마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tagmentation) 분석 사용

요약

후성유전학 분야를 처음 접하는 연구자들은 CUT&Tag가 ChIP 분석에 대한 훨씬 더 쉬운 대안임을 알게 될 것입니다. CUT&Tag는 희귀 및 원발성 세포 집단에 대한 후성유전학 연구에 큰 도움을 주어 극소수의 세포에서 고품질 데이터를 생성했습니다. 이 프로토콜은 마우스 뒷다리 근육에서 분리된 마우스 근아세포에 대해 H3K4me1 CUT&Tag 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

초록

이 프로토콜 논문은 새로운 연구자에게 CUT&Tagation(Cleavage Under Targets and Tagmentation)을 사용하여 염색질 결합 인자, 히스톤 마크 및 히스톤 변이체의 게놈 위치를 프로파일링하는 방법에 대한 전체 세부 정보를 제공하는 것을 목표로 합니다. CUT&Tag 프로토콜은 마우스 근아세포 및 갓 분리한 근육 줄기 세포(MuSC)와 매우 잘 작동합니다. 그들은 세포가 Concanavalin-A 비드로 고정될 수 있는 한 많은 다른 세포 유형에 쉽게 적용될 수 있습니다. CUT&Tag와 비교했을 때, 염색질 면역침전(ChIP) 어세이는 시간이 많이 걸리는 실험입니다. ChIP 분석은 염색질 물질을 면역침전에 사용하기 전에 염색질의 전처리가 필요합니다. 가교 ChIP (X-ChIP)에서 염색질의 전처리에는 염색질을 단편화하기위한 교차 결합 및 초음파 처리가 포함됩니다. 천연 ChIP(N-ChIP)의 경우, 단편화된 염색질은 일반적으로 미세구균 뉴클레아제(MNase) 분해에 의해 달성됩니다. 초음파 처리와 MNase 분해는 모두 ChIP 실험에 약간의 편향을 도입합니다. CUT&Tag 분석은 ChIP에 비해 더 적은 단계 내에 완료할 수 있고 훨씬 더 적은 세포를 필요로 하지만 다양한 게놈 위치에서 전사 인자 또는 히스톤 표시에 대한 보다 편향되지 않은 정보를 제공합니다. CUT&Tag는 최소 5,000개의 셀로 작동할 수 있습니다. ChIP보다 감도가 높고 배경 신호가 낮기 때문에 연구자들은 염기서열분석 후 수백만 번의 판독만으로도 신뢰할 수 있는 피크 데이터를 얻을 수 있을 것으로 기대할 수 있습니다.

서문

CUT&Tag 분석은 ChIP¹의 몇 가지 명백한 결함을 보완하기 위해 발명되었습니다. ChIP의 두 가지 주요 단점은 1) 염색질을 단편화할 때 발생하는 바이어스와 2) 낮은 세포 수로 작업할 수 없다는 것입니다. X-ChIP 분석은 염색질 단편을 얻기 위해 초음파 처리 또는 MNase 분해에 의존하는 반면, N-ChIP는 주로 MNase 분해를 사용하여 뉴클레오솜을 얻습니다. 초음파 처리는 프로모터 영역²와 같은 이완 된 염색질 위치에 대한 편향을 보이며, 명백하게, MNase 소화는 또한 이완 된 염색질 섬유에서보다 효율적으로 작동합니다. 더욱이, 일부에서는 MNase 분해가 DNA 염기서열 의존성 편향(DNA sequence-dependent bias)을 나타낸다고 보고했다³. 따라서 ChIP 분석의 투입 준비 단계에서 모든 종류의 게놈 위치에서 완벽하게 무작위로 염색질 단편을 얻는 것은 불가능합니다. 또한 ChIP 분석은 일반적으로 CUT&Tag에 비해 더 높은 배경 신호를 생성하며 피크가^1,4,5인 위치를 강조하기 위해 CUT&Tag보다 10배 이상 더 많은 판독이 필요합니다. 이것은 ChIP 실험이 CUT&Tag보다 엄청나게 더 많은 세포로 시작해야 하는 이유를 설명합니다. 이것은 세포주를 연구할 때 매우 높은 세포 수를 달성하기 위해 반복적으로 통과할 수 있기 때문에 문제가 되지 않습니다. 그러나 ChIP 분석은 희귀하거나 귀중한 일차 세포 집단을 연구하기 위한 강력한 후성유전학적 도구는 아니지만, 일차 세포는 분명히 더 실용적이고 의학적인 의미를 가지고 있습니다.

