Verwendung des CUT&Tag-Assays (Cleavage under Targets and Tagmentation) in der Maus-Myoblastenforschung

Zusammenfassung

Forscher, die neu auf dem Gebiet der Epigenetik sind, werden in CUT&Tag eine deutlich einfachere Alternative zu ChIP-Assays finden. CUT&Tag hat die epigenetischen Studien an seltenen und primären Zellpopulationen enorm begünstigt und qualitativ hochwertige Daten von sehr wenigen Zellen generiert. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von H3K4me1 CUT&Tag-Assays an Mausmyoblasten, die aus den Hintergliedmaßenmuskeln der Maus isoliert wurden.

Zusammenfassung

Dieses Protokollpapier soll den neuen Forschern alle Einzelheiten zur Verwendung von Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) zur Erstellung eines Profils der genomischen Positionen von Chromatinbindungsfaktoren, Histonmarkierungen und Histonvarianten liefern. CUT&Tag-Protokolle funktionieren sehr gut mit Maus-Myoblasten und frisch isolierten Muskelstammzellen (MuSCs). Sie können problemlos auf viele andere Zelltypen angewendet werden, solange die Zellen durch Concanavalin-A-Kügelchen immobilisiert werden können. Im Vergleich zu CUT&Tag sind Chromatin-Immunpräzipitations-Assays (ChIP) zeitaufwändige Experimente. ChIP-Assays erfordern eine Vorbehandlung des Chromatins, bevor das chromatische Material für die Immunpräzipitation verwendet werden kann. Bei der Vernetzung von ChIP (X-ChIP) umfasst die Vorbehandlung des Chromatins die Vernetzung und Beschallung, um das Chromatin zu fragmentieren. Im Falle von nativem ChIP (N-ChIP) werden die fragmentierten Chromatine normalerweise durch den Verdau der Mikrokokken-Nuklease (MNase) erreicht. Sowohl die Beschallung als auch der MNase-Aufschluss führen zu einer gewissen Verzerrung der ChIP-Experimente. CUT&Tag-Assays können in weniger Schritten abgeschlossen werden und benötigen im Vergleich zu ChIPs viel weniger Zellen, liefern aber unvoreingenommenere Informationen über Transkriptionsfaktoren oder Histonmarkierungen an verschiedenen genomischen Stellen. CUT&Tag kann mit nur 5.000 Zellen auskommen. Aufgrund der höheren Empfindlichkeit und des geringeren Hintergrundsignals als bei ChIPs können Forscher nach der Sequenzierung mit zuverlässigen Spitzendaten von nur wenigen Millionen Reads rechnen.

Einleitung

Der CUT&Tag-Assay wurde entwickelt, um einige offensichtliche Fehler von ChIPs¹ zu kompensieren. Die beiden Hauptnachteile von ChIPs sind 1) die Verzerrung bei der Fragmentierung des Chromatins und 2) die Inkompetenz, mit niedrigen Zellzahlen zu arbeiten. X-ChIP-Assays beruhen entweder auf Ultraschall oder MNase-Verdau, um Chromatinfragmente zu erhalten, während N-ChIP hauptsächlich den MNase-Verdau verwendet, um Nukleosomen zu gewinnen. Die Beschallung zeigt eine Tendenz zu entspannten Chromatinstellen wie den Promotorregionen², und anscheinend funktioniert der MNase-Verdau auch auf entspannten Chromatinfasern effizienter. Darüber hinaus berichteten einige, dass der MNase-Verdau auch eine DNA-sequenzabhängige Verzerrung aufweist³. Daher ist es bei der Eingangsvorbereitung von ChIP-Assays unmöglich, Chromatinfragmente von allen möglichen genomischen Stellen auf völlig zufällige Weise zu gewinnen. Darüber hinaus erzeugen ChIP-Assays im Vergleich zu CUT&Tag in der Regel höhere Hintergrundsignale und erfordern mehr als 10-mal mehr Lesevorgänge als CUT&Tag, um zu betonen, wo die Peaks^{bei 1,4,5} liegen. Dies erklärt, warum ChIP-Experimente mit enorm mehr Zellen beginnen müssen als CUT&Tag. Dies ist bei der Untersuchung von Zelllinien kein Problem, da sie wiederholt passaget werden können, um eine sehr hohe Zellzahl zu erreichen. Der ChIP-Assay ist jedoch definitiv kein starkes epigenetisches Werkzeug zur Untersuchung seltener oder wertvoller primärer Zellpopulationen, obwohl Primärzellen offensichtlich praktischere und medizinische Implikationen haben.

