الثقافة في كل قارورة T75 وأجهزة طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 3 دقائق.
  16. المادة الطافية هي وسائط شرطية للخلايا التائية ويمكن تخزينها في -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين. تخلص من كريات خلايا الطحال. قبل الاستخدام ، قم بإذابة الوسائط الشرطية للخلايا التائية وقم بتعقيم الوسائط باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
  17. لجعل وسائط Ham's F10 كاملة ، أضف 100 مل من FBS ، و 300 ميكرولتر من مخزون bFGF ، و 6 مل من البنسلين / الستربتومايسين إلى 500 مل من وسائط F10 من Ham.
    ملاحظة: مخزون bFGF هو 5 ميكروغرام / مل ويتم تحضيره عن طريق إذابة bFGF في وسائط Ham F10.
  18. امزج وسائط Ham's F10 الكاملة مع الوسائط الشرطية للخلايا التائية المفلترة الموضحة أعلاه بنسبة 1: 1 لإنشاء وسائط نمو MuSC / Myoblast.

3. CUT &Tag مع الأرومات العضلية (مثال على 3 تفاعلات CUT& Tag)

  1. تحضير الكواشف الرئيسية
    1. تنقية pA / G-Tn5 transposase في المنزل من الثقافة البكتيرية باستخدام الطريقةالمنشورة 14. يصل هذا الإنزيم إلى صورته الوظيفية فقط حتى يتم تركيبه باستخدام محولات الحمض النووي (DNA) التي تصنع المكتبة. الأهم من ذلك ، أن pA / G-Tn5 متاح تجاريا من العديد من المصادر.
    2. يتم عرض oligos لصنع محولات في الجدول 1. على وجه التحديد ، صلب Oligo-Rev مع Oligo-A و Oligo-B ، على التوالي ، لصنع محول مزدوج تقطعت بهم السبل A ومحول B وفقا لذلك. يمكن العثور على تفاصيل التلدين لصنع المحولات في مكان آخر14.
    3. احتضان المحول-A والمحول-B مع ترانسبوزاز pA / G-Tn5 في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2 ساعة. بعد ذلك ، سيأخذ هذا الترانسبوزاز شكله الوظيفي. في الأقسام التالية من هذه المخطوطة ، سيطلق على الشكل الوظيفي ل pA / G-Tn5 اسم pA / G-Tn5a.
      ملاحظة: إذا تم شراء pA / G-Tn5 بدلا من صنعه داخليا ، فتأكد من توضيح ما إذا كان العنصر الذي تم شراؤه مثبتا على pA / G-Tn5 مثبتا بمحولات (بمعنى آخر ، جاهز للاستخدام) أم أنه مجرد إنزيم pA / G-Tn5 نفسه. إذا كان الإنزيم فقط ، فقم بإعداد المحولين الموصوفين أعلاه وقم بتركيبهما على pA / G-Tn5 قبل استخدام هذا الإنزيم أخيرا ل CUT&Tag.
    4. بالنسبة لوصفات المخزن المؤقت للربط ، والمخزن المؤقت للغسيل ، والمخزن المؤقت للحفر والغسيل ، والمخزن المؤقت 300-Dig ، والمخزن المؤقت لوضع العلامات ، يمكن للقراء أيضا الرجوع إلى Kaya-Okur et al.1.
    5. قم بإعداد المخزن المؤقت للربط ، والذي يحتوي على 20 mM HEPES pH 7.5 و 10 mM KCl و 1 mM CaCl2 و 1 mM MnCl2.
    6. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل ، والذي يحتوي على 20 mM HEPES pH 7.5 ، 150 mM NaCl ، 0.5 mM Spermidine ، و 1x كوكتيل مثبط للبروتييز.
    7. اصنع الديجيتونين كمخزن مركز في DMSO ، ثم قم بإعداد مخزن Dig-wash عن طريق إضافة ديجيتونين إلى مخزن الغسيل إلى تركيز 0.5 مجم / مل.
    8. قم بإعداد المخزن المؤقت للأجسام المضادة عن طريق إضافة EDTA إلى تركيز 2 mM و BSA إلى تركيز 0.1٪ ، في المخزن المؤقت Dig-wash.
    9. قم بإعداد مخزن مؤقت 300-Dig يحتوي على 20 mM HEPES pH 7.5 ، 300 mM NaCl ، 0.5 mM Spermidine ، 1x كوكتيل مثبط للبروتياز ، و 0.1-0.5 مجم / مل ديجيتونين.
    10. قم بإعداد المخزن المؤقت Tagmentation عن طريق استكمال المخزن المؤقت 300-Dig ب 10 mM MgCl2. يمكن ل MgCl2 تنشيط النشاط الأنزيمي ل pA / G-Tn5a.
      ملاحظة: يتم توفير معلومات عن المواد الأخرى في ملف جدول المواد .
  2. تفعيل حبة كونكانافالين - أ
    1. امزج 30 ميكرولتر من حبات Concanavalin-A (10 ميكرولتر لكل تفاعل) في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. اقلب عدة مرات لخلط جيدا. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي. بعد أن يصبح السائل صافيا ، قم بإزالة المادة الطافية.
    2. قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي ، وأضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط في الأنبوب ، واخلطه جيدا ، وانقسم بالتساوي إلى 3 أنابيب من شريط أنبوب 8-PCR. قم بتعيين كل أنبوب بتفاعل CUT&Tag واحد.
    3. ضع شريط أنبوب 8-PCR على رف مغناطيسي وانتظر حتى يصبح السائل صافيا.
    4. نضح الطافع وإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي. أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط في كل أنبوب واخلطه جيدا. ضع الخرزات المحضرة على الثلج أو على حرارة 4 درجات مئوية حتى تصبح الخلايا جاهزة للمتابعة.