길고 복잡한 ChIP 절차로 인해 일부 연구자들은 이 기법을 배우거나 사용하는 데 어려움을 겪지만, 사람들은 면역세포화학(ICC) 또는 면역형광(IF)과 같은 더 쉬운 분석에 더 편안함을 느낍니다. CUT&Tag 분석은 기본적으로 ICC 및 IF 실험 프로세스와 유사하지만 시험관에서만 수행됩니다. CUT&Tag는 처음부터 단편화된 염색질이 필요하지 않으며, 대신 항체 결합을 위해 게놈이 온전해야^{합니다 1}. ChIP 실험의 첫날, 연구자들은 일반적으로 짧은 염색질 조각을 항체 비드 ^4,5와 혼합하기 전에 초음파 처리 또는 MNase 소화를 통해 핵에서 단편화된 염색질을 준비하는 데 최대 4시간을 소비합니다. 이와는 대조적으로, CUT&Tag 절차의 첫날 작업량은 세포를 Concanavalin-A beads에 고정시킨 다음 cell-bead에 1차 항체를 추가하는 것입니다. ~40분만 필요합니다¹.

Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease(CUT&RUN)는 CUT&Tag의 중요한 대안이라는 점을 언급할 가치가 있습니다. CUT&RUN은 CUT&TAG와 유사한 작동 메커니즘을 기반으로 설립되었습니다. CUT&Tag에서 항체는 효소가 각각 염색질 조각을 잘라내고 동시에 라이브러리 제작 어댑터로 태그를 붙일 모든 위치로 pA/G-Tn5 전이효소를 안내하는 반면, CUT&RUN에서 pA/G-Tn5의 역할은 pA/G-MNase에 의해 수행되며 pA/G-MNase는 작업⁶의 절단 부분만 수행합니다. 그러므로, CUT&Tag와 비교하여, CUT&RUN은 라이브러리 제작 어댑터를 pA/G-MNase-단편화된 DNA 조각 ^7,8에 붙이는 추가 단계를 필요로 한다. CUT&Tag와 CUT&RUN의 높은 유사성으로 인해 CUT&TAG에 익숙한 연구원은 CUT&RUN을 능숙하게 수행하는 데 쉽게 적응할 수 있습니다. 그러나 CUT&Tag와 CUT&RUN 사이에는 몇 가지 사소한 차이점이 있다는 점에 유의해야 합니다. CUT&RUN 프로토콜은 일반적으로 세척 단계에서 물리적 농도의 염(~150mM)을 사용하는 반면, CUT&Tag에서 300-Dig 세척 버퍼는 염분 함량이 높습니다. 따라서 CUT&Tag는 히스톤 표시/변이체 또는 전사 인자를 프로파일링할 때 이러한 단백질이 DNA¹에 직접적이고 강력하게 결합하기 때문에 배경을 제어하는 데 좋습니다. CUT&Tag는 DNA에 직접 결합하지 않고 염색질에 약한 친화력을 보이는 염색질 관련 인자를 프로파일링할 때 문제가 발생할 수 있습니다. CUT&Tag의 고염 세척 단계는 염색질 관련 인자를 제거하고 최종 출력에서 신호를 일으키지 않을 수 있습니다. CUT&Tag를 사용하여 일부 비히스톤/비전사 인자^{단백질을 프로파일}링할 수 있는 성공적인 사례가 있지만9, 여전히 약하게 결합된 염색질 관련 단백질을 프로파일링하기 위해 CUT&Tag보다 CUT&RUN을 권장합니다.

포유류가 성체가 된 후에도 골격근 조직에는 여전히 근육 줄기 세포가 포함되어 있습니다. 근육 손상 동안, 이들 줄기세포는 활성화되고 손상된 근육 섬유를 재생하기 위해 세포 수 확장 및 분화를 거칠 수 있다¹⁰. 이러한 줄기 세포는 근육 줄기/위성 세포(MuSC)로 알려져 있습니다. MuSC가 동물에서 분리되거나 근육 손상에 의해 활성화된 후에는 증식하기 시작하여 근아세포가 됩니다.

생쥐 골격근 분해물에서 MuSC를 얻기 위해 Vcam1(Cd106), Cd34 및 α7-integrin(Itga7)과 같은 MuSC 표면 마커는 종종 개별적으로 또는 조합하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 중에 MuSC를 농축하는 데 사용됩니다¹¹. Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺ 는 아마도 >95% 순수 MuSCs를 얻기 위한 최상의 마커 조합일 것으로 나타났다¹². FACS는 신선한 근육이 소화된 직후 순수한 MuSC를 분리할 수 있습니다. 그러나 실험 설계에서 분리 바로 순수한 MuSC가 필요하지 않은 경우 >90% 순수 근아세포(MuSC 자손)를 얻기 위해 사전 도금이 FACS보다 비용 효율적입니다.

