Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

Resumo

Pesquisadores novos no campo epigenético encontrarão no CUT&Tag uma alternativa significativamente mais fácil aos ensaios ChIP. A CUT&Tag beneficiou tremendamente os estudos epigenéticos em populações de células raras e primárias, gerando dados de alta qualidade a partir de muito poucas células. Este protocolo descreve a realização de ensaios H3K4me1 CUT&Tag em mioblastos de camundongos isolados de músculos posteriores de camundongos.

Resumo

Este artigo de protocolo tem como objetivo fornecer aos novos pesquisadores todos os detalhes do uso de Clivagem sob Alvos e Tagmentação (CUT&Tag) para traçar o perfil das localizações genômicas de fatores de ligação à cromatina, marcas de histonas e variantes de histonas. Os protocolos CUT&Tag funcionam muito bem com mioblastos de camundongos e células-tronco musculares (MuSCs) recém-isoladas. Eles podem ser facilmente aplicados a muitos outros tipos de células, desde que as células possam ser imobilizadas por contas de Concanavalina-A. Em comparação com o CUT&Tag, os ensaios de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) são experimentos demorados. Os ensaios ChIP requerem o pré-tratamento da cromatina antes que o material cromático possa ser usado para imunoprecipitação. Na reticulação ChIP (X-ChIP), o pré-tratamento da cromatina envolve reticulação e sonicação para fragmentar a cromatina. No caso do ChIP nativo (N-ChIP), as cromatinas fragmentadas são normalmente obtidas pela digestão da nuclease microcócica (MNase). Tanto a sonicação quanto a digestão da MNase introduzem algum viés nos experimentos ChIP. Os ensaios CUT&Tag podem ser concluídos em menos etapas e requerem muito menos células em comparação com os ChIPs, mas fornecem informações mais imparciais sobre fatores de transcrição ou marcas de histonas em vários locais genômicos. O CUT&Tag pode funcionar com apenas 5.000 células. Devido à sua maior sensibilidade e menor sinal de fundo do que os ChIPs, os pesquisadores podem esperar obter dados de pico confiáveis de apenas alguns milhões de leituras após o sequenciamento.

Introdução

O ensaio CUT&Tag foi inventado para compensar algumas falhas evidentes dos ChIPs¹. As duas principais desvantagens dos ChIPs são 1) o viés introduzido ao fragmentar a cromatina e 2) a incompetência para trabalhar com baixo número de células. Os ensaios X-ChIP dependem da sonicação ou da digestão da MNase para obter fragmentos de cromatina, enquanto o N-ChIP usa principalmente a digestão da MNase para obter nucleossomos. A sonicação mostra um viés para locais de cromatina relaxados, como regiões promotoras² e, aparentemente, a digestão da MNase também funciona de forma mais eficiente em fibras de cromatina relaxadas. Além....

Protocolo

Os métodos apresentados neste manuscrito são todos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Laboratório de Guangzhou. Os camundongos usados para gerar os resultados representativos deste manuscrito foram alojados e mantidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Laboratório de Guangzhou.

1. Isolamento de mioblastos dos músculos dos membros posteriores do camundongo (Exemplo de uso de 1 camundongo)

1. Dilua o ácido acético glacial com ddH₂O a 0,02 M e autoclave-o.
2. Dilua o colágeno (da cauda de rato) a 0,1 mg / mL com ácido acé....

Discussão

O número específico de células necessário em uma determinada reação CUT&Tag depende completamente do enriquecimento das marcas/variantes de histonas ou proteínas de ligação à cromatina que devem ser testadas. Normalmente, para marcas de histonas muito enriquecidas, como H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac, etc., 25.000-50.000 mioblastos são suficientes para uma reação CUT&Tag. No entanto, algumas proteínas raras de ligação à cromatina podem exigir até 250.000 células. O número de células usado nos ensaios CUT.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size