Fare Miyoblast Araştırmalarında Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme (CUT & Tag) Testinin Kullanılması

Özet

Epigenetik alanda yeni olan araştırmacılar, CUT & Tag'i ChIP tahlillerine göre önemli ölçüde daha kolay bir alternatif bulacaklar. CUT & Tag, nadir ve birincil hücre popülasyonları üzerindeki epigenetik çalışmalardan büyük ölçüde yararlandı ve çok az hücreden yüksek kaliteli veriler üretti. Bu protokol, fare arka bacak kaslarından izole edilen fare miyoblastları üzerinde H3K4me1 CUT & Tag testlerinin gerçekleştirilmesini açıklar.

Özet

Bu protokol belgesi, yeni araştırmacılara, kromatin bağlanma faktörlerinin, histon işaretlerinin ve histon varyantlarının genomik konumlarını profillemek için Hedefler ve Etiketleme Altında Bölünme (CUT & Tag) kullanmanın tüm ayrıntılarını sağlamayı amaçlamaktadır. CUT & Tag protokolleri, fare miyoblastları ve yeni izole edilmiş kas kök hücreleri (MuSC'ler) ile çok iyi çalışır. Hücreler Concanavalin-A boncukları ile hareketsiz hale getirilebildiği sürece diğer birçok hücre tipine kolayca uygulanabilirler. CUT & Tag ile karşılaştırıldığında, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testleri zaman alıcı deneylerdir. ChIP tahlilleri, kromatik malzeme immünopresipitasyon için kullanılmadan önce kromatinin ön işlemini gerektirir. Çapraz bağlama ChIP'de (X-ChIP), kromatinin ön işlemi, kromatini parçalamak için çapraz bağlama ve sonikasyonu içerir. Doğal ChIP (N-ChIP) durumunda, parçalanmış kromatinler normal olarak Mikrokokal nükleaz (MNaz) sindirimi ile elde edilir. Hem sonikasyon hem de MNase sindirimi, ChIP deneylerine bazı önyargılar getirir. CUT & Tag tahlilleri, ChIP'lere kıyasla daha az adımda tamamlanabilir ve çok daha az hücre gerektirebilir, ancak çeşitli genomik konumlardaki transkripsiyon faktörleri veya histon işaretleri hakkında daha tarafsız bilgi sağlar. CUT & Tag, 5.000 hücreye kadar çalışabilir. ChIP'lerden daha yüksek hassasiyeti ve daha düşük arka plan sinyali nedeniyle, araştırmacılar sıralamadan sonra yalnızca birkaç milyon okumadan güvenilir tepe verileri elde etmeyi bekleyebilirler.

Giriş

CUT & Tag testi, ChIP'lerin bazı açık kusurlarını telafi etmek için icat edildi¹. ChIP'lerin iki ana dezavantajı, 1) kromatini parçalarken ortaya çıkan önyargı ve 2) düşük hücre sayılarıyla çalışma beceriksizliğidir. X-ChIP tahlilleri, kromatin fragmanlarını elde etmek için sonikasyon veya MNaz sindirimine dayanırken, N-ChIP, nükleozomları elde etmek için çoğunlukla MNaz sindirimini kullanır. Sonikasyon, promotör bölgeler² gibi rahat kromatin konumlarına karşı bir önyargı gösterir ve görünüşe göre, MNase sindirimi de gevşemiş kromatin lifleri üzerinde daha verimli çalışır. Ayrıca, bazıları MNaz sindiriminin de DNA dizisine bağlı bir önyargı gösterdiğini bildirmiştir³. Bu nedenle, ChIP tahlillerinin girdi hazırlama adımında, her türlü genomik konumdan kromatin fragmanlarını tamamen rastgele bir şekilde elde etmek imkansızdır. Ayrıca, ChIP tahlilleri normalde CUT & Tag'e kıyasla daha yüksek arka plan sinyalleri üretir ve tepe noktalarının ^1,4,5 olduğu yerleri vurgulamak için CUT & Tag'den ¹⁰ kat daha fazla okuma gerektirir. Bu, ChIP deneylerinin neden CUT & Tag'den çok daha fazla hücre ile başlaması gerektiğini açıklıyor. Hücre dizilerini incelerken bu bir sorun değildir, çünkü çok yüksek bir hücre sayısı elde etmek için tekrar tekrar geçilebilirler. Bununla birlikte, ChIP testi, nadir veya değerli birincil hücre popülasyonlarını incelemek için kesinlikle güçlü bir epigenetik araç değildir, ancak birincil hücreler açıkça daha pratik ve tıbbi etkilere sahiptir.

