Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

חוקרים חדשים בתחום האפיגנטי ימצאו את CUT&Tag חלופה קלה משמעותית למבחני ChIP. CUT&Tag הועילה מאוד למחקרים אפיגנטיים על אוכלוסיות תאים נדירות וראשוניות, והפיקה נתונים באיכות גבוהה ממעט מאוד תאים. פרוטוקול זה מתאר ביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&Tag על מיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות של העכבר.

Abstract

מאמר פרוטוקול זה נועד לספק לחוקרים החדשים את הפרטים המלאים של השימוש ב- Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) כדי ליצור פרופיל של המיקומים הגנומיים של גורמים קושרי כרומטין, סימני היסטון ווריאנטים של היסטון. פרוטוקולי CUT&Tag מתפקדים היטב עם מיובלסטים של עכברים ותאי גזע שריריים שזה עתה בודדו (MuSCs). הם יכולים בקלות להיות מיושמים על סוגי תאים רבים אחרים כל עוד התאים יכולים להיות משותקים על ידי חרוזי Concanavalin-A. בהשוואה ל- CUT&Tag, מבחני משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP) הם ניסויים הגוזלים זמן. בדיקות ChIP דורשות טיפול מקדים בכרומטין לפני שניתן יהיה להשתמש בחומר הכרומטי עבור משקעים חיסוניים. ב- cross-linking ChIP (X-ChIP), טיפול מקדים בכרומטין כולל קישור צולב וסוניקציה כדי לשבור את הכרומטין. במקרה של ChIP מקורי (N-ChIP), הכרומטין המקוטע מושג בדרך כלל על ידי עיכול נוקלאז מיקרוקוקלי (MNase). הן סוניקציה והן עיכול MNase מציגים הטיה מסוימת לניסויי ChIP. בדיקות CUT&Tag יכולות להסתיים תוך פחות שלבים ודורשות הרבה פחות תאים בהשוואה ל- ChIPs אך מספקות מידע בלתי משוחד יותר על גורמי שעתוק או סימני היסטון במיקומים גנומיים שונים. CUT&Tag יכול לתפקד עם עד 5,000 תאים בלבד. בשל רגישותו הגבוהה יותר ואות הרקע הנמוך יותר מאשר ChIPs, החוקרים יכולים לצפות לקבל נתוני שיא אמינים רק מכמה מיליוני קריאות לאחר ריצוף.

Introduction

בדיקת CUT&Tag הומצאה כדי לפצות על כמה פגמים גלויים של ChIPs1. שני החסרונות העיקריים של ChIPs הם 1) ההטיה המוצגת בעת פיצול כרומטין 2) חוסר היכולת לעבוד עם מספרי תאים נמוכים. מבחני X-ChIP מסתמכים על סוניקציה או על עיכול MNase כדי לקבל מקטעי כרומטין, בעוד N-ChIP משתמש בעיקר בעיכול MNase כדי לקבל נוקלאוזומים. סוניקציה מראה הטיה לכיוון מיקומי כרומטין רגועים כגון אזורי מקדם2, וככל הנראה, עיכול MNase עובד ביעילות רבה יותר גם על סיבי כרומטין רגועים. יתר על כן, חלקם דיווחו כי עיכול MNase מראה גם הטיה תלוית רצף DNA3. לכן, בשלב הכנת הקלט של בדיקות ChIP, אי אפשר לקבל קטעי כרומטין מכל מיני מיקומים גנומיים באופן אקראי לחלוטין. יתר על כן, מבחני ChIP בדרך כלל מייצרים אותות רקע גבוהים יותר בהשוואה ל- CUT&Tag ודורשים מעל 10 קיפולים יותר קריאות מאשר CUT&Tag כדי להדגיש היכן הפסגות הן 1,4,5. זה מסביר מדוע ניסויי ChIP צריכים להתחיל עם הרבה יותר תאים מאשר CUT&Tag. זו אינה בעיה כאשר חוקרים קווי תאים מכיוון שניתן לעבור אותם שוב ושוב כדי להשיג מספר תאים גבוה מאוד. עם זאת, בדיקת ChIP היא בהחלט לא כלי אפיגנטי חזק לחקר אוכלוסיות נדירות או יקרות ערך של תאים ראשוניים, אם כי לתאים ראשוניים יש כמובן השלכות מעשיות ורפואיות יותר.

בעוד הליך ChIP ארוך ומסובך מרתיע כמה חוקרים ללמוד או להשתמש בטכניקה זו, אנשים מרגישים נוח יותר עם בדיקות קלות יותר כגון immunocytochemistry (ICC) או immunofluorescence (IF). בדיקת CUT&Tag דומה במהותה לתהליך של ניסויי ICC ו-IF, אך מתרחשת רק במבחנה. CUT&Tag אינו זקוק לכרומטין מקוטע מלכתחילה, ובמקום זאת, הגנום חייב להיות שלם עבור קשירת נוגדנים1. ביום הראשון של ניסוי ChIP, החוקרים בדרך כלל מבלים עד 4 שעות בהכנת הכרומטין המקוטע מגרעינים עם סוניקציה או עיכול MNase לפני שניתן לערבב את חתיכות הכרומטין הקצרות עם חרוזי נוגדנים 4,5. בניגוד יוצא דופן, עומס העבודה ביום הראשון של הליך CUT&Tag הוא פשוט לשתק את התאים לחרוזי Concanavalin-A ולאחר מכן להוסיף את הנוגדן העיקרי לחרוזי התא. זה דורש רק ~ 40 דקות1.

