Uso del ensayo de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag) en la investigación de mioblastos de ratón

Resumen

Los investigadores nuevos en el campo de la epigenética encontrarán en CUT&Tag una alternativa significativamente más fácil que los ensayos ChIP. CUT&Tag ha beneficiado enormemente a los estudios epigenéticos en poblaciones de células raras y primarias, generando datos de alta calidad a partir de muy pocas células. Este protocolo describe la realización de ensayos H3K4me1 CUT&Tag en mioblastos de ratón aislados de músculos de las extremidades posteriores de ratón.

Resumen

Este documento de protocolo tiene como objetivo proporcionar a los nuevos investigadores todos los detalles sobre el uso de Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) para perfilar las ubicaciones genómicas de los factores de unión a la cromatina, las marcas de histonas y las variantes de histonas. Los protocolos CUT&Tag funcionan muy bien con mioblastos de ratón y células madre musculares (MuSC) recién aisladas. Se pueden aplicar fácilmente a muchos otros tipos de células, siempre y cuando las células puedan ser inmovilizadas por perlas de concanavalina-A. En comparación con CUT&Tag, los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) son experimentos que requieren mucho tiempo. Los ensayos ChIP requieren el tratamiento previo de la cromatina antes de que el material cromático pueda utilizarse para la inmunoprecipitación. En la reticulación de la ChIP (X-ChIP), el pretratamiento de la cromatina implica la reticulación y la sonicación para fragmentar la cromatina. En el caso de la ChIP nativa (N-ChIP), las cromatinas fragmentadas se logran normalmente por digestión de nucleasa microcócica (MNasa). Tanto la sonicación como la digestión con MNasa introducen cierto sesgo en los experimentos de ChIP. Los ensayos CUT&Tag se pueden completar en menos pasos y requieren muchas menos células en comparación con los ChIP, pero proporcionan información más imparcial sobre los factores de transcripción o las marcas de histonas en varias ubicaciones genómicas. CUT&Tag puede funcionar con tan solo 5.000 celdas. Debido a su mayor sensibilidad y menor señal de fondo que los ChIPs, los investigadores pueden esperar obtener datos de picos confiables a partir de solo varios millones de lecturas después de la secuenciación.

Introducción

El ensayo CUT&Tag se inventó para compensar algunos defectos evidentes de las ChIPs¹. Las dos principales desventajas de los ChIP son 1) el sesgo introducido al fragmentar la cromatina y 2) la incompetencia para trabajar con un número bajo de células. Los ensayos X-ChIP se basan en la sonicación o en la digestión de MNasa para obtener fragmentos de cromatina, mientras que los N-ChIP utilizan principalmente la digestión de MNasa para obtener nucleosomas. La sonicación muestra un sesgo hacia las ubicaciones relajadas de la cromatina, como las regiones promotoras², y aparentemente, la digestión de la MNasa también funciona ....

Protocolo

Los métodos presentados en este manuscrito están todos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio de Guangzhou. Los ratones utilizados para generar los resultados representativos de este manuscrito se alojaron y mantuvieron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio de Guangzhou.

1. Aislamiento de mioblastos de los músculos de las extremidades traseras del ratón (Ejemplo de uso de 1 ratón)

1. Diluir el ácido acético glacial con ddH₂O a 0,02 M y esterilizarlo en autoclave.
2. Diluir colágeno (de cola de ....

Discusión

El número de células específico requerido en una determinada reacción CUT&Tag depende completamente del enriquecimiento de las marcas/variantes de histonas o proteínas de unión a la cromatina que se van a analizar. Normalmente, para marcas de histonas muy enriquecidas como H3K4me1, H3K4me3 y H3K27ac, etcétera, 25.000-50.000 mioblastos son suficientes para una reacción CUT&Tag. Sin embargo, algunas proteínas raras de unión a la cromatina pueden requerir hasta 250.000 células. El número de células utilizado en.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size