Während das lange und komplizierte ChIP-Verfahren einige Forscher davon abhält, diese Technik zu erlernen oder anzuwenden, fühlen sich die Menschen mit einfacheren Assays wie Immunzytochemie (ICC) oder Immunfluoreszenz (IF) wohler. Ein CUT&Tag-Assay ähnelt im Wesentlichen dem Ablauf von ICC- und IF-Experimenten, findet aber nur im Reagenzglas statt. CUT&Tag benötigt zunächst kein fragmentiertes Chromatin, stattdessen muss das Genom für die Antikörperbindung^{intakt sein 1}. Am ersten Tag eines ChIP-Experiments verbringen die Forscher normalerweise bis zu 4 Stunden damit, die fragmentierten Chromatine aus Zellkernen durch Ultraschall oder MNase-Verdau vorzubereiten, bevor die kurzen Chromatinstücke mit Antikörper-Kügelchen gemischt werden^{können 4,5}. Im bemerkenswerten Gegensatz dazu besteht die Arbeitsbelastung am ersten Tag eines CUT&Tag-Verfahrens darin, die Zellen einfach an Concanavalin-A-Kügelchen zu immobilisieren und dann den primären Antikörper auf die Zellkügelchen zu geben. Dies dauert nur ~40 min¹.

Es ist erwähnenswert, dass Cloavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN) eine wichtige Alternative zu CUT&Tag ist. CUT&RUN wurde auf der Grundlage eines ähnlichen Arbeitsmechanismus wie CUT&TAG entwickelt. In CUT&TAG leiten die Antikörper die pA/G-Tn5-Transposase zu allen Stellen, an denen das Enzym jeweils ein Stück Chromatin herausschneidet und es in der Zwischenzeit mit bibliotheksbildenden Adaptern markiert, während bei CUT&RUN die Rolle von pA/G-Tn5 von der pA/G-MNase gespielt wird, die nur den schneidenden Teil der Arbeit übernimmt⁶. Daher erfordert CUT&RUN im Vergleich zu CUT&TAG einen zusätzlichen Schritt, nämlich das Aufkleben der Library-Making-Adapter auf die pA/G-MNase-fragmentierten DNA-Stücke ^7,8. Aufgrund der hohen Ähnlichkeiten zwischen CUT&Tag und CUT&RUN werden sich Forscher, die mit CUT&TAG vertraut sind, leicht an die kompetente Durchführung von CUT&RUN gewöhnen. Es ist jedoch zu beachten, dass es zwischen CUT&Tag und CUT&RUN einige geringfügige Unterschiede gibt. CUT&RUN-Protokolle verwenden normalerweise die physikalische Salzkonzentration (~150 mM) in den Waschschritten, während in CUT&Tag der 300-Dig-Waschpuffer einen hohen Salzgehalt aufweist. Daher ist CUT&Tag gut in der Lage, den Hintergrund bei der Profilierung von Histonmarkierungen/-varianten oder Transkriptionsfaktoren zu kontrollieren, da diese Proteine direkt und stark an DNA¹ binden. CUT&Tag kann bei der Profilierung von Chromatin-assoziierten Faktoren, die nicht direkt an die DNA binden und eine schwache Affinität zum Chromatin aufweisen, auf Probleme stoßen. Waschschritte mit hohem Salzgehalt in CUT&Tag können Chromatin-assoziierte Faktoren entfernen und keine Signale in der Endausgabe verursachen. Obwohl es erfolgreiche Fälle gibt, in denen CUT&Tag verwendet werden kann, um einige Proteine ohne Histon/Nicht-Transkriptionsfaktor zu profilieren⁹, empfehlen wir immer noch CUT&RUN anstelle von CUT&Tag, um schwach gebundene Chromatin-assoziierte Proteine zu profilieren.

Nachdem Säugetiere das Erwachsenenalter erreicht haben, enthält ihr Skelettmuskelgewebe immer noch Muskelstammzellen. Während einer Muskelverletzung können diese Stammzellen aktiviert werden und eine Zellzahlerweiterung und -differenzierung erfahren, um geschädigte Muskelfasern zu regenerieren¹⁰. Diese Stammzellen werden als Muskelstamm-/Satellitenzellen (MuSCs) bezeichnet. Nachdem MuSCs aus Tieren isoliert oder durch Muskelverletzungen aktiviert wurden, beginnen sie sich zu vermehren und werden zu Myoblasten.

Um MuSCs aus dem Skelettmuskelverdau von Mäusen zu erhalten, werden MuSC-Oberflächenmarker wie Vcam1 (Cd106), Cd34 und α7-Integrin (Itga7) häufig einzeln oder in Kombinationen verwendet, um MuSCs während der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) ^{anzureichern11}. Es hat sich gezeigt, dass Cd31^-/CD45^-/^Sca1-/Vcam1⁺ wahrscheinlich die beste Markerkombination ist, um >95% reine MuSCs¹² zu erhalten. FACS kann reine MuSCs direkt nach der Verdauung frischer Muskeln isolieren. Wenn das Versuchsdesign jedoch keine reinen MuSCs direkt bei ihrer Isolierung erfordert, ist die Präplattierung kostengünstiger als FACS, um >90% reine Myoblasten (MuSC-Nachkommen) zu erhalten.

MuSCs, die frisch aus Mäusen isoliert wurden, vermehren sich nicht effizient in Hams F10-Medien, die mit fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt werden. Um die Zellzahl der MuSCs besser zu erhöhen und ausreichend Myoblasten zu erhalten, sollte anstelle von FBS Rinderwachstumsserum (BGS) verwendet werden. Wenn jedoch kein BGS verfügbar ist, können Hams F10-Vollmedien (die etwa 20 % FBS enthalten) mit einem gleichen Volumen an T-Zell-bedingten Medien gemischt werden, um die Myoblastenexpansion dramatisch zu fördern¹³. Daher wird in diesem Protokoll auch die Herstellung von T-Zell-Medien, konditionierten MuSC-Medien, beschrieben.

Am wichtigsten ist, dass dieses Protokoll ein vollständiges Beispiel für die Durchführung von H3K4me1 CUT&Tag-Assays an Maus-Myoblasten liefert, die aus den Muskeln der Hintergliedmaßen der Maus isoliert wurden. Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll auch für andere Zelltypen und Histonmarkierungen und Histonvarianten gilt und die Leser nur die Zellzahlen oder Antikörpermengen für ihre Fälle optimieren müssen, basierend auf der Anreicherung der spezifischen Histonmarkierungen oder Varianten, die sie untersuchen.

Um in CUT&Tag oder CUT&RUN verwendet werden zu können, muss das Tn5 oder die MNase mit Protein A oder Protein G fusioniert werden, um pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase oder pG-MNase herzustellen. Anscheinend können sowohl Protein A als auch Protein G gleichzeitig mit diesen Enzymen fusioniert werden, um pA/G-Tn5 oder pA/G-MNase zu erzeugen. Protein A und Protein G zeigen unterschiedliche Affinitäten zu IgGs verschiedener Spezies. Daher kann die Fusion von Protein A und Protein G zusammen mit dem Enzym dieses Problem lösen und das Enzym mit Antikörpern aus mehreren Spezies kompatibel machen.

Protokoll

Die in diesem Manuskript vorgestellten Methoden sind alle vom Institutional Animal Care and Use Committee des Guangzhou Laboratory genehmigt. Mäuse, die zur Erstellung der repräsentativen Ergebnisse dieses Manuskripts verwendet wurden, wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee des Guangzhou Laboratory untergebracht und gepflegt.

1. Myoblastenisolierung aus den Muskeln der Hintergliedmaßen der Maus (Beispiel für die Verwendung von 1 Maus)

1. Eisessig mit ddH₂O auf 0,02 M verdünnen und autoklavieren.
2. Verdünnen Sie Kollagen (aus dem Rattenschwanz) auf 0,1 mg/ml mit 0,02 M Essigsäure.
3. Geben Sie diese Kollagenlösung in Kulturschalen, um den Boden der Schale über Nacht in einem 37 °C heißen Zellinkubator zu beschichten.
4. Vor Gebrauch die Kollagenlösung entfernen und das Geschirr zweimal mit 1x PBS spülen. Die Kollagenlösung kann 8-10 Mal wiederverwendet werden.
5. Opfere eine 8-12 Wochen alte Maus. (Alte Mäuse haben eine schlechte Ausbeute an MuSCs und Myoblasten.)
6. Isolieren Sie alle Muskeln der Hintergliedmaßen der Maus und legen Sie sie in eine 10 cm große Schale.
7. Verwenden Sie 1x PBS (mit Penicillin/Streptomycin), um die Muskeln 4 Mal zu spülen. Übertragen Sie die Muskeln nach jeder Spülung immer in eine neue Platte.
8. Entfernen Sie nach der letzten Spülung PBS und zerkleinern Sie die Muskeln mit einer Schere.
9. Fügen Sie 6 ml 1x PBS hinzu, das Dispase II (1,1 U/ml) und Kollagenase II (830 U/ml) enthält, um die gehackten Muskeln zu verdauen, und die Verdauung sollte ~1,5 h dauern.
10. Um die Verdauung durchzuführen, geben Sie die gehackten Muskeln in ein Röhrchen in einem 37 °C warmen Wasserbad oder lassen Sie die gehackten Muskeln direkt in der Schale und legen Sie sie in einen 37 °C_{CO 2} -Zellinkubator.
11. Wenn Sie einen Zellinkubator zur Verdauung verwenden, schütteln Sie das Gericht alle 15-30 Minuten, um die Verdauung gut zu vermischen.
    HINWEIS: Dispase II sollte zuerst als 11 U/ml-Stamm mit DMEM-Medien (ohne Serum) hergestellt werden, und Kollagenase II sollte als 10.000 U/ml-Stamm mit 1x PBS hergestellt werden.
12. Wenn der Aufschluss abgeschlossen ist, spülen Sie das verdaute Gewebe mit einer 10-ml-Plastikpipette mehrmals auf und ab, um die Aufschlussmischung gründlich zu homogenisieren.
13. Fügen Sie 10 ml MuSC/Myoblast-Wachstumsmedium hinzu, um die Verdauung zu verlangsamen. Details zur Aufbereitung von MuSC/Myoblast-Wachstumsmedien finden Sie in Abschnitt 2.
14. Lassen Sie die Mischung durch ein 70-μm-Sieb laufen. Verwenden Sie 1x PBS, um die Aufschlussplatte zu spülen, und lassen Sie dieses PBS ebenfalls durch das Sieb laufen, um alle Zellen in der Aufschlussplatte zu sammeln.
15. Bei 350 x g für 10 min zentrifugieren und den Überstand mit Vakuum verwerfen.
16. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 20 mL 1x PBS und lassen Sie die Zellen durch ein 40-μm-Sieb laufen.
17. Bei 350 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand mit Vakuum entfernen.
18. Verwenden Sie 20 ml MuSC/Myoblast-Wachstumsmedium, um die Zellen zu resuspendieren, und säen Sie die Zellen in einer 10 cm dicken normalen Kunststoffplatte aus. MuSCs können sich während dieser Zeit nicht an den Plattenboden anlagern und bleiben meist im Medium schwebend.
    HINWEIS: Dies ist die erste Vorbeschichtung auf Kunststoffplatten.
19. Nach 1,5 h die Platte kurz schütteln und die Flüssigkeit in zwei mit Kollagen beschichtete 10-cm-Schalen umfüllen, wobei jede Schale 10 ml Kultur enthält. Nun werden sich die MuSCs an die kollagenbeschichteten Platten anheften und wachsen. Wechseln Sie das Medium nach 2 Tagen. Kollagenbeschichtete Platten werden wie in den Schritten 1-4 dieses Abschnitts hergestellt.
20. Nach einem weiteren Tag passagen Sie die Zellen: Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und trypsinisieren Sie die Zellen.
21. Verwenden Sie MuSC/Myoblast-Wachstumsmedien, um die Zellen von den Platten zu spülen, die Zellen auf eine neue Kunststoffplatte zu setzen und 40 Minuten lang im Zellinkubator zu inkubieren.
    HINWEIS: Dies ist die zweite Vorbeschichtung auf Kunststoffplatten.
22. Gießen Sie die Kultur in eine neue Kunststoffplatte und inkubieren Sie sie weitere 20 Minuten im Zellinkubator.
    HINWEIS: Dies ist die dritte Vorbeschichtung auf Kunststoffplatten.
23. Teilen Sie dann den Überstand in der Platte in 8 kollagenbeschichtete 10-cm-Schalen auf, um die Zellen zu subkulturieren. Das Durchgangsverhältnis beträgt hier 2:8 (1:4). Nach dreimaliger Vorbeschichtung, wie oben beschrieben, können die Myoblasten eine Reinheit von über 90 % erreichen. Daher ist es nach diesem Zeitpunkt nicht mehr erforderlich, bei der weiteren Passage der Myoblasten vorzuplattieren.

2. Präparation von MuSC/Myoblast-Wachstumsmedien (Beispiel für die Präparation von 5 Mäusen)

1. Opfern Sie 5 junge und gesunde Wildtyp-Mäuse, isolieren Sie die Milz und spülen Sie die Milz einmal mit 1x PBS (mit Penicillin/Streptomycin).
2. Verwenden Sie eine Schere, um die dunklen Teile/Flecken auf der Milz zu entfernen, falls vorhanden. Entsorgen Sie die Milz, wenn das meiste davon schwarz geworden ist.
3. Legen Sie alle 5 Milz in ein 40-μm-Sieb auf einem 50-ml-Röhrchen.
4. Öffnen Sie eine sterile 1-ml-Spritzenpackung, ziehen Sie den Kolben heraus und entsorgen Sie den Zylinder.
5. Halten Sie den Gummistopfen in das 40-μm-Sieb und verwenden Sie die Daumenauflage des Kolbens, um das Milzgewebe zu zerkleinern und in einzelne Zellen zu zerlegen. Achten Sie darauf, die Daumenauflage des Kolbens nicht zu berühren und zu verunreinigen, wenn Sie die Spritzenverpackung aufreißen.
6. Während Sie die Milz zerkleinern, verwenden Sie gelegentlich 1x PBS, um die dissoziierten Milzzellen in das 50-ml-Röhrchen unter dem Sieb abzuwaschen.
7. Nachdem alle Milzzellen durch das Sieb in das 50 mL Röhrchen gespült wurden, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 x g für 10 min.
8. Verwenden Sie 1 ml 1x Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen, um das Pellet zu resuspendieren. Lysieren Sie die roten Blutkörperchen für ~1 min.
   HINWEIS: 10x Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen enthält 155 mM NH₄Cl, 10 mM NaHCO₃ und 1 mM EDTA Dinatriumsalz in ddH₂O. Zum Sterilisieren filtern und nicht autoklavieren. Vor Gebrauch mit ddH₂O bis 1x verdünnen.
9. Füllen Sie das 50-ml-Röhrchen mit 1x PBS, um den Lyseprozess der roten Blutkörperchen zu stoppen.
10. Die Zellsuspension erneut mit einem 40-μm-Sieb abseihen und anschließend 10 min bei 500 x g zentrifugieren.
11. Resuspendieren Sie die Zellen mit 2 mL RPMI-1640 Vollmedium (RPMI-1640 Medium mit 10% FBS und Penicillin/Streptomycin) durch sehr schonendes Pipettieren.
12. Geben Sie mehr RPMI-1640 Full Media in die Tube und mischen Sie es gut. Die Zellsuspension wird auf zehn T75-Kulturflaschen verteilt. Das endgültige Kulturvolumen in jedem T75-Kulturkolben sollte 20 ml betragen.
13. 10 μl Concanavalin-A-Stamm in jeden T75-Kulturkolben geben und gut mischen. Concanavalin-A aktiviert die Proliferation von T-Zellen.
    HINWEIS: Die Concanavalin-A-Brühe beträgt 4 mg/ml und wird durch Auflösen von Concanavalin-A in 1x PBS hergestellt. Hier kommt das Concanavalin-A selbst zum Einsatz, nicht zu verwechseln mit den Concanavalin-A-Kügelchen, die später in CUT&Tag-Assays verwendet werden.
14. Ergänzen Sie nach 48 Stunden jeden T75-Kolben mit weiteren 20 ml RPMI-1640 Vollmedium, so dass sich das Gesamtvolumen auf 40 ml summiert.
15. Weitere 24 Stunden später die gesamte Kultur in jedem T75-Kolben sammeln und 3 Minuten lang bei 600 x g zentrifugieren.
16. Der Überstand besteht aus T-Zell-bedingten Medien und kann bis zu 2 Monate bei -20 °C bis -80 °C gelagert werden. Entsorgen Sie die Milzzellenpellets. Tauen Sie vor der Verwendung das T-Zell-bedingte Medium auf und sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22-μm-Filter weiter.
17. Um Hams F10-Vollmedium herzustellen, fügen Sie 100 ml FBS, 300 μl bFGF-Stamm und 6 ml Penicillin/Streptomycin in 500 ml Hams F10-Medium hinzu.
    HINWEIS: Der bFGF-Stamm beträgt 5 μg/ml und wird durch Auflösen von bFGF in Ham's F10-Medien hergestellt.
18. Mischen Sie das F10-Vollmedium von Ham mit den oben beschriebenen gefilterten T-Zell-bedingten Medien im Verhältnis 1:1, um MuSC/Myoblast-Wachstumsmedien herzustellen.

3. CUT&Tag mit Myoblasten (Beispiel für 3 CUT&Tag-Reaktionen)

1. Vorbereitung der wichtigsten Reagenzien
   1. Aufreinigung der pA/G-Tn5-Transposase im eigenen Haus aus Bakterienkulturen unter Verwendung der veröffentlichten Methode¹⁴. Dieses Enzym erreicht seine funktionelle Form erst so lange, bis es mit DNA-Adaptern zur Herstellung von Bibliotheken ausgestattet ist. Am wichtigsten ist, dass pA/G-Tn5 aus vielen Quellen kommerziell erhältlich ist.
   2. Die Oligos zur Herstellung von Adaptern sind in Tabelle 1 dargestellt. Insbesondere wird Oligo-Rev mit Oligo-A bzw. Oligo-B geglüht, um doppelsträngige Adapter-A und Adapter-B entsprechend herzustellen. Die Einzelheiten zum Glühen zur Herstellung der Adapter finden Sie an anderer Stelle¹⁴.
   3. Inkubieren Sie Adapter-A und Adapter-B mit pA/G-Tn5-Transposase bei Raumtemperatur (RT) für 2 h. Dann nimmt diese Transposase ihre funktionelle Form an. In den folgenden Abschnitten dieses Manuskripts wird die funktionelle Form von pA/G-Tn5 als pA/G-Tn5a bezeichnet.
      HINWEIS: Wenn das pA/G-Tn5 gekauft und nicht im eigenen Haus hergestellt wird, stellen Sie sicher, dass es sich bei dem gekauften Artikel um pA/G-Tn5 handelt, das mit Adaptern montiert ist (mit anderen Worten, gebrauchsfertig) oder ob es sich nur um das pA/G-Tn5-Enzym selbst handelt. Wenn es nur das Enzym ist, bereiten Sie die beiden oben beschriebenen Adapter vor und montieren Sie sie auf das pA/G-Tn5, bevor Sie dieses Enzym schließlich für CUT&Tag verwenden.
   4. Für die Rezepte des Bindungspuffers, des Waschpuffers, des Dig-Wash-Puffers, des 300-Dig-Puffers und des Tagmentationspuffers können die Leser auch auf Kaya-Okur et ^al.1 verweisen.
   5. Bereiten Sie den Bindungspuffer vor, der 20 mM HEPES pH 7,5, 10 mM KCl, 1 mM CaCl₂ und 1 mM MnCl₂ enthält.
   6. Bereiten Sie den Waschpuffer vor, der 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin und 1x Proteasehemmer-Cocktail enthält.
   7. Stellen Sie Digitonin als konzentrierte Brühe in DMSO her und bereiten Sie dann den Dig-Wash-Puffer vor, indem Sie Digitonin in den Waschpuffer bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml geben.
   8. Bereiten Sie den Antikörperpuffer vor, indem Sie EDTA bis zu einer Konzentration von 2 mM und BSA bis zu einer Konzentration von 0,1 % in den Dig-Wash-Puffer geben.
   9. Bereiten Sie einen 300-Dig-Puffer vor, der 20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, 1x Proteasehemmer-Cocktail und 0,1-0,5 mg/ml Digitonin enthält.
   10. Bereiten Sie den Tagmentationspuffer vor, indem Sie den 300-Dig-Puffer mit 10 mM MgCl₂ ergänzen. MgCl₂ kann die enzymatische Aktivität von pA/G-Tn5a aktivieren.
       HINWEIS: Informationen zu anderen Materialien finden Sie in der Datei Materialtabelle .
2. Aktivierung von Concanavalin-A-Kügelchen
   1. Mischen Sie 30 μl Concanavalin-A-Kügelchen (10 μl für jede Reaktion) in 300 μl Bindungspuffer in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Mehrmals invertieren, um gut zu vermischen. Legen Sie das Rohr auf ein Magnetgestell. Nachdem die Flüssigkeit klar ist, entfernen Sie den Überstand.
   2. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetgestell, geben Sie 300 μl Bindungspuffer in das Röhrchen, mischen Sie es gut und teilen Sie es gleichmäßig in 3 Röhrchen mit einem 8-PCR-Röhrchenstreifen auf. Bestimmen Sie jedes Rohr mit einer CUT&Tag-Reaktion.
   3. Legen Sie den 8-PCR-Röhrchenstreifen auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Flüssigkeit klar ist.
   4. Saugen Sie den Überstand an und entfernen Sie die Röhrchen aus dem Magnetgestell. Geben Sie 10 μl Bindungspuffer in jedes Röhrchen und mischen Sie es gut. Legen Sie die vorbereiteten Kügelchen auf Eis oder bei 4 °C, bis die Zellen bereit sind.
3. Bindung von Zellen an Concanavalin-A-Kügelchen
   1. Trypsinisieren Sie kultivierte Maus-Myoblasten von den Platten, waschen Sie die Zellen einmal mit RT 1x PBS und resuspendieren Sie die Zellen schließlich in Waschpuffer bei RT. Vermeiden Sie eine Übertrypsinisierung, da dies die Affinität der Zellmembran zu Concanavalin-A-Kügelchen beeinträchtigen kann.
   2. Stellen Sie die Zelldichte auf etwa 7 x 10⁵ Zellen/ml im Waschpuffer ein, so dass 100 μl Zellsuspension etwa 70.000 Zellen enthalten, ausreichend für eine CUT&Tag-Reaktion.
   3. Pipettieren Sie 100 μl der Zellsuspension in jedes Röhrchen des 8-PCR-Röhrchenstreifens, der bereits 10 μl vorbereitete Concanavalin-A-Kügelchen enthält. Gut mischen und auf einem "Wippbewegung"-Shaker 10 min bei RT inkubieren.
   4. Legen Sie den 8-PCR-Röhrchenstreifen auf ein Magnetgestell. Warten Sie, bis es klar ist, und entfernen Sie den Überstand.
   5. Um zu beurteilen, ob die Concanavalin-A-Kügelchen die Zellen effizient sequestriert haben, überprüfen Sie den Überstand unter dem Mikroskop, um zu sehen, wie viele Zellen noch im Überstand vorhanden sind. Nach dem Bindungsschritt der Concanavalin-A-Beads sollten nur sehr wenige oder keine Zellen im Überstand beobachtet werden.
4. Inkubation der Zellen mit einem primären Antikörper
   1. Für jede Probe wird 1 μl H3K4me1-Antikörper in 50 μl Antikörperpuffer verdünnt und der verdünnte Antikörper in jedes Probenröhrchen gegeben. Mischen Sie die Kügelchen gut mit dem verdünnten Antikörper, indem Sie die Röhrchen mehrmals umdrehen. Geben Sie die Proben auf den "Wippbewegung"-Shaker, um sie über Nacht bei 4 °C zu inkubieren.
      HINWEIS: Wie von Dr. Steven Henikoff¹ erwähnt, war es nicht notwendig, bei allen CUT&Tag-Assays eine IgG-Negativkontrolle zu verwenden. Im Vergleich zu ChIPs haben CUT&Tag-Assays ein viel geringeres oder gar kein Hintergrundsignal. Daher führt die Verwendung von IgG zur Durchführung eines CUT&Tag-Assays mit "Negativkontrolle" keine nützlichen Informationen ein. Im Gegensatz dazu ist die Verwendung eines CUT&Tag-validierten Antikörpers zur Durchführung einer Positivkontrolle wichtig, um zu beurteilen, ob der CUT&Tag-Assay funktioniert hat.
5. Inkubation der Zellen mit einem Sekundärantikörper
   1. Legen Sie die Proben am nächsten Morgen auf das Magnetgestell und warten Sie, bis die Proben klar sind.
   2. Entfernen Sie den Überstand, bei dem es sich um den primären Antikörper handelt. Es ist nicht nötig, die Perlen zu waschen; Geben Sie direkt 50 μl verdünnten (1:100) Sekundärantikörper in jedes Probenröhrchen.
      HINWEIS: Der Sekundärantikörper wird mit Dig-Wash-Puffer im Verhältnis 1:100 verdünnt. Um eine effizientere Erkennung von pA/G-Tn5a zu ermöglichen, sollten Sekundärantikörper nicht mit Molekülen oder Gruppen wie HRP, Biotin oder Fluorophoren konjugiert werden.
   3. Gut mischen und auf dem Schüttler "Wippe Bewegung" bei RT 1 h inkubieren.
   4. Legen Sie die Proben wieder auf das Magnetgestell, warten Sie, bis die Proben klar sind, und entsorgen Sie den Überstand.
   5. Geben Sie 200 μl Dig-Wash-Puffer in jedes Röhrchen und invertieren Sie es mehrmals, um die überschüssigen Antikörper abzuwaschen.
   6. Setzen Sie es wieder auf das Magnetgestell, warten Sie, bis es klar ist, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie dieses Waschen noch zweimal, um überschüssige ungebundene Antikörper vollständig zu entfernen.
6. Inkubation der Zellen mit pA/G-Tn5a
   1. Legen Sie die Proben nach dem letzten Waschen auf das Magnetgestell, warten Sie, bis die Proben klar sind, und entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit aus dem Röhrchen. Für jedes Probenröhrchen werden 100 μl 300-Dig-Puffer mit pA/G-Tn5a bei 0,04 μM zugegeben. Gut mischen und 1 h bei RT auf dem Wippenschüttler inkubieren.
   2. Setzen Sie das Magnetgestell auf. Warten Sie, bis die Proben klar sind, und entfernen Sie den Überstand.
   3. Geben Sie 200 μl 300-Dig-Puffer in jede Probe, mischen Sie gut und stellen Sie sie auf den Shaker, um die Probe 3 Minuten lang bei RT zu waschen.
   4. Setzen Sie das Magnetgestell auf. Warten Sie, bis die Proben klar sind, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zweimal, um überschüssiges pA/G-Tn5a zu entfernen und den Hintergrund zu senken.
7. Spaltung und Tagmentation der Genome
   1. Legen Sie die Proben nach dem letzten Waschen auf das Magnetgestell und pipettieren Sie die Flüssigkeit gründlich aus dem Röhrchen. Fügen Sie für jede Probe 50 μl Tagmentationspuffer hinzu. Gut mischen und in einer PCR-Maschine bei 37 °C 1 h inkubieren. Verwenden Sie nicht die Deckelheizfunktion des PCR-Geräts.
      HINWEIS: Optional können aufgrund des Materialverschleißes während des folgenden Aufreinigungsschritts der genomischen DNA einige Spike-in-DNAs in den Tagmentationspuffer hinzugefügt werden, so dass der Spike-in in den endgültigen Sequenzierungsergebnissen auftaucht und zur Normalisierung der Daten verwendet werden kann. Das Verfahren zur Präparation und Verwendung der Spike-in-DNA finden Sie an anderer Stelle¹⁴.
8. Vollständige genomische DNA-Reinigung
   1. Nach der Tagmentierung fügen Sie für jede Probe weitere 150 μl Tagmentationspuffer hinzu. Das Gesamtvolumen beträgt nun 200 μL.
   2. Fügen Sie dann für jede Probe 10 μl 0,5 M EDTA, 3 μl 10 % SDS und 2,5 μl 20 mg/ml Proteinase K hinzu. Vortex, gut mischen und 2 Stunden lang bei 55 ^°C inkubieren.
   3. Jede Probe wird in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 200 μl Phenol/Chloroform pipetiert und 10 s lang vortext. Zentrifugieren Sie bei 18.000 x g für 5 min. Übertragen Sie die oberste Schicht in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
   4. Geben Sie 200 μl Chloroform in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es 10 s lang. Zentrifugieren Sie bei 18.000 x g für 5 min.
   5. Saugen Sie die oberste Schicht in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen an. Fügen Sie dann für jede Probe 550 μl 100 % Ethanol hinzu, um die DNA 1 h lang bei -80 °C auszufällen. Um das DNA-Pellet besser sichtbar zu machen, fügen Sie 1 μl 20 mg/ml Glykogen hinzu.
   6. Zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit (>18.000 x g), um die DNA zu pelletieren.
   7. Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab, waschen Sie das Glykogen-/DNA-Pellet einmal mit 75 % Ethanol und zentrifugieren Sie erneut bei maximaler Geschwindigkeit für 5 Minuten.
   8. Entfernen Sie das 75%ige Ethanol und resuspendieren Sie das Glykogen/DNA-Pellet mit 21 μl ddH₂O.
9. Vorbereitung und Sequenzierung von Bibliotheken
   1. Richten Sie die bibliotheksvorbereitende PCR ein. Um die Proben, die zusammen sequenziert werden sollen, zu indizieren, verwenden Sie für jede Probe einen anderen N7XX Illumina-Primer und einen universellen N5XX Illumina-Primer. Wenn mehr als 12 Proben indiziert werden, sind auch andere N5XX Illumina-Primer erforderlich. Illumina bietet zwölf N7XX-Primer und acht N5XX-Primer an, so dass die Gesamtzahl der N7XX- mit N5XX-Kombinationen 12 x 8 = 96 beträgt. Der Aufbau der PCR-Reaktion ist in Tabelle 2 dargestellt.
   2. Bestimmen Sie die PCR-Zyklusnummer in der bibliotheksvorbereitenden PCR grob anhand der im CUT&Tag-Assay verwendeten Zellnummer. Normalerweise sind für einen CUT&Tag-Assay mit 50.000 bis 100.000 Zellen 9-12 Zyklen völlig ausreichend, und bei einer Zellzahl zwischen 10.000 und 50.000 können bis zu 14 Zyklen erforderlich sein. Das PCR-Programm ist in Tabelle 3 dargestellt.
      HINWEIS: Bei den meisten CUT&Tag-Assays sollte eine PCR-Zyklusnummer zwischen 9 und 14 immer eine nützliche Bibliothek für die Sequenzierung erzeugen, wenn der Antikörper ordnungsgemäß funktioniert hat. Eine gute Bibliothek hat normalerweise eine Konzentration von 10-50 ng/μl (bestimmt durch Qubit Assay) und ein Volumen von 20-30 μl. Im Gegenteil, wenn der Antikörper nicht effizient und spezifisch wirkte, kann eine bloße Erhöhung der Zykluszahl die Experimente nicht retten. Zu hohe Zykluszahlen wirken sich überhaupt nicht positiv auf die Ergebnisse aus und führen stattdessen zu mehr PCR-Duplikaten, die später die Datenanalyse erschweren.
   3. Verwenden Sie einige im Handel erhältliche DNA-Aufreinigungs-/Größenauswahlkügelchen, um die Bibliotheks-DNA aufzureinigen und die DNA in den gewünschten Größen auszuwählen.
   4. Verdünnen Sie ein kleines Aliquot der gereinigten Bibliothek mit Wasser und verwenden Sie es für die qPCR mit locusspezifischen Primern, um Anreicherungen wie in ChIP-qPCR-Experimenten zu überprüfen. Vor der Sequenzierung der Bibliothek kann dies hilfreich sein, um festzustellen, ob CUT&Tag funktioniert hat.
   5. Führen Sie die Sequenzierung und Datenanalyse gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
      HINWEIS: CUT&Tag-Kits sind von einer Handvoll Unternehmen im Handel erhältlich, und ein Beispiel finden Sie in der Datei mit der Materialtabelle .

Ergebnisse

Bevor Sie Zellen an Concanavalin-A-Kügelchen binden, überprüfen Sie die Zellsuspension unter dem Mikroskop. Dementsprechend werden nach der Inkubation der Zellen mit Concanavalin-A-Kügelchen die Probenröhrchen auf das Magnetgestell gestellt, und der Überstand sollte erneut mit einem Mikroskop beobachtet werden. Damit soll beurteilt werden, wie effizient die Zellen von Concanavalin-A-Kügelchen eingefangen wurden. Ein Waschpuffer mit 7 x 10⁵ Zellen/ml sollte unter dem Mikroskop wie in...

Diskussion

Die spezifische Zellzahl, die für eine bestimmte CUT&Tag-Reaktion erforderlich ist, hängt vollständig von der Anreicherung der Histonmarkierungen/-varianten oder Chromatin-bindenden Proteine ab, die getestet werden sollen. Normalerweise sind für sehr angereicherte Histonmarkierungen wie H3K4me1, H3K4me3 und H3K27ac usw. 25.000-50.000 Myoblasten für eine CUT&Tag-Reaktion völlig ausreichend. Einige seltene Chromatin-bindende Proteine könnten jedoch bis zu 250.000 Zellen benötigen. Die in CUT&Tag-Assays verwendete Z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size