ראוי להזכיר כי מחשוף תחת מטרות ושחרור באמצעות Nuclease (CUT&RUN) הוא חלופה חשובה CUT&Tag. CUT&RUN הוקמה על בסיס מנגנון עבודה דומה לזה של CUT&Tag. ב-CUT&Tag, הנוגדנים מנחים את הטרנספוזאז pA/G-Tn5 לכל המקומות שבהם כל אחד מהאנזים יחתוך פיסת כרומטין ובינתיים יתייג אותה עם מתאמי ספרייה, בעוד שב-CUT&RUN, תפקיד ה-pA/G-Tn5 ממלא ה-pA/G-MNase שמבצע רק את החלק החותך של העבודה6. לכן, בהשוואה ל- CUT&Tag, CUT&RUN דורש שלב נוסף שהוא להדביק את מתאמי יצירת הספרייה על חתיכות ה- DNA המקוטעות pA/G-MNase 7,8. בשל הדמיון הרב בין CUT&Tag ו- CUT&RUN, חוקרים המכירים את CUT&Tag יתאימו את עצמם בקלות לביצוע CUT&RUN במיומנות. עם זאת, יש לציין כי קיימים כמה הבדלים קלים בין CUT&Tag לבין CUT&RUN. פרוטוקולי CUT&RUN משתמשים בדרך כלל בריכוז הפיזי של מלח (~ 150 מילימול) בשלבי הכביסה, בעוד שב- CUT&Tag, מאגר השטיפה 300-Dig עשיר במלח. לכן, CUT&Tag טוב בשליטה על הרקע בעת יצירת פרופיל של סימנים/וריאנטים של היסטון או גורמי שעתוק, מכיוון שחלבונים אלה קושרים ישירות ובחוזקה את DNA1. CUT&Tag עלול להיתקל בבעיות בעת יצירת פרופיל של גורמים הקשורים לכרומטין, שאינם קושרים ישירות את ה- DNA ומראים זיקה חלשה לכרומטין. שלבי שטיפת מלח גבוהים ב- CUT&Tag עשויים להסיר גורמים הקשורים לכרומטין, ולא לגרום לאותות בפלט הסופי. למרות שישנם מקרים מוצלחים בהם ניתן להשתמש ב- CUT&Tag כדי ליצור פרופיל של חלבונים מסוימים שאינם היסטון/גורמים שאינם שעתוק9, אנו עדיין ממליצים על CUT&RUN over CUT&Tag כדי ליצור פרופיל חלבונים הקשורים לכרומטין.

לאחר שהיונקים מגיעים לבגרות, רקמות שרירי השלד שלהם עדיין מכילות תאי גזע שריריים. במהלך פגיעה בשריר, תאי גזע אלה יכולים להיות מופעלים ולעבור הרחבה והתמיינות של מספר התאים כדי לחדש סיבי שריר פגומים10. תאי גזע אלה ידועים בשם תאי גזע שריר / לוויין (MuSCs). לאחר ש-MuSCs מבודדים מבעלי חיים או מופעלים על ידי פגיעה בשרירים, הם מתחילים להתרבות והופכים למיובלסטים.

כדי לקבל MuSCs מעיכול שרירי השלד של עכברים, סמני פני השטח של MuSC כגון Vcam1 (Cd106), Cd34 ו-α7-integrin (Itga7) משמשים לעתים קרובות בנפרד או בשילובים כדי להעשיר MuSCs במהלך מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS)11. הוכח כי Cd31-/Cd45-/Sca1-/Vcam1+ הוא כנראה שילוב הסמן הטוב ביותר לקבלת >95% MuSCsטהורים 12. FACS יכול לבודד MuSCs טהורים מיד לאחר עיכול שרירים טריים. עם זאת, אם התכנון הניסיוני אינו דורש MuSCs טהורים ממש בבידוד שלהם, ציפוי מראש הוא חסכוני יותר מאשר FACS כדי להשיג >90% מיובלסטים טהורים (צאצאי MuSC).

MuSCs שבודדו זה עתה מעכברים אינם מתרבים ביעילות במדיה F10 של Ham בתוספת נסיוב בקר עוברי (FBS). כדי להרחיב טוב יותר את מספר התאים של MuSCs ולקבל מספיק מיובלסטים, יש להשתמש בסרום גידול בקר (BGS) במקום FBS. עם זאת, אם BGS אינו זמין, ניתן לערבב את המדיה המלאה F10 של Ham (המכילה כ-20% FBS) עם נפח שווה של מדיה מותנית של תאי T כדי לקדם באופן דרמטי את הרחבת מיובלסט13. לכן, פרוטוקול זה יתאר גם את הכנת מדיה מותנית של תאי T MuSC.