Uzun ve karmaşık ChIP prosedürü, bazı araştırmacıları bu tekniği öğrenmekten veya kullanmaktan caydırırken, insanlar immünositokimya (ICC) veya immünofloresan (IF) gibi daha kolay tahlillerle daha rahattır. Bir CUT & Tag testi, esasen ICC ve IF deneylerinin sürecine benzer, ancak yalnızca bir test tüpünde gerçekleşir. CUT & Tag, başlamak için parçalanmış kromatine ihtiyaç duymaz ve bunun yerine, antikor bağlanması için genomun sağlam olması gerekir¹. Bir ChIP deneyinin ilk gününde, araştırmacılar normalde, kısa kromatin parçaları antikor-boncuklar ^4,5 ile karıştırılmadan önce, sonikasyon veya MNaz sindirimi ile çekirdeklerden parçalanmış kromatinleri hazırlamak için 4 saate kadar harcarlar. Dikkate değer bir tezat olarak, bir CUT & Tag prosedürünün ilk gün iş yükü, hücreleri sadece Concanavalin-A boncuklarına hareketsiz hale getirmek ve daha sonra birincil antikoru hücre boncuklarına eklemektir. Bu sadece ~ 40 dakika^{gerektirir 1}.

Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease'in (CUT&RUN) CUT&Tag'e önemli bir alternatif olduğunu belirtmekte fayda var. CUT&RUN, CUT&TAG ile benzer bir çalışma mekanizması üzerine kurulmuştur. CUT & Tag'de, antikorlar pA / G-Tn5 transpozazı, enzimin her birinin bir kromatin parçasını keseceği ve bu arada kütüphane yapma adaptörleri ile etiketleyeceği tüm yerlere yönlendirirken, CUT & RUN'da pA / G-Tn5'in rolü, işin sadece kesme kısmını gerçekleştiren pA / G-MNaz tarafından oynanır⁶. Bu nedenle, CUT & Tag ile karşılaştırıldığında, CUT & RUN, kütüphane oluşturma adaptörlerini pA / G-MNaz parçalanmış DNA parçalarına^{yapıştırmak} için ek bir adım gerektirir ^7,8. CUT & Tag ve CUT & Run arasındaki yüksek benzerlikler nedeniyle, CUT & Tag'e aşina olan araştırmacılar, CUT & RUN'ı yetkin bir şekilde gerçekleştirmeye kendilerini kolayca adapte edeceklerdir. Ancak, CUT & Tag ve CUT & RUN arasında bazı küçük farklılıklar olduğuna dikkat edilmelidir. CUT & RUN protokolleri normalde yıkama adımlarında fiziksel tuz konsantrasyonunu (~ 150 mM) kullanırken, CUT & Tag'de 300 Dig yıkama tamponunun tuzu yüksektir. Bu nedenle, CUT & Tag, histon işaretlerinin / varyantlarının veya transkripsiyon faktörlerinin profilini çıkarırken arka planı kontrol etmede iyidir, çünkü bu proteinler DNA^1'i doğrudan ve güçlü bir şekilde bağlar. CUT & Tag, DNA'yı doğrudan bağlamayan ve kromatine zayıf afinite gösteren kromatinle ilişkili faktörlerin profilini çıkarırken sorunlarla karşılaşabilir. CUT & Tag'deki yüksek tuzlu yıkama adımları, kromatinle ilişkili faktörleri sıyırabilir ve nihai çıktıda sinyal olmamasına neden olabilir. CUT & Tag'in bazı histon olmayan / transkripsiyon olmayan faktör proteinlerini⁹ profillemek için kullanılabileceği başarılı durumlar olmasına rağmen, zayıf bağlı kromatinle ilişkili proteinleri profillemek için CUT & Tag yerine CUT & RUN'ı öneriyoruz.

Memeliler yetişkinliğe ulaştıktan sonra, iskelet kası dokuları hala kas kök hücreleri içerir. Kas yaralanması sırasında, bu kök hücreler aktive edilebilir ve hasarlı kas liflerini yeniden oluşturmak için hücre sayısı genişlemesi ve farklılaşmasına uğrayabilir¹⁰. Bu kök hücreler Kas kök/uydu hücreleri (MuSC'ler) olarak bilinir. MuSC'ler hayvanlardan izole edildikten veya kas yaralanması ile aktive edildikten sonra çoğalmaya başlarlar ve miyoblast haline gelirler.

Fare iskelet kası sindiriminden MuSC'leri elde etmek için, Vcam1 (Cd106), Cd34 ve α7-integrin (Itga7) gibi MuSC yüzey belirteçleri, floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) sırasında MuSC'leri zenginleştirmek için genellikle tek tek veya kombinasyonlar halinde ^{kullanılır11}. Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺ 'nın muhtemelen %>95 saf MuSC'ler elde etmek için en iyi belirteç kombinasyonu olduğu gösterilmiştir¹². FACS, taze kaslar sindirildikten hemen sonra saf MuSC'leri izole edebilir. Bununla birlikte, deneysel tasarım, izolasyonlarında saf MuSC'ler gerektirmiyorsa, ön kaplama, %>90 saf miyoblastlar (MuSC soyu) elde etmek için FACS'den daha uygun maliyetlidir.