생쥐에서 갓 분리한 MuSC는 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Ham의 F10 배지에서 효율적으로 증식하지 않습니다. MuSC의 세포 수를 더 잘 확장하고 충분한 근아세포를 얻으려면 FBS 대신 소 성장 혈청(BGS)을 사용해야 합니다. 그러나, BGS를 이용할 수 없는 경우, Ham의 F10 전체 배지(약 20% FBS 포함)를 동일한 부피의 T-세포 조건부 배지와 혼합하여 근모세포 확장을 극적으로 촉진할 수 있다¹³. 따라서, 이 프로토콜은 또한 T-세포 배지 컨디셔닝된 MuSC 배지의 제조에 대해 설명할 것이다.

가장 중요한 것은 이 프로토콜이 쥐 뒷다리 근육에서 분리된 쥐 근아세포에 대해 H3K4me1 CUT&Tag 분석을 수행하는 완전한 예를 제공한다는 것입니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형과 히스톤 마크 및 히스톤 변이체에도 적용되며, 독자는 연구하는 특정 히스톤 마크 또는 변이체의 농축을 기반으로 자신의 사례에 대한 세포 수 또는 항체 양을 최적화하기만 하면 됩니다.

CUT&Tag 또는 CUT&RUN에 사용되려면 Tn5 또는 MNase를 단백질 A 또는 단백질 G와 융합하여 pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase 또는 pG-MNase를 만들어야 합니다. 명백하게, 단백질 A와 단백질 G는 둘 다 pA/G-Tn5 또는 pA/G-MNase를 생성하기 위하여 이 효소에 동시에 융합될 수 있습니다. 단백질 A와 단백질 G는 서로 다른 종의 IgG에 대한 차별적 친화력을 보여줍니다. 따라서 단백질 A와 단백질 G를 효소에 모두 융합하면 이 문제를 극복하고 효소가 여러 종의 항체와 호환되도록 만들 수 있습니다.

프로토콜

이 원고에 제시된 방법은 모두 광저우 실험실의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 이 원고의 대표 결과를 생성하는 데 사용된 마우스는 광저우 실험실의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 보관되고 유지되었습니다.

1. 마우스 뒷다리 근육에서 근모세포 분리(마우스 1마리 사용 예)