והכי חשוב, פרוטוקול זה מספק דוגמה מלאה לביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&Tag על מיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות של העכבר. שים לב שפרוטוקול זה חל גם על סוגי תאים אחרים וסימני היסטון ווריאנטים של היסטון, והקוראים צריכים רק למטב את מספרי התאים או את כמויות הנוגדנים עבור המקרים שלהם בהתבסס על העשרת סימני ההיסטון הספציפיים או הווריאנטים שהם חוקרים.

על מנת להשתמש ב- CUT&Tag או CUT&RUN, יש להתיך את ה- Tn5 או ה- MNase עם חלבון A או חלבון G כדי ליצור pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase או pG-MNase. ככל הנראה, גם חלבון A וגם חלבון G יכולים להתיך על אנזימים אלה בו זמנית כדי ליצור pA/G-Tn5 או pA/G-MNase. חלבון A וחלבון G מראים זיקות שונות ל-IgGs ממינים שונים. לכן, התכה של חלבון A וחלבון G יחד עם האנזים יכולה להתגבר על בעיה זו ולהתאים את האנזים לנוגדנים ממינים רבים.

Protocol

השיטות המוצגות בכתב יד זה מאושרות כולן על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מעבדת גואנגז'ו. עכברים ששימשו ליצירת התוצאות המייצגות של כתב היד הזה שוכנו ותוחזקו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מעבדת גואנגז'ו.

1. בידוד מיובלסט משרירי הגפיים האחוריות של העכבר (דוגמה לשימוש בעכבר אחד)

  1. לדלל חומצה אצטית קרחונית עם ddH2O עד 0.02 M ו autoclave אותו.
  2. לדלל קולגן (מזנב חולדה) ל 0.1 מ"ג / מ"ל עם 0.02 M חומצה אצטית.
  3. הוסיפו את תמיסת הקולגן הזו לצלחות תרבית כדי לצפות את תחתית המנה באינקובטור תאים בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
  4. לפני השימוש, הסירו את תמיסת הקולגן ושטפו את הכלי פעמיים עם 1x PBS. ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסת קולגן במשך 8-10 פעמים.
  5. הקריבו עכבר בן 8-12 שבועות. (לעכברים זקנים יש יבולים נמוכים של MuSCs ומיובלסטים.)
  6. בודדו והניחו את כל שרירי הגפיים האחוריות מהעכבר לתוך צלחת של 10 ס"מ.
  7. השתמש 1x PBS (עם פניצילין/סטרפטומיצין) כדי לשטוף את השרירים 4 פעמים. לאחר כל שטיפה, תמיד להעביר את השרירים לתוך צלחת חדשה.
  8. לאחר השטיפה הסופית, להסיר PBS ולטחון את השרירים עם מספריים.
  9. הוסף 6 מ"ל של 1x PBS המכיל dispase II (1.1 U / mL) ו collagenase II (830 U / mL) כדי לעכל את השרירים הטחונים, ואת העיכול צריך להימשך ~ 1.5 שעות.
  10. כדי לבצע עיכול, להעביר את השרירים הטחונים לתוך צינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס או ישירות לעזוב את השרירים טחון בתוך צלחת ומניחים אותו בתוך 37 ° C CO2 אינקובטור התא.
  11. אם משתמשים באינקובטור תאים לעיכול, רוקנו את המנה כל 15-30 דקות כדי לערבב היטב את העיכול.
    הערה: Dispase II צריך להיות מיוצר תחילה כמלאי 11 U/mL עם מדיה DMEM (ללא סרום), ו collagenase II צריך להיות מיוצר כמו 10,000 U/mL מלאי עם 1x PBS.
  12. כאשר העיכול הושלם, השתמש בצינור פלסטיק של 10 מ"ל כדי לשטוף את הרקמות המעוכלות למעלה ולמטה מספר פעמים כדי ליצור הומוגניות יסודית של תערובת העיכול.
  13. הוסף 10 מ"ל של MuSC / Myoblast מצע צמיחה כדי להאט את העיכול. פרטים על הכנת מצעי הגידול MuSC/Myoblast ניתן למצוא בסעיף 2.
  14. העבירו את התערובת דרך מסננת של 70 מיקרומטר. השתמש 1x PBS כדי לשטוף את צלחת העיכול ולהריץ PBS זה דרך המסננת גם כן, על מנת לאסוף את כל התאים בצלחת העיכול.
  15. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant עם ואקום.
  16. השהה מחדש את גלולת התא עם 20 מ"ל של PBS 1x והפעל את התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר.
  17. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant עם ואקום.
  18. השתמש 20 מ"ל של MuSC / Myoblast מדיה גדילה כדי להשעות מחדש את התאים ולזרוע את התאים בצלחת פלסטיק רגילה 10 ס"מ. MuSCs לא יכולים להתחבר לתחתית הצלחת במהלך הזמן הזה ויישארו צפים בעיקר במדיה.
    הערה: זהו הציפוי המקדים הראשון על לוחות פלסטיק.
  19. לאחר שעה וחצי, מנערים לזמן קצר את הצלחת ומעבירים את הנוזל לשתי מנות מצופות קולגן בקוטר 10 ס"מ, שכל אחת מהן מכילה 10 מ"ל תרבית. כעת, ה-MuSCs יתחברו ויגדלו על הלוחות המצופים בקולגן. שנה את המדיה לאחר יומיים. מכינים צלחות מצופות קולגן כמו בשלבים 1-4 בחלק זה.
  20. לאחר יום נוסף, עוברים את התאים: מוציאים את המדיה, שוטפים את התאים פעם אחת עם PBS 1x וטריפסינים את התאים.
  21. השתמשו במצעי גידול MuSC/Myoblast כדי לשטוף את התאים מהצלחות, להעביר את התאים לצלחת פלסטיק חדשה ולדגור באינקובטור התא למשך 40 דקות.
    הערה: זהו הציפוי המקדים השני על לוחות פלסטיק.
  22. יוצקים את התרבית לצלחת פלסטיק חדשה ודגרים באינקובטור התא עוד 20 דקות.
    הערה: זהו הציפוי המקדים השלישי על לוחות פלסטיק.
  23. לאחר מכן מפצלים את הסופרנאטנט שבצלחת ל-8 צלחות מצופות קולגן בקוטר 10 ס"מ כדי לתת תרבית לתאים. יחס המעבר כאן הוא 2: 8 (1: 4). לאחר שלוש פעמים של ציפוי מקדים שתואר לעיל, המיובלסטים יכולים להגיע ליותר מ-90% טהורים. לכן, לאחר נקודה זו, אין צורך מראש צלחת כאשר עובר עוד את myoblasts.