Farelerden yeni izole edilen MuSC'ler, fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Ham'ın F10 ortamında verimli bir şekilde çoğalmaz. MuSC'lerin hücre sayısını daha iyi genişletmek ve yeterli miyoblast elde etmek için, FBS yerine sığır büyüme serumu (BGS) kullanılmalıdır. Bununla birlikte, BGS mevcut değilse, Ham'ın F10 tam ortamı (yaklaşık% 20 FBS içerir), miyoblast genişlemesini önemli ölçüde teşvik etmek için eşit hacimde T hücresi koşullu ortam ile karıştırılabilir¹³. Bu nedenle, bu protokol aynı zamanda T-hücresi ortamı koşullandırılmış MuSC ortamının hazırlanmasını da tanımlayacaktır.

En önemlisi, bu protokol, fare arka bacak kaslarından izole edilen fare miyoblastları üzerinde H3K4me1 CUT & Tag testlerinin gerçekleştirilmesinin tam bir örneğini sağlar. Lütfen bu protokolün diğer hücre tipleri, histon işaretleri ve histon varyantları için de geçerli olduğunu ve okuyucuların yalnızca inceledikleri spesifik histon işaretlerinin veya varyantlarının zenginleşmesine dayalı olarak vakaları için hücre sayılarını veya antikor miktarlarını optimize etmeleri gerektiğini unutmayın.

CUT & Tag veya CUT & RUN'da kullanılabilmesi için, Tn5 veya MNase'nin pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase veya pG-MNase yapmak için protein A veya protein G ile kaynaştırılması gerekir. Görünüşe göre, hem protein A hem de protein G, pA / G-Tn5 veya pA / G-MNaz üretmek için bu enzimler üzerine aynı anda kaynaştırılabilir. Protein A ve protein G, farklı türlerden IgG'lere farklı afiniteler gösterir. Bu nedenle, protein A ve protein G'yi tamamen enzim üzerine kaynaştırmak bu sorunun üstesinden gelebilir ve enzimi birden fazla türden gelen antikorlarla uyumlu hale getirebilir.

Protokol

Bu yazıda sunulan yöntemlerin tümü Guangzhou Laboratuvarı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu el yazmasının temsili sonuçlarını oluşturmak için kullanılan fareler, Guangzhou Laboratuvarı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak barındırıldı ve bakımı yapıldı.

