Verwendung des CUT&Tag-Assays (Cleavage under Targets and Tagmentation) in der Maus-Myoblastenforschung

Zusammenfassung

Forscher, die neu auf dem Gebiet der Epigenetik sind, werden in CUT&Tag eine deutlich einfachere Alternative zu ChIP-Assays finden. CUT&Tag hat die epigenetischen Studien an seltenen und primären Zellpopulationen enorm begünstigt und qualitativ hochwertige Daten von sehr wenigen Zellen generiert. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von H3K4me1 CUT&Tag-Assays an Mausmyoblasten, die aus den Hintergliedmaßenmuskeln der Maus isoliert wurden.

Zusammenfassung

Dieses Protokollpapier soll den neuen Forschern alle Einzelheiten zur Verwendung von Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) zur Erstellung eines Profils der genomischen Positionen von Chromatinbindungsfaktoren, Histonmarkierungen und Histonvarianten liefern. CUT&Tag-Protokolle funktionieren sehr gut mit Maus-Myoblasten und frisch isolierten Muskelstammzellen (MuSCs). Sie können problemlos auf viele andere Zelltypen angewendet werden, solange die Zellen durch Concanavalin-A-Kügelchen immobilisiert werden können. Im Vergleich zu CUT&Tag sind Chromatin-Immunpräzipitations-Assays (ChIP) zeitaufwändige Experimente. ChIP-Assays erfordern eine Vorbehandlung des Chromatins, bevor das chromatische Material für die Immunpräzipitation verwendet werden kann. Bei der Vernetzung von ChIP (X-ChIP) umfasst die Vorbehandlung des Chromatins die Vernetzung und Beschallung, um das Chromatin zu fragmentieren. Im Falle von nativem ChIP (N-ChIP) werden die fragmentierten Chromatine normalerweise durch den Verdau der Mikrokokken-Nuklease (MNase) erreicht. Sowohl die Beschallung als auch der MNase-Aufschluss führen zu einer gewissen Verzerrung der ChIP-Experimente. CUT&Tag-Assays können in weniger Schritten abgeschlossen werden und benötigen im Vergleich zu ChIPs viel weniger Zellen, liefern aber unvoreingenommenere Informationen über Transkriptionsfaktoren oder Histonmarkierungen an verschiedenen genomischen Stellen. CUT&Tag kann mit nur 5.000 Zellen auskommen. Aufgrund der höheren Empfindlichkeit und des geringeren Hintergrundsignals als bei ChIPs können Forscher nach der Sequenzierung mit zuverlässigen Spitzendaten von nur wenigen Millionen Reads rechnen.

Einleitung

Der CUT&Tag-Assay wurde entwickelt, um einige offensichtliche Fehler von ChIPs¹ zu kompensieren. Die beiden Hauptnachteile von ChIPs sind 1) die Verzerrung bei der Fragmentierung des Chromatins und 2) die Inkompetenz, mit niedrigen Zellzahlen zu arbeiten. X-ChIP-Assays beruhen entweder auf Ultraschall oder MNase-Verdau, um Chromatinfragmente zu erhalten, während N-ChIP hauptsächlich den MNase-Verdau verwendet, um Nukleosomen zu gewinnen. Die Beschallung zeigt eine Tendenz zu entspannten Chromatinstellen wie den Promotorregionen², und anscheinend funktioniert der MNase-Verdau auch auf entspannten Chromatinfasern effizient....

Protokoll

Die in diesem Manuskript vorgestellten Methoden sind alle vom Institutional Animal Care and Use Committee des Guangzhou Laboratory genehmigt. Mäuse, die zur Erstellung der repräsentativen Ergebnisse dieses Manuskripts verwendet wurden, wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee des Guangzhou Laboratory untergebracht und gepflegt.

1. Myoblastenisolierung aus den Muskeln der Hintergliedmaßen der Maus (Beispiel für die Verwendung von 1 Maus)

1. Eisessig mit ddH₂O auf 0,02 M verdünnen und autoklavieren.
2. Verdünnen Sie Kollagen (aus dem Rattenschwanz) ....

Diskussion

Die spezifische Zellzahl, die für eine bestimmte CUT&Tag-Reaktion erforderlich ist, hängt vollständig von der Anreicherung der Histonmarkierungen/-varianten oder Chromatin-bindenden Proteine ab, die getestet werden sollen. Normalerweise sind für sehr angereicherte Histonmarkierungen wie H3K4me1, H3K4me3 und H3K27ac usw. 25.000-50.000 Myoblasten für eine CUT&Tag-Reaktion völlig ausreichend. Einige seltene Chromatin-bindende Proteine könnten jedoch bis zu 250.000 Zellen benötigen. Die in CUT&Tag-Assays verwendete Z.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size