2. הכנת מצע גדילה MuSC/מיובלסט (דוגמה להכנת מ-5 עכברים)

  1. הקריבו 5 עכברי בר צעירים ובריאים, בודדו את הטחול ושטפו את הטחול פעם אחת עם 1x PBS (עם פניצילין/סטרפטומיצין).
  2. השתמש מספריים כדי להסיר את החלקים / כתמים כהים על הטחול, אם בכלל. השליכו את הטחול אם רובו השחיר.
  3. הכניסו את כל 5 הטחול למסננת של 40 מיקרומטר על החלק העליון של צינור של 50 מ"ל.
  4. פתח חבילת מזרק סטרילית 1 מ"ל, משוך את הבוכנה, ומשליך את החבית.
  5. במסננת של 40 מיקרומטר, החזיקו את פקק הגומי והשתמשו במשענת האגודל של הבוכנה כדי לטחון ולנתק את רקמות הטחול לתאים בודדים. היזהר לא לגעת ולזהם את משענת האגודל של הבוכנה בעת קריעת חבילת המזרק.
  6. בזמן טחינת הטחול, השתמש מדי פעם ב- PBS 1x כדי לשטוף את תאי הטחול המנותקים לתוך צינור 50 מ"ל מתחת למסננת.
  7. לאחר שכל תאי הטחול נשטפו לתוך צינור 50 מ"ל דרך המסננת, צנטריפוגה את הצינור ב 500 x גרם במשך 10 דקות.
  8. השתמש 1 מ"ל של 1x חיץ ליזה של תאי דם אדומים כדי להשעות מחדש את הכדור. לשכב את תאי הדם האדומים במשך ~ 1 דקות.
    הערה: מאגר ליזה של תאי דם אדומים 10x מכיל 155 mM NH4Cl, 10 mM NaHCO3 ו- 1 mM מלח דיסודיום EDTA ב- ddH2O. יש לסנן לעיקור, ואין לבצע אוטוקלאב. יש לדלל עם ddH2O עד 1x לפני השימוש.
  9. מלא את צינור 50 מ"ל עם 1x PBS כדי להפסיק את תהליך lysing של כדוריות דם אדומות.
  10. מסננים שוב את מתלה התא עם מסננת של 40 מיקרומטר, ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות של 500 x גרם למשך 10 דקות.
  11. להשעות מחדש את התאים עם 2 מ"ל של מדיה מלאה RPMI-1640 (מדיה RPMI-1640 עם 10% FBS ופניצילין/סטרפטומיצין) עם פיפטינג עדין מאוד.
  12. הוסף עוד מדיה מלאה RPMI-1640 לתוך הצינור וערבב היטב. פזרו את תרחיף התא לעשר צלוחיות תרבית T75. נפח התרבית הסופי בכל בקבוק תרבית T75 צריך להיות 20 מ"ל.
  13. הוסיפו 10 מיקרוליטר של ציר Concanavalin-A לכל בקבוק תרבית T75 וערבבו היטב. Concanavalin-A מפעיל את התפשטות תאי T.
    הערה: מלאי Concanavalin-A הוא 4 מ"ג/מ"ל והוכן על ידי המסת Concanavalin-A ב-1x PBS. Concanavalin-A עצמו משמש כאן, ואל תבלבלו אותו עם חרוזי Concanavalin-A המשמשים במבחני CUT&Tag בהמשך.
  14. לאחר 48 שעות, להשלים כל בקבוק T75 עם עוד 20 מ"ל של RPMI-1640 מדיה מלאה, כך נפח הכולל יוסיף עד 40 מ"ל.
  15. עוד 24 שעות מאוחר יותר, לאסוף את כל התרבית בכל בקבוק T75 וצנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 3 דקות.
  16. הסופרנאטנט הוא מדיה מותנית של תאי T וניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של -20°C עד -80°C למשך עד חודשיים. יש להשליך את כדורי תאי הטחול. לפני השימוש, הפשיר את המדיה המותנית של תאי T וחטא עוד יותר את המדיה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
  17. כדי להפוך את F10 של Ham מדיה מלאה, להוסיף 100 מ"ל של FBS, 300 μL של מלאי bFGF, ו 6 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין לתוך 500 מ"ל של מדיה F10 של Ham.
    הערה: מלאי bFGF הוא 5 מיקרוגרם / מ"ל והוכן על ידי המסת bFGF במדיה F10 של Ham.
  18. ערבבו את המדיה המלאה F10 של Ham עם מדיה מותנית מסוננת של תאי T שתוארה לעיל ביחס של 1:1 כדי ליצור מדיית גידול MuSC/Myoblast.