1. Fare arka bacak kaslarından miyoblast izolasyonu (1 fare kullanma örneği)

1. Buzlu asetik asidi ddH₂O ile 0.02 M ile seyreltin ve otoklavlayın.
2. Kollajeni (sıçan kuyruğundan) 0.02 M asetik asit ile 0.1 mg / mL'ye seyreltin.
3. Bu kolajen solüsyonunu, kabın tabanını gece boyunca 37 ° C'lik bir hücre inkübatöründe kaplamak için kültür kaplarına ekleyin.
4. Kullanmadan önce, kollajen solüsyonunu çıkarın ve kabı 1x PBS ile iki kez yıkayın. Kollajen çözeltisi 8-10 kez tekrar kullanılabilir.
5. 8-12 haftalık bir fareyi kurban edin. (Yaşlı farelerin MuSC ve miyoblast verimleri düşüktür.)
6. Fareden tüm arka bacak kaslarını izole edin ve 10 cm'lik bir tabağa yerleştirin.
7. Kasları 4 kez durulamak için 1x PBS (penisilin / streptomisin ile) kullanın. Her durulamadan sonra, kasları daima yeni bir plakaya aktarın.
8. Son durulamadan sonra, PBS'yi çıkarın ve kasları makasla kıyın.
9. Kıyılmış kasları sindirmek için dispas II (1.1 U/mL) ve kollajenaz II (830 U/mL) içeren 6 mL 1x PBS ekleyin ve sindirim ~ 1.5 saat sürmelidir.
10. Sindirimi gerçekleştirmek için, kıyılmış kasları 37 ° C'lik bir su banyosunda bir tüpe aktarın veya kıyılmış kasları doğrudan yemeğin içinde bırakın ve 37 ° C'lik bir CO₂ hücreli inkübatöre yerleştirin.
11. Sindirmek için bir hücre inkübatörü kullanıyorsanız, sindirimi iyice karıştırmak için yemeği her 15-30 dakikada bir sallayın.
    NOT: Dispas II önce DMEM besiyeri ile 11 U/mL stok olarak (serum yok) ve kollajenaz II 1x PBS ile 10.000 U/mL stok olarak yapılmalıdır.
12. Sindirim tamamlandığında, sindirim karışımını iyice homojenize etmek için sindirilmiş dokuları birkaç kez yukarı ve aşağı yıkamak için 10 mL'lik bir plastik pipet kullanın.
13. Sindirimi yavaşlatmak için 10 mL MuSC / Myoblast büyüme ortamı ekleyin. MuSC/Myoblast büyüme ortamının hazırlanmasına ilişkin ayrıntılar Bölüm 2'de bulunabilir.
14. Karışımı 70 μm'lik bir süzgeçten geçirin. Sindirim plakasını durulamak için 1x PBS kullanın ve sindirim plakasındaki tüm hücreleri toplamak için bu PBS'yi süzgeçten geçirin.
15. 10 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı vakumla atın.
16. Hücre peletini 20 mL 1x PBS ile yeniden süspanse edin ve hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin.
17. 350 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı vakumla çıkarın.
18. Hücreleri yeniden süspanse etmek ve hücreleri 10 cm'lik normal bir plastik plakada tohumlamak için 20 mL MuSC / Miyoblast büyüme ortamı kullanın. MuSC'ler bu süre zarfında plakanın tabanına yapışamaz ve çoğunlukla ortamda yüzer halde kalır.
    NOT: Bu, plastik plakalar üzerindeki ilk ön kaplamadır.
19. 1,5 saat sonra, plakayı kısa bir süre sallayın ve sıvıyı, her biri 10 mL kültür içeren iki kollajen kaplı 10 cm'lik tabağa aktarın. Şimdi, MuSC'ler kollajen kaplı plakalara yapışacak ve büyüyecektir. Medyayı 2 gün sonra değiştirin. Kollajen kaplı plakalar bu bölümün 1-4 adımlarındaki gibi hazırlanır.
20. Başka bir gün sonra, hücreleri geçirin: Ortamı çıkarın, hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın ve hücreleri tripsinize edin.
21. Hücreleri plakalardan temizlemek için MuSC / Myoblast büyüme ortamını kullanın, hücreleri yeni bir plastik plakaya taşıyın ve hücre inkübatöründe 40 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu, plastik plakalar üzerindeki ikinci ön kaplamadır.
22. Kültürü yeni bir plastik tabağa dökün ve hücre inkübatöründe 20 dakika daha inkübe edin.
    NOT: Bu, plastik plakalar üzerindeki üçüncü ön kaplamadır.
23. Daha sonra hücreleri alt kültürlemek için plakadaki süpernatanı 8 kollajen kaplı 10 cm'lik tabağa bölün. Buradaki geçiş oranı 2: 8'dir (1: 4). Yukarıda açıklanan üç kez ön kaplamadan sonra, miyoblastlar %90'ın üzerinde saflığa ulaşabilir. Bu nedenle, bu noktadan sonra, miyoblastları daha fazla geçirirken ön plakaya gerek yoktur.

2. MuSC / Myoblast büyüme ortamının hazırlanması (5 fareden hazırlama örneği)

1. 5 genç ve sağlıklı vahşi tip fareyi kurban edin, dalakları izole edin ve dalakları 1x PBS (penisilin / streptomisin ile) ile bir kez durulayın.
2. Varsa dalak üzerindeki koyu renkli kısımları/lekeleri çıkarmak için makas kullanın. Çoğu siyaha dönmüşse dalağı atın.
3. 5 dalağın tümünü 50 mL'lik bir tüpün üstündeki 40 μm'lik bir süzgecin içine yerleştirin.
4. 1 mL'lik steril bir şırınga paketi açın, pistonu dışarı çekin ve namluyu atın.
5. 40 μm'lik süzgeçte, lastik tıpayı tutun ve dalak dokularını öğütmek ve tek hücrelere ayırmak için pistonun başparmak dayanağını kullanın. Şırınga paketini yırtarken pistonun başparmak desteğine dokunmamaya ve kirletmemeye dikkat edin.
6. Dalakları öğütürken, ayrışmış dalak hücrelerini süzgecin altındaki 50 mL'lik tüpe yıkamak için ara sıra 1x PBS kullanın.
7. Tüm dalak hücreleri süzgeçten 50 mL'lik tüpe atıldıktan sonra, tüpü 10 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
8. Peleti yeniden süspanse etmek için 1 mL 1x Kırmızı kan hücresi lizis tamponu kullanın. Kırmızı kan hücrelerini ~ 1 dakika boyunca parçalayın.
   NOT: 10x Kırmızı kan hücresi lizis tamponu, ddH₂O'da 155 mM NH₄Cl, 10 mM NaHCO3 ve 1 mM EDTA disodyum tuzu içerir. Sterilize etmek için filtre ve otoklav yapmayın. Kullanmadan önce ddH₂O ila 1x ile seyreltin.
9. Kırmızı kan hücrelerinin parçalanma sürecini durdurmak için 50 mL'lik tüpü 1x PBS ile doldurun.
10. Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir süzgeçle tekrar süzün ve ardından 500 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
11. Hücreleri 2 mL RPMI-1640 tam ortam (%10 FBS ve penisilin/streptomisin içeren RPMI-1640 ortamı) ile çok nazik pipetleme ile yeniden süspanse edin.
12. Tüpe daha fazla RPMI-1640 tam ortam ekleyin ve iyice karıştırın. Hücre süspansiyonunu on T75 kültür şişesine dağıtın. Her bir T75 kültür şişesindeki nihai kültür hacmi 20 mL olmalıdır.
13. Her T75 kültür şişesine 10 μL Concanavalin-A stoğu ekleyin ve iyice karıştırın. Concanavalin-A, T hücrelerinin çoğalmasını aktive eder.
    NOT: Concanavalin-A stoğu 4 mg / mL'dir ve Concanavalin-A'nın 1x PBS'de çözülmesiyle hazırlanır. Concanavalin-A'nın kendisi burada kullanılır ve daha sonra CUT & Tag testlerinde kullanılan Concanavalin-A boncukları ile karıştırmayın.
14. 48 saat sonra, her bir T75 şişesini başka bir 20 mL RPMI-1640 tam medya ile destekleyin, böylece toplam hacim 40 mL'ye kadar çıkacaktır.
15. 24 saat sonra, tüm kültürü her bir T75 şişesinde toplayın ve 3 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.
16. Süpernatant, T hücresi koşullu ortamdır ve -20 °C ila -80 °C arasında 2 aya kadar saklanabilir. Dalak hücresi peletlerini atın. Kullanmadan önce, T hücresi koşullu ortamı çözün ve ortamı 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak daha fazla sterilize edin.
17. Ham'ın F10 ortamını tam yapmak için, 500 mL Ham'ın F10 ortamına 100 mL FBS, 300 μL bFGF stoğu ve 6 mL penisilin / streptomisin ekleyin.
    NOT: bFGF stoğu 5 μg/mL'dir ve bFGF'nin Ham'ın F10 ortamında çözülmesiyle hazırlanır.
18. MuSC / Myoblast büyüme ortamı yapmak için Ham'ın F10 tam ortamını yukarıda açıklanan filtrelenmiş T hücresi koşullu ortamla 1: 1 oranında karıştırın.

3. Miyoblastlı CUT & Tag (3 CUT & Tag reaksiyonu örneği)

1. Anahtar reaktiflerin hazırlanması
   1. Yayınlanmış yöntem^14'ü kullanarak pA / G-Tn5 transpozazını kurum içinde bakteri kültüründen saflaştırın. Bu enzim, kütüphane yapan DNA adaptörleri ile monte edilene kadar işlevsel formuna ulaşır. En önemlisi, pA / G-Tn5 birçok kaynaktan ticari olarak temin edilebilir.
   2. Adaptör yapmak için kullanılan oligolar Tablo 1'de gösterilmiştir. Spesifik olarak, buna göre çift sarmallı Adaptör-A ve Adaptör-B yapmak için sırasıyla Oligo-A ve Oligo-B ile Oligo-Rev'i tavlayın. Adaptörleri yapmak için tavlama ayrıntıları başka bir yerde bulunabilir¹⁴.
   3. Adaptör-A ve Adaptör-B'yi pA/G-Tn5 transpozaz ile oda sıcaklığında (RT) 2 saat inkübe edin. Daha sonra, bu transpozaz fonksiyonel formunu alacaktır. Bu el yazmasının sonraki bölümlerinde, pA/G-Tn5'in işlevsel formu pA/G-Tn5a olarak adlandırılacaktır.
      NOT: pA / G-Tn5 şirket içi üretim yerine satın alınırsa, satın alınan ürünün adaptörlerle monte edilmiş pA / G-Tn5 olup olmadığını (başka bir deyişle kullanıma hazır) veya sadece pA / G-Tn5 enziminin kendisi olup olmadığını netleştirdiğinizden emin olun. Eğer sadece enzim ise, yukarıda açıklanan iki adaptörü hazırlayın ve son olarak bu enzimi CUT & Tag için kullanmadan önce bunları pA / G-Tn5'e monte edin.
   4. Bağlama tamponu, Yıkama tamponu, Dig-wash tamponu, 300-Dig tamponu ve Tagmentation tamponu tarifleri için okuyucular ayrıca Kaya-Okur ve ^ark.1'e başvurabilirler.
   5. 20 mM HEPES pH 7.5, 10 mM KCl, 1 mM_CaCl2 ve 1 mM MnCl2 içeren Bağlama tamponunu_{hazırlayın.}
   6. 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM Spermidin ve 1x Proteaz inhibitör kokteyli içeren Yıkama tamponunu hazırlayın.
   7. Digitonin'i DMSO'da konsantre bir stok olarak yapın ve daha sonra 0.5 mg / mL'lik bir konsantrasyona kadar Yıkama tamponuna digitonin ekleyerek Dig-wash tamponunu hazırlayın.
   8. Dig-wash tamponuna 2 mM'lik bir konsantrasyona EDTA ve %0.1'lik bir konsantrasyona BSA ekleyerek Antikor tamponu hazırlayın.
   9. 20 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5 mM Spermidin, 1x Proteaz inhibitör kokteyli ve 0.1-0.5 mg / mL digitonin içeren 300-Dig tamponu hazırlayın.
   10. 300 Dig tamponunu 10 mM MgCl₂ ile destekleyerek Tagmentation tamponunu hazırlayın. _MgCl2 , pA/G-Tn5a'nın enzimatik aktivitesini aktive edebilir.
       NOT: Diğer malzemeler için bilgiler Malzeme Tablosu dosyasında verilmiştir.
2. Concanavalin-A boncuk aktivasyonu
   1. 30 μL Concanavalin-A boncuklarını (her reaksiyon için 10 μL) 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde 300 μL Bağlayıcı tampona karıştırın. İyice karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. Tüpü manyetik bir rafa koyun. Sıvı berraklaştıktan sonra süpernatanı çıkarın.
   2. Tüpü manyetik raftan çıkarın, tüpe 300 μL Bağlayıcı tampon ekleyin, iyice karıştırın ve 8-PCR tüp şeridinden 3 tüpe eşit şekilde bölün. Her tüpü bir CUT & Tag reaksiyonu ile belirleyin.
   3. 8-PCR tüp şeridini manyetik bir rafa koyun ve sıvı berraklaşana kadar bekleyin.
   4. Süpernatanı aspire edin ve tüpleri manyetik raftan çıkarın. Her tüpe 10 μL Bağlayıcı tampon ekleyin ve iyice karıştırın. Hazırlanan boncukları, hücreler ilerlemeye hazır olana kadar buzun üzerine veya 4 °C'ye yerleştirin.
3. Hücrelerin Concanavalin-A boncuklarına bağlanması
   1. Kültürlenmiş fare miyoblastlarını plakalardan tripnize edin, hücreleri bir kez RT 1x PBS ile yıkayın ve sonunda hücreleri RT'de Yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Bu, hücre zarının Concanavalin-A boncuklarına afinitesini tehlikeye atabileceğinden aşırı tripsinizasyondan kaçının.
   2. Yıkama tamponunda hücre yoğunluğunu yaklaşık 7 x 10⁵ hücre/mL olarak ayarlayın, böylece 100 μL hücre süspansiyonu yaklaşık 70.000 hücre içerir, bu da bir CUT & Tag reaksiyonu için yeterlidir.
   3. Halihazırda 10 μL hazırlanmış Concanavalin-A boncukları içeren 8-PCR tüp şeridinin her bir tüpüne 100 μL hücre süspansiyonu pipetleyin. İyice karıştırın ve RT'de 10 dakika boyunca bir "tahterevalli hareketi" çalkalayıcıda inkübe edin.
   4. 8-PCR tüp şeridini manyetik bir rafa koyun. Temizlenene kadar bekleyin ve süpernatanı çıkarın.
   5. Concanavalin-A boncuklarının hücreleri verimli bir şekilde ayırıp ayırmadığını değerlendirmek için, süpernatantta kaç hücre kaldığını görmek için süpernatanı mikroskop altında kontrol edin. Concanavalin-A boncuk bağlama adımından sonra, süpernatantta çok az hücre gözlenmeli veya hiç hücre gözlenmemelidir.
4. Hücrelerin bir primer antikor ile inkübe edilmesi
   1. Her numune için, 1 μL H3K4me1 antikorunu 50 μL Antikor tamponuna seyreltin ve seyreltilmiş antikoru her numune tüpüne ekleyin. Tüpleri birkaç kez ters çevirerek boncukları seyreltilmiş antikor ile iyice karıştırın. Numuneleri gece boyunca 4 °C'de inkübe etmek için "tahterevalli hareketi" çalkalayıcıya koyun.
      NOT: Dr. Steven Henikoff¹ tarafından belirtildiği gibi, tüm CUT & Tag testlerinde bir IgG negatif kontrol kullanmak gerekli değildi. ChIP'lerle karşılaştırıldığında, CUT & Tag tahlilleri çok daha düşük arka plan sinyali ile gelir veya hiç arka plan sinyali yoktur. Bu nedenle, bir "negatif kontrol" CUT & Tag testi gerçekleştirmek için IgG'yi kullanmak herhangi bir yararlı bilgi sunmaz. Buna karşılık, pozitif bir kontrol gerçekleştirmek için CUT & Tag onaylı bir antikor kullanmak, CUT & Tag testinin işe yarayıp yaramadığını değerlendirmek için önemlidir.
5. Hücrelerin ikincil bir antikor ile inkübe edilmesi
   1. Ertesi gün sabah, numuneleri manyetik rafa koyun ve numuneler temizlenene kadar bekleyin.
   2. Birincil antikor olan süpernatanı çıkarın. Boncukları yıkamaya gerek yoktur; Her numune tüpüne doğrudan 50 μL seyreltilmiş (1:100) ikincil antikor ekleyin.
      NOT: İkincil antikor, 1:100 oranında Dig-wash tamponu ile seyreltilir. Daha etkili pA / G-Tn5a tanımına izin vermek için, ikincil antikorlar HRP, biotin veya floroforlar gibi herhangi bir molekül veya grupla konjuge edilmemelidir.
   3. İyice karıştırın ve RT'de "tahterevalli hareketi" çalkalayıcıda 1 saat inkübe edin.
   4. Numuneleri manyetik rafa geri koyun, numuneler temizlenene kadar bekleyin ve süpernatanı atın.
   5. Her tüpe 200 μL Dig-wash tamponu ekleyin ve aşırı antikorları yıkamak için birkaç kez ters çevirin.
   6. Manyetik rafa geri koyun, temizlenene kadar bekleyin ve süpernatanı çıkarın. Aşırı bağlanmamış antikorları tamamen çıkarmak için bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
6. Hücrelerin pA / G-Tn5a ile inkübe edilmesi
   1. Son yıkamadan sonra numuneleri manyetik rafa koyun, numuneler temizlenene kadar bekleyin ve tüpteki tüm sıvıyı çıkarın. Her numune tüpü için, 0,04 μM'de pA/G-Tn5a içeren 100 μL 300-Dig tamponu ekleyin. İyice karıştırın ve RT'de 1 saat tahterevalli hareket çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
   2. Manyetik rafa koyun. Numuneler temizlenene kadar bekleyin ve süpernatanı çıkarın.
   3. Her numuneye 200 μL 300 Dig tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve numuneyi RT'de 3 dakika yıkamak için çalkalayıcıya yerleştirin.
   4. Manyetik rafa koyun. Numuneler temizlenene kadar bekleyin ve süpernatanı çıkarın. Aşırı pA/G-Tn5a'yı gidermek ve arka planı alçaltmak için bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
7. Genomların bölünmesi ve etiketlenmesi
   1. Son yıkamadan sonra, numuneleri manyetik rafa koyun ve tüpteki sıvıyı iyice pipetleyin. Her örnek için 50 μL Etiketleme tamponu ekleyin. İyice karıştırın ve bir PCR makinesinde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. PCR makinesinin kapak ısıtma fonksiyonunu kullanmayın.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, bir sonraki genomik DNA saflaştırma adımı sırasında materyalin aşınması nedeniyle, bazı spike-in DNA'ları Tagmentation tamponuna eklenebilir, böylece spike-in nihai dizileme sonuçlarında görünür ve verileri normalleştirmek için kullanılabilir. Spike-in DNA'yı hazırlama ve kullanma yöntemi başka bir yerde bulunabilir¹⁴.
8. Toplam genomik DNA saflaştırması
   1. Etiketlemeden sonra, her numune için 150 μL daha Etiketleme tamponu ekleyin. Toplam hacim şimdi 200 μL'dir.
   2. Daha sonra, her numune için 10 μL 0.5 M EDTA, 3 μL% 10 SDS ve 2.5 μL 20 mg / mL Proteinaz K. Vorteks ekleyerek iyice karıştırın ve 55 ^° C'de 2 saat inkübe edin.
   3. Her numuneyi 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde 200 μL fenol/kloroforma pipetleyin ve 10 saniye boyunca vorteksleyin. 18.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Üst katmanı yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
   4. Her tüpe 200 μL kloroform ekleyin ve 10 saniye boyunca girdaplayın. 18.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   5. Üst tabakayı yeni bir 1,5 mL'lik santrifüj tüpüne aspire edin. Ardından, DNA'yı 1 saat boyunca -80 °C'de çökeltmek için her numune için 550 μL %100 etanol ekleyin. DNA peletini daha iyi görselleştirmek için 1 μL 20 mg/mL glikojen ekleyin.
   6. DNA'yı peletlemek için 15 dakika boyunca maksimum hızda (>18.000 x g) santrifüjleyin.
   7. Süpernatanı dikkatlice dökün, glikojen/DNA peletini %75 etanol ile bir kez yıkayın ve 5 dakika boyunca maksimum hızda tekrar santrifüjleyin.
   8. % 75 etanolü çıkarın ve glikojen / DNA peletini 21 μL ddH₂O ile yeniden süspanse edin.
9. Kütüphane hazırlama ve sıralama
   1. Kütüphane hazırlama PCR'sini ayarlayın. Birlikte sıralanacak numuneleri indekslemek için, her numune için farklı bir N7XX Illumina astarı ve evrensel bir N5XX Illumina astarı kullanın. 12'den fazla numunenin indekslenmesi durumunda, farklı N5XX Illumina primerleri de gerekli olacaktır. Illumina, on iki N7XX primer ve sekiz N5XX primer sağlar, bu nedenle N5XX kombinasyonlarına sahip toplam N7XX sayısı 12 x 8 = 96'dır. PCR reaksiyon kurulumu Tablo 2'de gösterilmektedir.
   2. CUT & Tag testinde kullanılan hücre numarasına göre kütüphane hazırlama PCR'deki PCR döngü numarasını kabaca belirleyin. Normalde, 50.000-100.000 hücre kullanan bir CUT & Tag testi için 9-12 döngü oldukça yeterlidir ve 10.000-50.000 arasındaki hücre sayıları 14 döngüye kadar gerektirebilir. PCR programı Tablo 3'te gösterilmektedir.
      NOT: Çoğu CUT & Tag testi için, antikor düzgün bir şekilde çalıştıysa, 9-14 arasındaki bir PCR döngü numarası her zaman dizileme için yararlı bir kitaplık oluşturmalıdır. İyi bir kütüphane normalde konsantrasyonda 10-50 ng/μL (Qubit testi ile belirlenir) ve hacim olarak 20-30 μL'dir. Aksine, eğer antikor verimli ve spesifik bir şekilde çalışmadıysa, o zaman sadece döngü sayısını artırmak deneyleri kurtaramaz. Aşırı döngü sayıları sonuçlara hiçbir fayda sağlamaz ve bunun yerine daha sonra veri analizini karmaşıklaştıracak daha fazla PCR kopyası sunar.
   3. Kütüphane DNA'sını saflaştırmak ve istenen boyutlardaki DNA'yı seçmek için piyasada bulunan bazı DNA saflaştırma/boyut seçme boncuklarını kullanın.
   4. Saflaştırılmış kütüphanenin küçük bir alikotunu suyla seyreltin ve ChIP-qPCR deneylerinde olduğu gibi zenginleştirmeleri kontrol etmek için lokusa özgü primerlerle qPCR için kullanın. Kitaplığı sıralamadan önce, bu, CUT & Tag'in çalışıp çalışmadığını belirlemeye yardımcı olabilir.
   5. Üreticinin talimatlarına göre sıralama ve veri analizi yapın.
      NOT: CUT & Tag kitleri ticari olarak birkaç şirketten temin edilebilir ve bir örnek Malzeme Tablosu dosyasında bulunabilir.

Sonuçlar

Hücreleri Concanavalin-A boncuklarına bağlamadan önce, mikroskop altında hücre süspansiyonunu kontrol edin. Buna göre, hücreleri Concanavalin-A boncukları ile inkübe ettikten sonra, numune tüplerini manyetik rafa koyun ve süpernatant bir mikroskop kullanılarak tekrar gözlemlenmelidir. Bu, hücrelerin Concanavalin-A boncukları tarafından ne kadar verimli bir şekilde yakalandığını değerlendirmek içindir. 7 x 10⁵ hücre/mL içeren yıkama tamponu mikroskop altında Şe...

Tartışmalar

Belirli bir CUT & Tag reaksiyonunda gerekli olan spesifik hücre sayısı, tamamen test edilecek histon işaretlerinin / varyantlarının veya kromatin bağlayıcı proteinlerin zenginleştirilmesine dayanır. Normalde H3K4me1, H3K4me3 ve H3K27ac gibi çok zenginleştirilmiş histon işaretleri için 25.000-50.000 miyoblast bir CUT & Tag reaksiyonu için oldukça yeterlidir. Bununla birlikte, bazı nadir kromatin bağlayıcı proteinler 250.000'e kadar hücre gerektirebilir. CUT & Tag tahlillerinde kullanılan hücre say...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size