1. 빙초산을 ddH₂O로 0.02 M로 희석하고 고압 멸균한다.
2. 콜라겐(쥐 꼬리에서)을 0.02M 아세트산으로 0.1mg/mL로 희석합니다.
3. 이 콜라겐 용액을 배양 접시에 추가하여 37°C 세포 인큐베이터에서 하룻밤 동안 접시 바닥을 코팅합니다.
4. 사용하기 전에 콜라겐 용액을 제거하고 1x PBS로 접시를 두 번 씻으십시오. 콜라겐 용액은 8-10 회 재사용 할 수 있습니다.
5. 8-12주 된 쥐를 희생합니다. (늙은 쥐는 MuSC와 근아세포의 수율이 낮습니다.)
6. 쥐의 모든 뒷다리 근육을 분리하여 10cm 접시에 넣습니다.
7. 1x PBS(페니실린/스트렙토마이신 포함)를 사용하여 근육을 4번 헹굽니다. 헹굴 때마다 항상 근육을 새 접시에 옮기십시오.
8. 최종 헹굼 후 PBS를 제거하고 가위로 근육을 다집니다.
9. 다진 근육을 소화하기 위해 dispase II (1.1 U/mL)와 콜라겐분해효소 II (830 U/mL)를 포함하는 1x PBS 6mL를 추가하고, 소화는 ~1.5시간 동안 지속되어야 합니다.
10. 소화를 수행하려면 다진 근육을 37 °C 수조의 튜브로 옮기거나 다진 근육을 접시 내에 직접 남겨 두고 37 °C CO₂ 세포 인큐베이터에 넣습니다.
11. 세포 인큐베이터를 사용하여 소화하는 경우 15-30분마다 접시를 흔들어 소화가 잘 섞이도록 합니다.
    참고: Dispase II는 먼저 DMEM 배지(혈청 없음)와 함께 11U/mL 스톡으로 만들어야 하며, 콜라겐분해효소 II는 1x PBS와 함께 10,000U/mL 스톡으로 만들어야 합니다.
12. 분해가 완료되면 10mL 플라스틱 피펫을 사용하여 분해된 조직을 위아래로 여러 번 씻어내어 분해 혼합물을 완전히 균질화합니다.
13. 소화 속도를 늦추기 위해 10mL의 MuSC/Myoblast 성장 배지를 추가합니다. MuSC/Myoblast 성장 배지 준비에 대한 자세한 내용은 섹션 2에서 확인할 수 있습니다.
14. 혼합물을 70μm 여과기를 통해 실행합니다. 1x PBS를 사용하여 소화판을 헹구고 이 PBS를 여과기를 통해 실행하여 소화판의 모든 세포를 수집합니다.
15. 350 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 진공으로 버립니다.
16. 20mL의 1x PBS로 세포 펠릿을 재현탁시키고 40μm 여과기를 통해 세포를 실행합니다.
17. 350 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 진공으로 상층액을 제거합니다.
18. 20mL의 MuSC/Myoblast 성장 배지를 사용하여 세포를 재현탁시키고 10cm 일반 플라스틱 플레이트에 세포를 파종합니다. MuSC는 이 시간 동안 플레이트 바닥에 부착할 수 없으며 대부분 매체에 떠 있습니다.
    알림: 이것은 플라스틱 판에 대한 첫 번째 사전 도금입니다.
19. 1.5시간 후 플레이트를 짧게 흔들고 액체를 콜라겐으로 코팅된 10cm 접시 두 개에 옮기고 각 접시에는 10mL의 배양액이 들어 있습니다. 이제 MuSCs는 콜라겐 코팅된 플레이트에 부착되어 자랍니다. 2일 후에 미디어를 교체하십시오. 콜라겐 코팅된 플레이트는 이 섹션의 단계 1-4에서와 같이 준비됩니다.
20. 다른 날이 지난 후 세포를 통과시킵니다: 배지를 제거하고 1x PBS로 세포를 한 번 세척한 다음 세포를 트립신화합니다.
21. MuSC/Myoblast 성장 배지를 사용하여 플레이트에서 세포를 씻어내고 세포를 새 플라스틱 플레이트로 이동한 다음 세포 인큐베이터에서 40분 동안 배양합니다.
    알림: 이것은 플라스틱 판에 대한 두 번째 사전 도금입니다.
22. 배양액을 새 플라스틱 플레이트에 붓고 세포 인큐베이터에서 20분 더 배양합니다.
    알림: 이것은 플라스틱 판에 대한 세 번째 사전 도금입니다.
23. 그런 다음 플레이트의 상층액을 콜라겐으로 코팅된 10cm 접시 8개로 나누어 세포를 하위 배양합니다. 여기서 통과 비율은 2 : 8 (1 : 4)입니다. 위에서 설명한 사전 도금의 세 번 후에, 근아세포는 90% 이상의 순수성에 도달할 수 있습니다. 따라서 이 시점 이후에는 근아세포를 더 통과시킬 때 사전 플레이트할 필요가 없습니다.

2. MuSC/Myoblast 성장 배지의 제조 (5 마우스에서 제조하는 예)

1. 젊고 건강한 야생형 쥐 5마리를 희생하고, 비장을 분리하고, 1x PBS(페니실린/스트렙토마이신 포함)로 비장을 한 번 헹굽니다.
2. 가위를 사용하여 비장의 어두운 부분/반점이 있는 경우 제거합니다. 비장의 대부분이 검게 변한 경우 비장을 버리십시오.
3. 50mL 튜브 상단의 40μm 여과기에 5개의 비장을 모두 넣습니다.
4. 멸균 1mL 주사기 패키지를 열고 플런저를 당겨 빼낸 다음 배럴을 버립니다.
5. 40μm 스트레이너에서 고무 마개를 잡고 플런저의 엄지 받침대를 사용하여 비장 조직을 단일 세포로 갈아서 분리합니다. 주사기 패키지를 뜯을 때 플런저의 엄지 받침대를 만지거나 오염시키지 않도록 주의하십시오.
6. 비장을 갈고 있는 동안 때때로 1x PBS를 사용하여 해리된 비장 세포를 여과기 아래의 50mL 튜브로 씻어냅니다.
7. 모든 비장 세포가 여과기를 통해 50mL 튜브로 플러시된 후 튜브를 500 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
8. 1x 적혈구 용해 완충액 1mL를 사용하여 펠릿을 재현탁시킵니다. ~1분 동안 적혈구를 용해합니다.
   참고: 10x 적혈구 용해 완충액에는 ddH₂O에 155mM NH₄Cl, 10mM NaHCO₃ 및 1mM EDTA 디소듐 염이 포함되어 있습니다. 살균하기 위해 필터링하고 고압 멸균하지 마십시오. 사용하기 전에 ddH₂O에서 1x로 희석하십시오.
9. 50mL 튜브에 1x PBS를 채워 적혈구의 용해 과정을 중단합니다.
10. 40μm 스트레이너로 세포 현탁액을 다시 변형한 다음 500 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
11. 매우 부드러운 피펫팅으로 2mL의 RPMI-1640 전체 배지(10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 RPMI-1640 배지)로 세포를 재현탁시킵니다.
12. RPMI-1640 풀 미디어를 튜브에 더 넣고 잘 섞습니다. 세포 현탁액을 10개의 T75 배양 플라스크에 분배합니다. 각 T75 배양 플라스크의 최종 배양 용량은 20mL여야 합니다.
13. 각 T75 배양 플라스크에 10μL의 Concanavalin-A 스톡을 넣고 잘 섞습니다. Concanavalin-A는 T 세포의 증식을 활성화합니다.
    참고: Concanavalin-A 스톡은 4mg/mL이며 Concanavalin-A를 1x PBS에 용해시켜 제조합니다. 여기에는 Concanavalin-A 자체가 사용되며, 나중에 CUT&Tag 분석에 사용되는 Concanavalin-A 비드와 혼동하지 마십시오.
14. 48시간 후 각 T75 플라스크에 RPMI-1640 전체 배지 20mL를 더 보충하여 총 부피가 최대 40mL가 되도록 합니다.
15. 또 다른 24시간 후, 각 T75 플라스크와 원심분리기에 모든 배양액을 수집하고 600 x g 에서 3분 동안 가열합니다.
16. 상층액은 T-세포 조건부 배지이며 -20°C에서 -80°C에서 최대 2개월 동안 보관할 수 있습니다. 비장 세포 펠릿을 폐기합니다. 사용하기 전에 T 세포 조건부 배지를 해동하고 0.22μm 필터를 사용하여 배지를 추가로 멸균합니다.
17. Ham's F10 전체 배지를 만들려면 FBS 100mL, bFGF 스톡 300μL, 페니실린/스트렙토마이신 6mL를 Ham's F10 배지 500mL에 추가합니다.
    참고: bFGF 스톡은 5μg/mL이며 Ham의 F10 배지에 bFGF를 용해시켜 제조합니다.
18. Ham의 F10 전체 배지를 위에서 설명한 필터링된 T 세포 조건부 배지와 1:1 비율로 혼합하여 MuSC/Myoblast 성장 배지를 만듭니다.

3. 근아세포를 이용한 CUT&Tag (3가지 CUT&Tag 반응의 예)