  3. ربط الخلايا على حبات كونكانافالين-أ
    1. قم بالتريبسين بالخلايا العضلية للفأر المستزرع من الألواح ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام RT 1x PBS وأعد تعليق الخلايا في النهاية المخزن المؤقت للغسيل في RT. تجنب الإفراط في التربسين ، لأن هذا يمكن أن يضر بتقارب غشاء الخلية مع حبات Concanavalin-A.
    2. اضبط كثافة الخلية إلى حوالي 7 × 105 خلايا / مل في المخزن المؤقت Wash بحيث يحتوي 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على ما يقرب من 70000 خلية ، وهو ما يكفي لتفاعل CUT&Tag واحد.
    3. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل أنبوب من شريط أنبوب 8-PCR ، والذي يحتوي بالفعل على 10 ميكرولتر من حبات Concanavalin-A المحضرة. تخلط جيدا وتحتضن على شاكر "حركة متأرجحة" لمدة 10 دقائق في RT.
    4. ضع شريط أنبوب 8-PCR على رف مغناطيسي. انتظر حتى يزول ، وقم بإزالة المادة الطافية.
    5. لتقييم ما إذا كانت حبات Concanavalin-A قد عزلت الخلايا بكفاءة ، تحقق من المادة الطافية تحت المجهر لمعرفة عدد الخلايا المتبقية في المادة الطافية. بعد خطوة ربط حبة Concanavalin-A ، يجب ملاحظة عدد قليل جدا من الخلايا أو عدم وجودها في المادة الطافية.
  4. احتضان الخلايا بجسم مضاد أولي
    1. لكل عينة ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد H3K4me1 إلى 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة وأضف الجسم المضاد المخفف إلى كل أنبوب عينة. امزج الخرزات جيدا مع الجسم المضاد المخفف عن طريق قلب الأنابيب عدة مرات. ضع العينات على شاكر "حركة الأرجوحة" لاحتضانها عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: كما ذكر الدكتور ستيفن هينيكوف1 ، لم يكن من الضروري استخدام عنصر تحكم سلبي IgG في جميع فحوصات CUT &Tag. بالمقارنة مع ChIPs ، تأتي فحوصات CUT &Tag مع إشارة خلفية أقل بكثير أو بدون إشارة خلفية. لذلك ، فإن استخدام IgG لإجراء فحص CUT &Tag "للتحكم السلبي" لا يقدم أي معلومات مفيدة. في المقابل ، يعد استخدام جسم مضاد تم التحقق من صحته من قبل CUT &Tag لإجراء تحكم إيجابي أمرا مهما لتقييم ما إذا كان اختبار CUT&Tag قد نجح.
  5. احتضان الخلايا بجسم مضاد ثانوي
    1. في صباح اليوم التالي ، ضع العينات على الرف المغناطيسي وانتظر حتى تصبح العينات واضحة.
    2. إزالة الطاف، وهو الجسم المضاد الأساسي. ليست هناك حاجة لغسل الخرز. أضف مباشرة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة (1: 100) إلى كل أنبوب عينة.
      ملاحظة: يتم تخفيف الجسم المضاد الثانوي باستخدام المخزن المؤقت Dig-wash بنسبة 1: 100. للسماح بالتعرف على pA / G-Tn5a بشكل أكثر كفاءة ، لا ينبغي اقتران الأجسام المضادة الثانوية مع أي جزيئات أو مجموعات مثل HRP أو البيوتين أو الفلوروفور.
    3. تخلط جيدا واحتضان على شاكر "الحركة المتأرجحة" في RT لمدة 1 ساعة.
    4. ضع العينات مرة أخرى على الرف المغناطيسي ، وانتظر حتى تنظف العينات ، وتخلص من المادة الطافية.
    5. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحفر والغسيل في كل أنبوب واقلبه عدة مرات لغسل الأجسام المضادة الزائدة.
    6. ضعه مرة أخرى على الرف المغناطيسي ، وانتظر حتى يزول ، وقم بإزالة المادة الطافية. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين لإزالة الأجسام المضادة الزائدة غير المنضمة تماما.
  6. احتضان الخلايا ب pA / G-Tn5a
    1. بعد الغسيل الأخير ، ضع العينات على الرف المغناطيسي ، وانتظر حتى تصبح العينات واضحة ، وقم بإزالة كل السائل الموجود في الأنبوب. لكل أنبوب عينة ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت 300-Dig الذي يحتوي على pA / G-Tn5a عند 0.04 ميكرومتر. تخلط جيدا وتحتضن على شاكر الحركة المتأرجحة لمدة 1 ساعة في RT.
    2. وضعت على الرف المغناطيسي. انتظر حتى تنظف العينات وأزل المادة الطافية.
    3. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت 300-Dig في كل عينة ، واخلطها جيدا ، وضعها على الخلاط لغسل العينة لمدة 3 دقائق في RT.
    4. وضعت على الرف المغناطيسي. انتظر حتى تنظف العينات وأزل المادة الطافية. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين لإزالة pA / G-Tn5a الزائد وخفض الخلفية.
  7. انشقاق ووسم الجينوم
    1. بعد الغسيل الأخير ، ضع العينات على الرف المغناطيسي وقم بسحب السائل تماما من الأنبوب. لكل عينة ، أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعلامات. تخلط جيدا وتحتضن في جهاز PCR على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. لا تستخدم وظيفة تسخين الغطاء لجهاز PCR.
      ملاحظة: اختياريا ، نظرا لتآكل المواد أثناء خطوة تنقية الحمض النووي الجينومية التالية ، يمكن إضافة بعض الحمض النووي المرتفع إلى المخزن المؤقت لوضع العلامات بحيث يظهر الارتفاع في نتائج التسلسل النهائية ويمكن استخدامه لتطبيع البيانات. يمكن العثور على طريقة تحضير واستخدام الحمض النووي السنبلة في مكان آخر14.
  8. تنقية الحمض النووي الجينومية الكلية
    1. بعد وضع العلامات ، أضف 150 ميكرولتر أخرى من المخزن المؤقت للعلامات لكل عينة. الحجم الإجمالي الآن 200 ميكرولتر.
    2. ثم ، لكل عينة ، أضف 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA ، و 3 ميكرولتر من 10٪ SDS ، و 2.5 ميكرولتر من 20 مجم / مل Proteinase K. Vortex لخلط جيد واحتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    3. ماصة كل عينة في 200 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل ودوامة لمدة 10 ثوان. أجهزة طرد مركزي عند 18000 × جم لمدة 5 دقائق. انقل الطبقة العليا إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
    4. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم في كل أنبوب ودوامة لمدة 10 ثوان. أجهزة طرد مركزي عند 18000 × جم لمدة 5 دقائق.
    5. نضح الطبقة العليا في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل. ثم ، لكل عينة ، أضف 550 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ لترسيب الحمض النووي عند -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. لتصور حبيبات الحمض النووي بشكل أفضل ، أضف 1 ميكرولتر من 20 مجم / مل جليكوجين.
    6. أجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة (>18000 × جم) لمدة 15 دقيقة لتكوير الحمض النووي.
    7. اسكب المادة الطافية بعناية ، واغسل حبيبات الجليكوجين / الحمض النووي بنسبة 75٪ من الإيثانول مرة واحدة ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق.
    8. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 75٪ وأعد تعليق حبيبات الجليكوجين / الحمض النووي ب 21 ميكرولتر من ddH2O.
  9. إعداد المكتبة وتسلسلها
    1. قم بإعداد PCR للمكتبة. لفهرسة العينات المراد تسلسلها معا ، استخدم برايمر N7XX Illumina مختلفا لكل عينة وبرايمر N5XX Illumina عالمي. في حالة فهرسة أكثر من 12 عينة ، ستكون هناك حاجة أيضا إلى مواد أولية مختلفة من N5XX Illumina. توفر Illumina اثني عشر بادئا N7XX وثمانية بادئات N5XX ، وبالتالي فإن العدد الإجمالي ل N7XX مع مجموعات N5XX هو 12 × 8 = 96. يظهر إعداد تفاعل تفاعل PCR في الجدول 2.
    2. حدد تقريبا رقم دورة PCR في إعداد المكتبة PCR من خلال رقم الخلية المستخدم في اختبار CUT &Tag. عادة ، بالنسبة لفحص CUT &Tag باستخدام 50,000-100,000 خلية ، تكون 9-12 دورة كافية تماما ، وقد تتطلب أعداد الخلايا بين 10,000-50,000 ما يصل إلى 14 دورة. يتم عرض برنامج PCR في الجدول 3.
      ملاحظة: بالنسبة لمعظم فحوصات CUT &Tag ، إذا كان الجسم المضاد يعمل بشكل صحيح ، فيجب أن ينشئ رقم دورة PCR بين 9-14 دائما مكتبة مفيدة للتسلسل. عادة ما تكون المكتبة الجيدة 10-50 نانوغرام / ميكرولتر (يحددها فحص Qubit) في التركيز و 20-30 ميكرولتر في الحجم. على العكس من ذلك ، إذا لم يعمل الجسم المضاد بكفاءة وعلى وجه التحديد ، فإن مجرد زيادة عدد الدورة لا يمكن أن ينقذ التجارب. لا تفيد أرقام الدورات المفرطة النتائج على الإطلاق وبدلا من ذلك تقدم المزيد من تكرارات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما سيعقد تحليل البيانات لاحقا.
    3. استخدم بعض حبات تنقية / اختيار حجم الحمض النووي المتاحة تجاريا لتنقية الحمض النووي للمكتبة واختيار الحمض النووي بالأحجام المرغوبة.
    4. قم بتخفيف حصة صغيرة من المكتبة المنقاة بالماء واستخدمها في qPCR مع البادئات الخاصة بالموقع للتحقق من التخصيب كما هو الحال في تجارب ChIP-qPCR. قبل تسلسل المكتبة ، يمكن أن يساعد ذلك في تحديد ما إذا كان CUT&Tag قد نجح أم لا.
    5. إجراء التسلسل وتحليل البيانات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: تتوفر مجموعات CUT &Tag تجاريا من عدد قليل من الشركات ، ويمكن العثور على مثال واحد في ملف جدول المواد .

النتائج

قبل ربط الخلايا بخرز Concanavalin-A ، تحقق من تعليق الخلية تحت المجهر. وفقا لذلك ، بعد احتضان الخلايا باستخدام حبات Concanavalin-A ، ضع أنابيب العينة على الرف المغناطيسي ، ويجب ملاحظة المادة الطافية مرة أخرى باستخدام المجهر. هذا لتقييم مدى كفاءة التقاط الخلايا بواسطة حبات Concanavalin-A. يجب أن يبدو المخزن ال?...

Discussion

يعتمد رقم الخلية المحدد المطلوب في تفاعل CUT&Tag معين تماما على إثراء علامات / متغيرات الهستون أو البروتينات المرتبطة بالكروماتين التي سيتم اختبارها. عادة بالنسبة لعلامات الهستون المخصبة جدا مثل H3K4me1 و H3K4me3 و H3K27ac وما إلى ذلك ، فإن 25000-50000 عضلي كافية تماما لتفاعل CUT&Tag واحد. ومع ذلك ، قد تتطلب بعض ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDA16020400 إلى PH) ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32170804 إلى PH).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
bFGFR&D Systems233-FB-025
CollagenCorning354236
Collagenase IIWorthingtonLS004177
Concanavalin-ASigma-AldrichC5275
Concanavalin-A beadsBangs LaboratoriesBP531
DigitoninSigma-Aldrich300410
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Fetal bovine serumHycloneSH30396.03
H3K4me1 antibody abcamab8895
Ham's F10 mediaThermo Fisher Scientific11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina VazymeTD903This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubesQualityardQYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripesAnosun MagneticCLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNEBM0541LFor library-making PCR reaction
pA-Tn5VazymeS603-01Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich5056489001
Proteinase KBeyotimeST535-100mg
RPMI-1640 mediaThermo Fisher ScientificC11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)Antibodies-onlineABIN101961
SpermidineSigma-AldrichS2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina VazymeTD202This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers 
VAHTS DNA Clean Beads VazymeN411Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size

References

  1. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).
  2. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLife. 4, e09225 (2015).
  3. Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
  4. Policastro, R. A., Zentner, G. E. Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites. Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).
  5. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  6. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, e21856 (2017).
  7. Mezger, A., et al. High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution. Nat Commun. 9, 3647 (2018).
  8. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8, 14049 (2017).
  9. Nakka, K., et al. JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment. Science. 377 (6606), 666-669 (2022).
  10. Fu, X., Wang, H., Hu, P. Stem cell activation in skeletal muscle regeneration. Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).
  11. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skelet Muscle. 6, 35 (2016).
  12. Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).
  13. Fu, X., et al. Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion. Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).
  14. Li, Y., et al. Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag. STAR Protoc. 2 (3), 100751 (2021).
  15. Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).
  16. Wardle, F. C. Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod. J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).
  17. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  18. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  19. Faralli, H., et al. UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration. J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).
  20. Yang, J. H., et al. Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).
  21. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CUT Tag ChIP ChIP ChIP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved