마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tagmentation) 분석 사용

요약

후성유전학 분야를 처음 접하는 연구자들은 CUT&Tag가 ChIP 분석에 대한 훨씬 더 쉬운 대안임을 알게 될 것입니다. CUT&Tag는 희귀 및 원발성 세포 집단에 대한 후성유전학 연구에 큰 도움을 주어 극소수의 세포에서 고품질 데이터를 생성했습니다. 이 프로토콜은 마우스 뒷다리 근육에서 분리된 마우스 근아세포에 대해 H3K4me1 CUT&Tag 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

초록

이 프로토콜 논문은 새로운 연구자에게 CUT&Tagation(Cleavage Under Targets and Tagmentation)을 사용하여 염색질 결합 인자, 히스톤 마크 및 히스톤 변이체의 게놈 위치를 프로파일링하는 방법에 대한 전체 세부 정보를 제공하는 것을 목표로 합니다. CUT&Tag 프로토콜은 마우스 근아세포 및 갓 분리한 근육 줄기 세포(MuSC)와 매우 잘 작동합니다. 그들은 세포가 Concanavalin-A 비드로 고정될 수 있는 한 많은 다른 세포 유형에 쉽게 적용될 수 있습니다. CUT&Tag와 비교했을 때, 염색질 면역침전(ChIP) 어세이는 시간이 많이 걸리는 실험입니다. ChIP 분석은 염색질 물질을 면역침전에 사용하기 전에 염색질의 전처리가 필요합니다. 가교 ChIP (X-ChIP)에서 염색질의 전처리에는 염색질을 단편화하기위한 교차 결합 및 초음파 처리가 포함됩니다. 천연 ChIP(N-ChIP)의 경우, 단편화된 염색질은 일반적으로 미세구균 뉴클레아제(MNase) 분해에 의해 달성됩니다. 초음파 처리와 MNase 분해는 모두 ChIP 실험에 약간의 편향을 도입합니다. CUT&Tag 분석은 ChIP에 비해 더 적은 단계 내에 완료할 수 있고 훨씬 더 적은 세포를 필요로 하지만 다양한 게놈 위치에서 전사 인자 또는 히스톤 표시에 대한 보다 편향되지 않은 정보를 제공합니다. CUT&Tag는 최소 5,000개의 셀로 작동할 수 있습니다. ChIP보다 감도가 높고 배경 신호가 낮기 때문에 연구자들은 염기서열분석 후 수백만 번의 판독만으로도 신뢰할 수 있는 피크 데이터를 얻을 수 있을 것으로 기대할 수 있습니다.

서문

CUT&Tag 분석은 ChIP¹의 몇 가지 명백한 결함을 보완하기 위해 발명되었습니다. ChIP의 두 가지 주요 단점은 1) 염색질을 단편화할 때 발생하는 바이어스와 2) 낮은 세포 수로 작업할 수 없다는 것입니다. X-ChIP 분석은 염색질 단편을 얻기 위해 초음파 처리 또는 MNase 분해에 의존하는 반면, N-ChIP는 주로 MNase 분해를 사용하여 뉴클레오솜을 얻습니다. 초음파 처리는 프로모터 영역²와 같은 이완 된 염색질 위치에 대한 편향을 보이며, 명백하게, MNase 소화는 또한 이완 된 염색질 섬유에서보다 효율적으로 작동합니다. 더욱이, 일부에서는 MNase 분해가 DNA 염기서열 의존성 편향(DNA sequence-dependent bias)을 나타낸다고 보고했다³. 따라서 ChIP 분석의 투입 준비 단계에서 모든 종류의 게놈 위치에서 완벽하게 무작위로 염색질 단편을 얻는 것은 불가능합니다. 또한 ChIP 분석은 일반적으로 CUT&Tag에 비해 더 높은 배경 신호를 생성하며 피크가^1,4,5

프로토콜

이 원고에 제시된 방법은 모두 광저우 실험실의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 이 원고의 대표 결과를 생성하는 데 사용된 마우스는 광저우 실험실의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 보관되고 유지되었습니다.

1. 마우스 뒷다리 근육에서 근모세포 분리(마우스 1마리 사용 예)

1. 빙초산을 ddH₂O로 0.02 M로 희석하고 고압 멸균한다.
2. 콜라겐(쥐 꼬리에서)을 0.02M 아세트산으로 0.1mg/mL로 희석합니다.
3. 이 콜라겐 용액을 배양 접시에 추가하여 37°C 세포 인큐베이터에서 하룻밤 동안 접시 바닥을 코팅합니다.
4. 사용하기 전에 콜라겐 용액을 제거하고 1x PBS로 접시를 두 번 씻으십시오. 콜라겐 용액은 8-10 회 재사용 할 수 있습니다.
5. 8-12주 된 쥐를 희생합니다. (늙은 쥐는 MuSC와 근아세포의 수율이 낮습니다.)
6. 쥐의 모든 뒷다리 근육을 분리하여 10cm 접시에 넣습니다.
7. 1x PBS(페니실린/스트렙토마이신 포함)를 사용하여 근육을 4번 헹굽니다.....

토론

특정 CUT&Tag 반응에 필요한 특정 세포 수는 테스트 할 히스톤 마크 / 변이체 또는 염색질 결합 단백질의 농축에 전적으로 의존합니다. 일반적으로 H3K4me1, H3K4me3 및 H3K27ac 등과 같은 매우 풍부한 히스톤 표시의 경우 25,000-50,000 개의 근 아세포가 하나의 CUT & Tag 반응에 충분합니다. 그러나 일부 희귀 염색질 결합 단백질은 최대 250,000개의 세포가 필요할 수 있습니다. CUT&Tag 어세이에 사용되는 셀 수는 매?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size