3. CUT&Tag עם מיובלסטים (דוגמה ל-3 תגובות CUT&Tag)

  1. הכנת ריאגנטים מרכזיים
    1. לטהר את pA/G-Tn5 transposase בתוך הבית מתרבית חיידקים באמצעות שיטה14 שפורסמה. אנזים זה מגיע לצורתו הפונקציונלית רק עד שהוא מורכב עם מתאמי DNA המייצרים ספרייה. והכי חשוב, pA/G-Tn5 זמין מסחרית ממקורות רבים.
    2. האוליגוס ליצירת מתאמים מוצג בטבלה 1. באופן ספציפי, Oligo-Rev עם Oligo-A ו-Oligo-B, בהתאמה, כדי ליצור Adaptor-A ו-Adaptor-B דו-גדיליים בהתאם. את פרטי החישול להכנת המתאמים ניתן למצוא במקום אחר14.
    3. יש לדגור על Adaptor-A ו-Adaptor-B עם טרנספוזאז pA/G-Tn5 בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעתיים. לאחר מכן, טרנספוזאז זה ייקח את צורתו הפונקציונלית. בחלקים הבאים של כתב יד זה, הצורה הפונקציונלית של pA/G-Tn5 תיקרא pA/G-Tn5a.
      הערה: אם pA/G-Tn5 נרכש במקום מיוצר בבית, הקפד להבהיר אם הפריט הנקנה הוא pA/G-Tn5 המורכב עם מתאמים (במילים אחרות, מוכן לשימוש) או שזה רק האנזים pA/G-Tn5 עצמו. אם זה רק האנזים, הכינו את שני המתאמים שתוארו לעיל והרכיבו אותם על pA/G-Tn5 לפני שתשתמשו לבסוף באנזים זה עבור CUT&Tag.
    4. לקבלת המתכונים של מאגר הכריכה, חיץ הכביסה, מאגר הכביסה Dig-wash, מאגר 300-Dig ומאגר Tagmentation, הקוראים יכולים גם לעיין ב- Kaya-Okur et al.1.
    5. הכן את מאגר הקשירה, המכיל 20 mM HEPES pH 7.5, 10 mM KCl, 1 mM CaCl2 ו- 1 mM MnCl2.
    6. הכינו את מאגר השטיפה, המכיל 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM Spermidine וקוקטייל מעכב פרוטאז 1x.
    7. הפוך את הדיגיטונין לציר מרוכז ב-DMSO, ולאחר מכן הכן את מאגר Dig-wash על-ידי הוספת דיגיטונין למאגר Wash לריכוז של 0.5 מ"ג/מ"ל.
    8. הכן את מאגר הנוגדנים על ידי הוספת EDTA לריכוז של 2 mM ו- BSA לריכוז של 0.1%, לתוך מאגר Dig-wash.
    9. הכינו חיץ 300-Dig המכיל 20 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5 mM Spermidine, קוקטייל מעכב פרוטאז 1x, ו 0.1-0.5 מ"ג / מ"ל digitonin.
    10. הכן את מאגר התיוג על-ידי השלמת מאגר 300-Dig עם 10 mM MgCl2. MgCl2 יכול להפעיל את הפעילות האנזימטית של pA/G-Tn5a.
      הערה: מידע עבור חומרים אחרים מופיע בקובץ ' רשימת חומרים '.
  2. הפעלת חרוזים Concanavalin-A
    1. ערבבו 30 μL של חרוזי Concanavalin-A (10 μL לכל תגובה) לתוך 300 μL של חיץ מחייב בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הפוך מספר פעמים כדי לערבב היטב. הניחו את הצינור על מדף מגנטי. לאחר שהנוזל צלול, הסר את הסופרנטנט.
    2. הסר את הצינור מהמדף המגנטי, הוסף 300 μL של חיץ מחייב בצינור, ערבב היטב ופצל באופן שווה ל -3 צינורות של פס צינור 8-PCR. סמן כל צינור עם תגובת CUT&Tag אחת.
    3. הניחו את פס הצינור 8-PCR על מדף מגנטי והמתינו עד שהנוזל יהיה צלול.
    4. שאפו את הסופרנאטנט והוציאו את הצינורות מהמדף המגנטי. מוסיפים 10 μL של חיץ מחייב לכל צינור ומערבבים היטב. מניחים את החרוזים המוכנים על קרח או ב 4 ° C עד התאים מוכנים להמשיך.
  3. קשירת תאים לחרוזי Concanavalin-A
    1. טריפסיניזציה של מיובלסטים של עכברים בתרבית מהצלחות, שטפו את התאים פעם אחת עם RT 1x PBS ובסופו של דבר השעו מחדש את התאים במאגר Wash ב-RT. הימנעו מטריפסיניזציה יתר, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בזיקה של קרום התא לחרוזי Concanavalin-A.
    2. התאם את צפיפות התא לסביבות 7 x 105 תאים/מ"ל במאגר Wash כך ש- 100 μL של תרחיף תאים יכיל בערך 70,000 תאים, מספיק לתגובת CUT&Tag אחת.
