Utilizzo del test Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) nella ricerca sui mioblasti di topo

Riepilogo

I ricercatori che non conoscono il campo epigenetico troveranno CUT&Tag un'alternativa significativamente più semplice ai saggi ChIP. CUT&Tag ha apportato enormi benefici agli studi epigenetici su popolazioni cellulari rare e primarie, generando dati di alta qualità da pochissime cellule. Questo protocollo descrive l'esecuzione di saggi H3K4me1 CUT&Tag su mioblasti di topo isolati dai muscoli degli arti posteriori di topo.

Abstract

Questo documento protocollare mira a fornire ai nuovi ricercatori tutti i dettagli sull'utilizzo di Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) per profilare le posizioni genomiche dei fattori di legame della cromatina, dei segni istonici e delle varianti istoniche. I protocolli CUT&Tag funzionano molto bene con i mioblasti di topo e le cellule staminali muscolari (MuSC) appena isolate. Possono essere facilmente applicati a molti altri tipi di cellule, purché le cellule possano essere immobilizzate dalle perle di Concanavalina-A. Rispetto a CUT&Tag, i saggi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) sono esperimenti che richiedono molto tempo. I saggi ChIP richiedono il pretrattamento della cromatina prima che il materiale cromatico possa essere utilizzato per l'immunoprecipitazione. Nella ChIP reticolante (X-ChIP), il pretrattamento della cromatina comporta la reticolazione e la sonicazione per frammentare la cromatina. Nel caso della ChIP nativa (N-ChIP), le cromatine frammentate sono normalmente ottenute dalla digestione della nucleasi micrococcica (MNasi). Sia la sonicazione che la digestione MNasi introducono alcune distorsioni negli esperimenti ChIP. I saggi CUT&Tag possono essere completati in meno passaggi e richiedono molte meno cellule rispetto ai ChIP, ma forniscono informazioni più imparziali sui fattori di trascrizione o sui marcatori istonici in varie posizioni genomiche. CUT&Tag può funzionare con un minimo di 5.000 celle. A causa della sua maggiore sensibilità e del segnale di fondo inferiore rispetto ai ChIP, i ricercatori possono aspettarsi di ottenere dati di picco affidabili da soli diversi milioni di letture dopo il sequenziamento.

Introduzione

Il saggio CUT&Tag è stato inventato per compensare alcuni difetti evidenti dei ChIP¹. I due principali svantaggi dei ChIP sono 1) la distorsione introdotta durante la frammentazione della cromatina e 2) l'incompetenza nel lavorare con un basso numero di cellule. I saggi X-ChIP si basano sulla sonicazione o sulla digestione MNasi per ottenere frammenti di cromatina, mentre N-ChIP utilizza principalmente la digestione MNasi per ottenere nucleosomi. La sonicazione mostra una tendenza verso le posizioni rilassate della cromatina come le regioni^{promotrici 2} e, a quanto pare, la digestione della MNasi funziona anche in modo pi....

Protocollo

I metodi presentati in questo manoscritto sono tutti approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Laboratorio di Guangzhou. I topi utilizzati per generare i risultati rappresentativi di questo manoscritto sono stati alloggiati e mantenuti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Laboratorio di Guangzhou.

1. Isolamento dei mioblasti dai muscoli degli arti posteriori del topo (Esempio di utilizzo di 1 topo)

1. Diluire l'acido acetico glaciale con ddH₂O a 0,02 M e sterilizzarlo in autoclave.
2. Diluire il collagene (....

Discussione

Il numero di cellule specifico richiesto in una determinata reazione CUT&Tag si basa completamente sull'arricchimento dei marcatori/varianti istoniche o delle proteine leganti la cromatina che devono essere testate. Normalmente per marcature istoniche molto arricchite come H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac ecc., 25.000-50.000 mioblasti sono abbastanza sufficienti per una reazione CUT&Tag. Tuttavia, alcune rare proteine leganti la cromatina potrebbero richiedere fino a 250.000 cellule. Il numero di cellule utilizzato nei saggi C.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size