1. 주요 시약의 준비
   1. 공개된 방법¹⁴를 사용하여 박테리아 배양에서 pA/G-Tn5 transposase를 사내에서 정제합니다. 이 효소는 도서관을 만드는 DNA 어댑터로 장착될 때까지만 기능적 형태에 도달합니다. 가장 중요한 것은 pA/G-Tn5가 다양한 출처에서 상업적으로 이용 가능하다는 것입니다.
   2. 어댑터를 만들기 위한 올리고는 표 1에 나와 있습니다. 특히, Oligo-Rev를 Oligo-A 및 Oligo-B와 각각 어닐링하여 그에 따라 이중 가닥 어댑터-A와 어댑터-B를 만듭니다. 어댑터를 만들기 위한 어닐링에 대한 세부 사항은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다¹⁴.
   3. Adaptor-A 및 Adaptor-B를 pA/G-Tn5 transposase와 함께 실온(RT)에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 이 전이효소는 기능적 형태를 취합니다. 이 원고의 다음 섹션에서는 pA/G-Tn5의 기능형을 pA/G-Tn5a라고 합니다.
      알림: pA/G-Tn5를 사내에서 제작하지 않고 구매한 경우 구입한 품목이 어댑터가 장착된 pA/G-Tn5(즉, 사용 가능)인지 아니면 pA/G-Tn5 효소 자체인지 명확히 해야 합니다. 단지 효소인 경우 위에서 설명한 두 개의 어댑터를 준비하고 pA/G-Tn5에 장착한 후 최종적으로 이 효소를 CUT&Tag에 사용합니다.
   4. Binding buffer, Wash buffer, Dig-wash buffer, 300-Dig buffer 및 Tagmentation buffer의 레시피에 대해서는 Kaya-Okur et ^al.1을 참조할 수도 있습니다.
   5. 20mM HEPES pH 7.5, 10mM KCl, 1mM CaCl₂ 및 1mM MnCl₂를 포함하는 바인딩 버퍼를 준비합니다.
   6. 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5mM 스퍼미딘 및 1x 프로테아제 억제제 칵테일이 포함된 세척 완충액을 준비합니다.
   7. DMSO에서 디지토닌을 농축 스톡으로 만든 다음 디지토닌을 Wash 버퍼에 0.5mg/mL 농도로 첨가하여 Dig-wash 버퍼를 준비합니다.
   8. EDTA를 2mM 농도로, BSA를 0.1% 농도로 Dig-wash buffer에 첨가하여 항체 완충액을 준비합니다.
   9. 20mM HEPES pH 7.5, 300mM NaCl, 300mM 스퍼미딘, 1x 프로테아제 억제제 칵테일 및 0.1-0.5mg/mL 디지토닌을 포함하는 300-Dig 완충액을 준비합니다.
   10. 300-Dig 버퍼에 10mM MgCl2를 보충하여 Tagmentation 버퍼를 준비_합니다. MgCl₂ 는 pA / G-Tn5a의 효소 활성을 활성화 할 수 있습니다.
       참고: 다른 재료에 대한 정보는 재료 목차 파일에 제공됩니다.
2. Concanavalin-A 비드 활성화
   1. 30 μL의 Concanavalin-A 비드(각 반응당 10 μL)를 1.5 mL 원심분리기 튜브의 300 μL 결합 완충액에 혼합합니다. 잘 섞이도록 여러 번 뒤집습니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 액체가 맑아지면 상층액을 제거하십시오.
   2. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 튜브에 300μL의 Binding buffer를 추가하고 잘 섞은 다음 8-PCR 튜브 스트라이프의 3개 튜브로 고르게 나눕니다. 각 튜브를 하나의 CUT&Tag 반응으로 지정합니다.
   3. 8-PCR 튜브 스트라이프를 마그네틱 랙에 놓고 액체가 맑아질 때까지 기다립니다.
   4. 상층액을 흡입하고 마그네틱 랙에서 튜브를 제거합니다. 각 튜브에 10μL의 바인딩 버퍼를 넣고 잘 섞습니다. 세포가 진행할 준비가 될 때까지 준비된 비드를 얼음 위에 놓거나 4°C에서 놓습니다.
3. Concanavalin-A beads에 세포 결합
   1. 배양된 마우스 근아세포를 플레이트에서 트립신화하고, RT 1x PBS로 세포를 한 번 세척한 다음 최종적으로 RT에서 Wash buffer에서 세포를 재현탁시킵니다. 과도한 트립신화는 Concanavalin-A 비드에 대한 세포막의 친화력을 손상시킬 수 있으므로 피하십시오.
   2. Wash 버퍼에서 세포 밀도를 약 7 x 10⁵ cells/mL로 조정하여 100μL의 세포 현탁액에 약 70,000개의 세포가 포함되도록 하며, 이는 1회의 CUT&Tag 반응에 충분합니다.
   3. 세포 현탁액 100μL를 이미 10μL의 준비된 Concanavalin-A 비드가 포함된 8-PCR 튜브 스트라이프의 각 튜브에 피펫합니다. 잘 섞고 RT에서 10분 동안 "시소 동작" 셰이커에서 배양합니다.
   4. 8-PCR 튜브 스트라이프를 마그네틱 랙에 놓습니다. 맑아질 때까지 기다렸다가 상층액을 제거하십시오.
   5. Concanavalin-A 비드가 세포를 효율적으로 격리했는지 평가하려면 현미경으로 상층액을 확인하여 상층액에 얼마나 많은 세포가 남아 있는지 확인하십시오. Concanavalin-A 비드 결합 단계 후에는 상층액에서 세포가 거의 또는 전혀 관찰되지 않아야 합니다.
4. 1차 항체로 세포 배양
   1. 각 샘플에 대해 1μL의 H3K4me1 항체를 50μL의 항체 완충액으로 희석하고 희석된 항체를 각 샘플 튜브에 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 희석된 항체와 비드를 잘 섞습니다. 샘플을 "시소 모션" 쉐이커에 올려 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      참고: Steven Henikoff^박사1가 언급했듯이 모든 CUT&Tag 분석에서 IgG 음성 대조군을 사용할 필요는 없었습니다. ChIP와 비교했을 때, CUT&Tag 어세이는 배경 신호가 훨씬 낮거나 전혀 나타나지 않습니다. 따라서 IgG를 사용하여 "음성 대조군" CUT&Tag 분석을 수행하는 것은 유용한 정보를 제공하지 않습니다. 반면, CUT&Tag 검증 항체를 사용하여 양성 대조군을 수행하는 것은 CUT&Tag 분석이 효과가 있는지 여부를 평가하는 데 중요합니다.
5. 2차 항체로 세포 배양
   1. 다음날 아침, 샘플을 마그네틱 랙에 놓고 샘플이 사라질 때까지 기다립니다.
   2. 1차 항체인 상층액을 제거합니다. 구슬을 씻을 필요가 없습니다. 50μL의 희석된(1:100) 2차 항체를 각 시료 튜브에 직접 추가합니다.
      참고: 2차 항체는 Dig-wash buffer로 1:100 비율로 희석합니다. 보다 효율적인 pA/G-Tn5a 인식을 위해 2차 항체를 HRP, 비오틴 또는 형광단과 같은 분자 또는 그룹과 접합해서는 안 됩니다.
   3. 잘 섞고 RT에서 "시소 모션" 쉐이커에서 1시간 동안 배양합니다.
   4. 샘플을 마그네틱 랙에 다시 넣고 샘플이 맑아질 때까지 기다렸다가 상층액을 버립니다.
   5. 각 튜브에 200μL의 Dig-wash 버퍼를 추가하고 여러 번 뒤집어 과도한 항체를 씻어냅니다.
   6. 마그네틱 랙에 다시 놓고 맑아질 때까지 기다렸다가 상층액을 제거합니다. 이 세척을 두 번 더 반복하여 과도한 결합되지 않은 항체를 완전히 제거합니다.
6. pA/G-Tn5a로 세포 배양
   1. 마지막 세척 후 샘플을 마그네틱 랙에 넣고 샘플이 사라질 때까지 기다렸다가 튜브의 모든 액체를 제거합니다. 각 시료 튜브에 0.04μM에서 pA/G-Tn5a를 포함하는 100μL의 300-Dig 버퍼를 추가합니다. 잘 섞고 RT에서 1시간 동안 시소 모션 셰이커에서 배양합니다.
   2. 마그네틱 랙에 올려 놓습니다. 샘플이 맑아질 때까지 기다렸다가 상층액을 제거합니다.
   3. 각 샘플에 200μL의 300-Dig 버퍼를 넣고 잘 섞은 다음 셰이커에 올려 샘플을 실온에서 3분 동안 세척합니다.
   4. 마그네틱 랙에 올려 놓습니다. 샘플이 맑아질 때까지 기다렸다가 상층액을 제거합니다. 이 세척을 두 번 더 반복하여 과도한 pA/G-Tn5a를 제거하고 배경을 낮춥니다.
7. 게놈의 분열 및 태그 부착
   1. 마지막 세척 후 샘플을 마그네틱 랙에 놓고 튜브에서 액체를 철저히 파이프로 분리합니다. 각 샘플에 대해 50μL의 태깅 버퍼를 추가합니다. 잘 섞고 37°C의 PCR 기계에서 1시간 동안 배양합니다. PCR 기계의 뚜껑 가열 기능을 사용하지 마십시오.
      참고: 선택적으로, 다음 게놈 DNA 정제 단계 중 물질 마모로 인해 일부 스파이크인 DNA를 태그 지정 버퍼에 추가하여 스파이크인이 최종 염기서열 분석 결과에 표시되고 데이터를 정규화하는 데 사용할 수 있습니다. 스파이크-인 DNA를 준비하고 사용하는 방법은 다른 곳에서도 찾을 수 있다¹⁴.
8. 총 게놈 DNA 정제
   1. 태깅 후 각 샘플에 대해 150μL의 태깅 버퍼를 더 추가합니다. 이제 총 부피는 200μL입니다.
   2. 그런 다음 각 샘플에 대해 10μL의 0.5M EDTA, 3μL의 10% SDS 및 2.5μL의 20mg/mL Proteinase K. Vortex를 추가하여 잘 섞고 55^°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   3. 각 샘플을 1.5mL 원심분리기 튜브에 담긴 200μL의 페놀/클로로포름에 피펫하고 10초 동안 소용돌이칩니다. 18,000 x g 에서 5분 동안 원심분리기 최상층을 새 1.5mL 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
   4. 각 튜브에 200μL의 클로로포름을 넣고 10초 동안 소용돌이칩니다. 18,000 x g 에서 5분 동안 원심분리기
   5. 최상층을 새 1.5mL 원심분리기 튜브에 흡입합니다. 그런 다음 각 샘플에 대해 550μL의 100% 에탄올을 추가하여 DNA를 -80°C에서 1시간 동안 침전시킵니다. DNA 펠릿을 더 잘 시각화하려면 1μL의 20mg/mL 글리코겐을 추가합니다.
   6. 최대 속도(>18,000 x g)로 15분 동안 원심분리하여 DNA를 펠릿화합니다.
   7. 상층액을 조심스럽게 붓고 글리코겐/DNA 펠릿을 75% 에탄올로 한 번 세척한 다음 5분 동안 최대 속도로 다시 원심분리합니다.
   8. 75% 에탄올을 제거하고 21μL의 ddH_2O로 글리코겐/DNA 펠릿을 재현탁시킵니다.
9. 라이브러리 준비 및 시퀀싱(Library preparation and sequencing)
   1. 라이브러리 준비 PCR을 설정합니다. 함께 염기서열분석할 샘플을 인덱싱하려면 각 샘플에 대해 다른 N7XX Illumina 프라이머와 범용 N5XX Illumina 프라이머를 사용합니다. 12개 이상의 시료를 인덱싱하는 경우 다른 N5XX Illumina 프라이머도 필요합니다. Illumina는 12개의 N7XX 프라이머와 8개의 N5XX 프라이머를 제공하므로 N5XX와 N5XX 조합의 총 개수는 12 x 8 = 96입니다. PCR 반응 설정은 표 2에 나타내었다.
   2. CUT&Tag 분석에 사용된 세포 수로 라이브러리 준비 PCR의 PCR 주기 수를 대략적으로 결정합니다. 일반적으로 50,000-100,000 세포를 사용하는 CUT&Tag 분석의 경우 9-12 사이클로 충분하며 10,000-50,000 사이의 세포 수는 최대 14 사이클이 필요할 수 있습니다. PCR 프로그램은 표 3에 표시되어 있습니다.
      참고: 대부분의 CUT&Tag 분석에서 항체가 제대로 기능한 경우 9-14 사이의 PCR 주기 번호는 항상 염기서열분석에 유용한 라이브러리를 생성해야 합니다. 좋은 라이브러리는 일반적으로 농도가 10-50ng/μL(Qubit 분석에 의해 결정됨), 부피가 20-30μL입니다. 반대로, 항체가 효율적이고 특이적으로 작동하지 않으면 단순히 주기 수를 늘리는 것만으로는 실험을 저장할 수 없습니다. 과도한 주기 수는 결과에 전혀 도움이 되지 않으며 대신 더 많은 PCR 중복을 도입하여 나중에 데이터 분석을 복잡하게 만듭니다.
   3. 일부 시판되는 DNA 정제/크기 선택 비드를 사용하여 라이브러리 DNA를 정제하고 원하는 크기의 DNA를 선택합니다.
   4. 정제된 라이브러리의 소량의 부분 표본을 물로 희석하고 ChIP-qPCR 실험에서와 같이 농축을 확인하기 위해 유전자좌 특이적 프라이머를 사용한 qPCR에 사용합니다. 라이브러리를 시퀀싱하기 전에 CUT&Tag가 작동했는지 여부를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.
   5. 제조업체의 지침에 따라 시퀀싱 및 데이터 분석을 수행합니다.
      참고: CUT&Tag 키트는 소수의 회사에서 상업적으로 사용할 수 있으며 한 가지 예는 재료 표 파일에서 찾을 수 있습니다.

결과

세포를 Concanavalin-A beads에 결합하기 전에 현미경으로 세포 현탁액을 확인하십시오. 따라서 Concanavalin-A 비드로 세포를 배양한 후 샘플 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 현미경을 사용하여 상층액을 다시 관찰해야 합니다. 이는 세포가 Concanavalin-A 비드에 의해 얼마나 효율적으로 포획되었는지 평가하기 위한 것입니다. 7 x 10⁵ cells/mL를 포함하는 세척 완충액은 현미경으로 볼 때 그림...

토론

특정 CUT&Tag 반응에 필요한 특정 세포 수는 테스트 할 히스톤 마크 / 변이체 또는 염색질 결합 단백질의 농축에 전적으로 의존합니다. 일반적으로 H3K4me1, H3K4me3 및 H3K27ac 등과 같은 매우 풍부한 히스톤 표시의 경우 25,000-50,000 개의 근 아세포가 하나의 CUT & Tag 반응에 충분합니다. 그러나 일부 희귀 염색질 결합 단백질은 최대 250,000개의 세포가 필요할 수 있습니다. CUT&Tag 어세이에 사용되는 셀 수는 매?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size