    3. Pipet 100 μL של תרחיף התא לתוך כל צינור של פס צינור 8-PCR, אשר כבר מכיל 10 μL של חרוזי Concanavalin-A מוכנים. מערבבים היטב ודגרים על שייקר "נדנדה" למשך 10 דקות ב-RT.
    4. הניחו את פס הצינור 8-PCR על מדף מגנטי. חכו עד שיתבהר, והוציאו את הסופרנטנט.
    5. כדי להעריך אם חרוזי Concanavalin-A לכדו את התאים ביעילות, בדקו את הסופרנאטנט תחת מיקרוסקופ כדי לראות כמה תאים נותרו בסופרנטנט. לאחר שלב קשירת החרוזים Concanavalin-A, יש לראות מעט מאוד תאים או ללא תאים כלל בסופרנטנט.
  4. דגירה על התאים עם נוגדן ראשוני
    1. עבור כל דגימה, יש לדלל 1 μL של נוגדן H3K4me1 לתוך 50 μL של מאגר נוגדנים ולהוסיף את הנוגדן המדולל לכל צינור דגימה. מערבבים היטב את החרוזים עם הנוגדן המדולל על ידי היפוך הצינורות מספר פעמים. הניחו את הדגימות על שייקר "תנועת נדנדה" כדי לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: כפי שהוזכר על ידי ד"ר סטיבן הניקוף1, לא היה צורך להשתמש בפקד שלילי IgG בכל בדיקות CUT&Tag. בהשוואה ל- ChIPs, מבחני CUT&Tag מגיעים עם אות רקע נמוך בהרבה או ללא אות כלל. לכן, שימוש ב- IgG לביצוע בדיקת CUT&Tag של "בקרה שלילית" אינו מציג מידע שימושי כלשהו. לעומת זאת, שימוש בנוגדן מאומת CUT&Tag לביצוע בקרה חיובית חשוב כדי להעריך אם בדיקת CUT&Tag עבדה.
  5. דגירה על התאים עם נוגדן משני
    1. למחרת בבוקר, הניחו את הדגימות על המדף המגנטי והמתינו עד שהדגימות יתבהרו.
    2. הסר את supernatant, שהוא הנוגדן העיקרי. אין צורך לשטוף את החרוזים; יש להוסיף ישירות 50 μL של נוגדן משני מדולל (1:100) לכל צינור דגימה.
      הערה: נוגדן משני מדולל עם חיץ Dig-wash ביחס של 1:100. כדי לאפשר זיהוי pA/G-Tn5a יעיל יותר, אין להצמיד נוגדנים שניוניים למולקולות או קבוצות כגון HRP, ביוטין או פלואורופורים.
    3. מערבבים היטב ודגרים על שייקר "תנועת נדנדה" ב- RT למשך שעה אחת.
    4. החזירו את הדגימות למדף המגנטי, המתינו עד שהדגימות יתבהרו, והשליכו את הסופרנטנט.
    5. הוסף 200 μL של חיץ Dig-wash לכל צינור והפוך מספר פעמים כדי לשטוף את עודף הנוגדנים.
    6. החזירו אותו למדף המגנטי, המתינו עד שיתנקה, והוציאו את הסופרנטנט. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות כדי להסיר לחלוטין נוגדנים לא קשורים מוגזמים.
  6. דגירה על התאים עם pA/G-Tn5a
    1. לאחר השטיפה האחרונה, הניחו את הדגימות על המדף המגנטי, המתינו עד שהדגימות יתבהרו והוציאו את כל הנוזלים שבצינור. עבור כל צינור דגימה, הוסף 100 μL של מאגר 300-Dig המכיל pA/G-Tn5a ב- 0.04 מיקרומטר. ערבב היטב ודגר על שייקר התנועה נדנדה במשך שעה אחת ב- RT.
    2. הניחו על המדף המגנטי. חכו עד שהדגימות יתבהרו והוציאו את הסופרנטנט.
    3. הוסיפו 200 μL של חיץ 300-Dig לכל דגימה, ערבבו היטב והניחו על השייקר כדי לשטוף את הדגימה במשך 3 דקות ב-RT.
    4. הניחו על המדף המגנטי. חכו עד שהדגימות יתבהרו והוציאו את הסופרנטנט. חזור על כביסה זו פעמיים נוספות כדי להסיר pA/G-Tn5a מוגזם ולהוריד את הרקע.
  7. מחשוף ותיוג הגנום
    1. לאחר השטיפה האחרונה, הניחו את הדגימות על המדף המגנטי והוציאו היטב את הנוזל מהשפופרת. עבור כל דגימה, הוסף 50 μL של מאגר Tagmentation. יש לערבב היטב ולדגור במכונת PCR בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת. אין להשתמש בפונקציית חימום המכסה של מכשיר ה-PCR.
      הערה: לחלופין, בשל שחיקת החומר במהלך שלב טיהור הדנ"א הגנומי הבא, ניתן להוסיף כמה דנ"א ספייק-אין למאגר התיוג כך שהספייק-אין יופיע בתוצאות הריצוף הסופיות וניתן יהיה להשתמש בו כדי לנרמל את הנתונים. את השיטה להכנת הדנ"א הספייק-אין ולשימוש בו ניתן למצוא במקום אחר14.
  8. טיהור DNA גנומי כולל
    1. לאחר התיוג, הוסף עוד 150 μL של מאגר Tagmentation עבור כל דגימה. הנפח הכולל הוא כעת 200 μL.
    2. לאחר מכן, עבור כל דגימה, הוסף 10 μL של 0.5 M EDTA, 3 μL של 10% SDS, ו 2.5 μL של 20 מ"ג / מ"ל פרוטאינאז K. Vortex כדי לערבב היטב ולדגור ב 55 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות.
    3. יש לדחוס כל דגימה ל-200 מיקרוליטר פנול/כלורופורם בצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ומערבולת למשך 10 שניות. צנטריפוגה ברזולוציה של 18,000 x גרם למשך 5 דקות. מעבירים את השכבה העליונה לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    4. הוסף 200 μL של כלורופורם לכל צינור ומערבולת במשך 10 שניות. צנטריפוגה ברזולוציה של 18,000 x גרם למשך 5 דקות.
    5. שאפו את השכבה העליונה לתוך צינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. לאחר מכן, עבור כל דגימה, להוסיף 550 μL של 100% אתנול כדי לזרז את ה- DNA ב -80 ° C במשך 1 שעות. כדי לדמיין טוב יותר את גלולת ה- DNA, הוסף 1 μL של 20 מ"ג / מ"ל גליקוגן.
    6. צנטריפוגה במהירות מרבית (>18,000 x גרם) למשך 15 דקות כדי לגלול את הדנ"א.
    7. יש לשפוך בזהירות את הסופרנטנט, לשטוף את גלולת הגליקוגן/דנ"א עם 75% אתנול פעם אחת, ולצנטריפוגה שוב במהירות מקסימלית למשך 5 דקות.
    8. הסר את 75% אתנול והשהה מחדש את גלולת הגליקוגן/DNA עם 21 μL של ddH2O.
  9. הכנת הספרייה וריצוף
    1. הגדר את ה- PCR המכין את הספריה. כדי ליצור אינדקס של הדגימות שיש לרצף יחד, השתמש בפריימר N7XX Illumina שונה עבור כל דגימה ובפריימר אוניברסלי N5XX Illumina. אם אינדקס יותר מ 12 דגימות, אז פריימרים שונים N5XX Illumina יידרש גם כן. Illumina מספקת שנים עשר פריימרים N7XX ושמונה פריימרים N5XX, כך שהמספר הכולל של N7XX עם שילובי N5XX הוא 12 x 8 = 96. הגדרת תגובת ה-PCR מוצגת בטבלה 2.
    2. קבע באופן גס את מספר מחזור ה- PCR ב- PCR המכין ספריה לפי מספר התא המשמש במבחן CUT&Tag. בדרך כלל, עבור בדיקת CUT&Tag באמצעות 50,000-100,000 תאים, 9-12 מחזורים מספיקים למדי, ומספרי תאים בין 10,000-50,000 עשויים לדרוש עד 14 מחזורים. תוכנית ה-PCR מוצגת בטבלה 3.
      הערה: עבור רוב בדיקות CUT&Tag, אם הנוגדן פעל כראוי, אז מספר מחזור PCR בין 9-14 צריך תמיד ליצור ספרייה שימושית לריצוף. ספרייה טובה היא בדרך כלל 10-50 ng/μL (נקבע על ידי מבחן קיוביט) בריכוז ו 20-30 μL בנפח. להיפך, אם הנוגדן לא עבד בצורה יעילה וספציפית, אז רק הגדלת מספר המחזור לא יכולה להציל את הניסויים. מספרי מחזור מוגזמים אינם מועילים כלל לתוצאות ובמקום זאת מציגים יותר כפילויות PCR, אשר מאוחר יותר יסבכו את ניתוח הנתונים.
    3. השתמש בכמה חרוזי טיהור / בחירת גודל DNA הזמינים באופן מסחרי כדי לטהר את הדנ"א של הספרייה ולבחור את ה- DNA בגדלים רצויים.
    4. לדלל aliquot קטן של הספרייה מטוהרת עם מים ולהשתמש בו עבור qPCR עם פריימרים ספציפיים לוקוס כדי לבדוק העשרה כמו בניסויי ChIP-qPCR. לפני ריצוף הספריה, פעולה זו יכולה לסייע לקבוע אם CUT&Tag פעל.
    5. ביצוע ריצוף וניתוח נתונים בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: ערכות CUT&Tag זמינות באופן מסחרי מקומץ חברות, ודוגמה אחת ניתן למצוא בקובץ טבלת החומרים .

תוצאות

לפני קשירת תאים לחרוזי Concanavalin-A, בדוק את תרחיף התא מתחת למיקרוסקופ. לפיכך, לאחר הדגירה על התאים עם חרוזי Concanavalin-A, לשים את צינורות הדגימה על המדף המגנטי, ואת supernatant יש לצפות שוב באמצעות מיקרוסקופ. זאת כדי להעריך באיזו יעילות התאים נלכדו על ידי חרוזי Concanavalin-A. חיץ שטיפה המכיל 7 x 105 תאים/מ"ל ?...

Discussion

מספר התא הספציפי הנדרש בתגובת CUT&Tag מסוימת מסתמך לחלוטין על העשרת הסימנים/וריאנטים של ההיסטון או חלבונים קושרי כרומטין, שיש לבדוק. בדרך כלל עבור סימני היסטון מועשרים מאוד כגון H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac וכו ', 25,000-50,000 מיובלסטים מספיקים למדי לתגובת CUT&Tag אחת. עם זאת, כמה חלבונים נדירים קושרי כרומטין, עשויי?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDA16020400 ל- PH); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32170804 ל-PH).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
bFGFR&D Systems233-FB-025
CollagenCorning354236
Collagenase IIWorthingtonLS004177
Concanavalin-ASigma-AldrichC5275
Concanavalin-A beadsBangs LaboratoriesBP531
DigitoninSigma-Aldrich300410
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Fetal bovine serumHycloneSH30396.03
H3K4me1 antibody abcamab8895
Ham's F10 mediaThermo Fisher Scientific11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina VazymeTD903This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubesQualityardQYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripesAnosun MagneticCLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNEBM0541LFor library-making PCR reaction
pA-Tn5VazymeS603-01Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich5056489001
Proteinase KBeyotimeST535-100mg
RPMI-1640 mediaThermo Fisher ScientificC11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)Antibodies-onlineABIN101961
SpermidineSigma-AldrichS2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina VazymeTD202This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers 
VAHTS DNA Clean Beads VazymeN411Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size

References

  1. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).
  2. Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLife. 4, e09225 (2015).
  3. Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
  4. Policastro, R. A., Zentner, G. E. Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites. Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).
  5. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  6. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, e21856 (2017).
  7. Mezger, A., et al. High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution. Nat Commun. 9, 3647 (2018).
  8. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8, 14049 (2017).
  9. Nakka, K., et al. JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment. Science. 377 (6606), 666-669 (2022).
  10. Fu, X., Wang, H., Hu, P. Stem cell activation in skeletal muscle regeneration. Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).
  11. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skelet Muscle. 6, 35 (2016).
  12. Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).
  13. Fu, X., et al. Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion. Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).
  14. Li, Y., et al. Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag. STAR Protoc. 2 (3), 100751 (2021).
  15. Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).
  16. Wardle, F. C. Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod. J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).
  17. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  18. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  19. Faralli, H., et al. UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration. J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).
  20. Yang, J. H., et al. Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).
  21. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CUT TagChIPChIPChIP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved