在小鼠成肌细胞研究中使用靶标和标记下的切割（CUT&Tag）测定

摘要

刚进入表观遗传学领域的研究人员会发现 CUT&Tag 是 ChIP 检测的明显更容易的替代品。CUT&Tag极大地促进了稀有细胞群和原代细胞群的表观遗传学研究，从极少数细胞中生成了高质量的数据。该协议描述了在从小鼠后肢肌肉分离的小鼠成肌细胞上进行H3K4me1 CUT和Tag测定。

摘要

该协议论文旨在为新研究人员提供使用靶标和标记下的切割（CUT&Tag）来分析染色质结合因子，组蛋白标记和组蛋白变体的基因组位置的全部详细信息。CUT&Tag协议对小鼠成肌细胞和新鲜分离的肌肉干细胞（MuSCs）效果非常好。只要细胞可以被刀豆球-A珠固定，它们就可以很容易地应用于许多其他细胞类型。与CUT&Tag相比，染色质免疫沉淀（ChIP）测定是耗时的实验。ChIP 检测需要先对染色质进行预处理，然后才能将染色质材料用于免疫沉淀。在交联 ChIP （X-ChIP） 中，染色质的预处理涉及交联和超声处理以片段化染色质。在天然 ChIP （N-ChIP） 的情况下，片段化的染色质通常通过微球菌核酸酶 （MNase） 消化来实现。超声处理和 MNase 酶解都会给 ChIP 实验带来一些偏差。与ChIPs相比，CUT&Tag检测可以在更少的步骤内完成，并且需要的细胞要少得多，但可以提供有关不同基因组位置的转录因子或组蛋白标记的更公正的信息。CUT&Tag可以处理低至5,000个单元格。由于其比 ChIP 具有更高的灵敏度和更低的背景信号，因此研究人员有望在测序后仅从数百万个reads中获得可靠的峰数据。

引言

CUT&Tag 检测的发明是为了弥补 ChIPs¹ 的一些明显缺陷。ChIP 的两个主要缺点是 1） 染色质片段化时引入的偏差和 2） 无法处理低细胞数。X-ChIP 检测依靠超声处理或 MNase 消化来获得染色质片段，而 N-ChIP 主要使用 MNase 消化来获得核小体。超声处理显示偏向于松弛的染色质位置，例如启动子区域²，显然，MNase 消化对松弛的染色质纤维也更有效。此外，一些报道称，MNase消化也显示出DNA序列依赖性偏倚^3。因此，在 ChIP 检测的起始制备步骤中，不可能以完全随机的方式从各种基因组位置获得染色质片段。此外，与 CUT&Tag 相比，ChIP 检测通常产生更高的背景信号，并且需要比 CUT&Tag 多 10 倍以上的读取才能在峰为^1、4、5 的地方突出。这就解释了为什么 ChIP 实验必须从比 CUT&Tag 多得多的细胞开始。在研究细胞系时，这不是问题，因为它们可以重复传代以获得非常高的细胞数量。然而，ChIP 检测绝对不是研究稀有或珍贵原代细胞群的强大表观遗传学工具，尽管原代细胞显然具有更多的实用和医学意义。

虽然漫长而复杂的 ChIP 程序使一些研究人员不愿学习或使用这种技术，但人们更习惯于使用免疫细胞化学 （ICC） 或免疫荧光 （IF） 等更简单的检测方法。CUT&Tag检测基本上类似于ICC和IF实验的过程，但仅在试管中进行。CUT&Tag一开始就不需要片段化的染色质，相反，基因组必须完整才能结合抗体¹。在 ChIP 实验的第一天，研究人员通常花费长达 4 小时的时间通过超声处理或 MNase 消化从细胞核中制备碎片化的染色质，然后才能将短染色质片段与抗体珠混合 ^4,5。与此形成鲜明对比的是，CUT&Tag程序的第一天工作量是将细胞固定到刀豆球蛋白A珠上，然后将一抗添加到细胞珠上。这只需要 ~40 分钟¹。

值得一提的是，使用核酸酶在靶点下的切割和释放（CUT&RUN）是CUT&Tag的重要替代品。CUT&RUN是基于与CUT&Tag类似的工作机制建立的。在 CUT&Tag 中，抗体将 pA/G-Tn5 转座酶引导到酶各自切出一段染色质的所有位置，同时用造库接头标记它，而在 CUT&RUN 中，pA/G-Tn5 的作用由 pA/G-MNase 扮演，它只执行工作的切割部分⁶。因此，与CUT&Tag相比，CUT&RUN需要一个额外的步骤，即将造文接头粘附到pA/G-MNase片段化的^{DNA片段上7,8}。由于 CUT&Tag 和 CUT&RUN 之间的高度相似性，熟悉 CUT&Tag 的研究人员很容易适应熟练执行 CUT&RUN。但是，应该注意的是，CUT&Tag 和 CUT&RUN 之间存在一些细微的差异。CUT&RUN协议通常在洗涤步骤中使用盐的物理浓度（~150 mM），而在CUT&Tag中，300-Dig洗涤缓冲液的盐含量很高。因此，在分析组蛋白标记/变异或转录因子时，CUT&Tag善于控制背景，因为这些蛋白质直接且强烈地结合DNA¹。CUT&Tag在分析染色质相关因子时可能会遇到问题，这些因子不直接结合DNA并且对染色质的亲和力较弱。CUT&Tag中的高盐洗涤步骤可能会剥离染色质相关因子，并在最终输出中导致没有信号。尽管有成功的案例表明，CUT&Tag可用于分析一些非组蛋白/非转录因子蛋白⁹，但我们仍然建议使用CUT&RUN而不是CUT&Tag来分析弱结合的染色质相关蛋白。

哺乳动物成年后，它们的骨骼肌组织仍然含有肌肉干细胞。在肌肉损伤期间，这些干细胞可以被激活并经历细胞数量的扩展和分化，以再生受损的肌肉纤维¹⁰。这些干细胞被称为肌肉干细胞/卫星细胞（MuSCs）。MuSCs从动物中分离出来或一旦被肌肉损伤激活，它们就会开始增殖并成为成肌细胞。

为了从小鼠骨骼肌消化物中获得 MuSC，在荧光激活细胞分选 （FACS） ¹¹ 期间，通常单独或组合使用 MuSC 表面标记物，如 Vcam1 （Cd106）、Cd34 和 α7-整合素 （Itga7），以富集 MuSCs11。研究表明，Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺ 可能是获得>95%纯度MuSCs¹²的最佳标记组合。FACS可以在新鲜肌肉消化后立即分离出纯MuSCs。然而，如果实验设计不需要在分离时直接使用纯 MuSC，则预铺板比 FACS 更具成本效益，以获得 >90% 纯成肌细胞（MuSC 后代）。

从小鼠中新鲜分离的 MuSC 在补充有胎牛血清 （FBS） 的 Ham's F10 培养基中不能有效增殖。为了更好地增加 MuSC 的细胞数量并获得足够的成肌细胞，应使用牛生长血清 （BGS） 代替 FBS。然而，如果 BGS 不可用，可以将 Ham 的 F10 全培养基（含有约 20% FBS）与等体积的 T 细胞条件培养基混合，以显着促进成肌细胞扩增¹³。因此，该协议还将描述T细胞培养基条件的MuSC培养基的制备。

最重要的是，该协议提供了在从小鼠后肢肌肉中分离的小鼠成肌细胞上执行H3K4me1 CUT和Tag测定的完整示例。请注意，该协议也适用于其他细胞类型以及组蛋白标记和组蛋白变体，读者只需根据他们研究的特定组蛋白标记或变体的富集来优化其病例的细胞数量或抗体量。

为了在CUT&Tag或CUT&RUN中使用，Tn5或MNase需要与蛋白A或蛋白G融合，形成pA-Tn5、pG-Tn5、pA-MNase或pG-MNase。显然，蛋白 A 和蛋白 G 可以同时融合到这些酶上，产生 pA/G-Tn5 或 pA/G-MNase。蛋白 A 和蛋白 G 对不同物种的 IgG 的亲和力不同。因此，将蛋白 A 和蛋白 G 完全融合到酶上可以克服这个问题，并使酶与来自多个物种的抗体兼容。

研究方案

本文介绍的方法均得到广州实验室机构动物护理和使用委员会的认可。用于生成本手稿代表性结果的小鼠按照广州实验室机构动物护理和使用委员会的指南进行饲养和维护。

1. 从小鼠后肢肌肉中分离成肌细胞（使用 1 只小鼠的示例）

1. 用ddH₂O稀释冰醋酸至0.02M，然后高压灭菌。
2. 用0.02M乙酸将胶原蛋白（来自大鼠尾巴）稀释至0.1mg / mL。
3. 将该胶原蛋白溶液添加到培养皿中，以在37°C细胞培养箱中覆盖培养皿底部过夜。
4. 使用前，去除胶原蛋白溶液并用1x PBS清洗培养皿两次。胶原蛋白溶液可重复使用8-10次。
5. 牺牲一只 8-12 周大的老鼠。（老年小鼠的MuSCs和成肌细胞产量低。
6. 将小鼠的所有后肢肌肉分离并放入10厘米的培养皿中。
7. 使用 1x PBS（含青霉素/链霉素）冲洗肌肉 4 次。每次冲洗后，始终将肌肉转移到新的板中。
8. 最后冲洗后，去除 PBS 并用剪刀切碎肌肉。
9. 加入 6 mL 含有分散酶 II （1.1 U/mL） 和胶原酶 II （830 U/mL） 的 1x PBS 以消化切碎的肌肉，消化应持续 ~1.5 小时。
10. 为了进行消化，将切碎的肌肉转移到37°C水浴中的管中，或者直接将切碎的肌肉留在培养皿内，并将其置于37°C CO₂ 细胞培养箱中。
11. 如果使用细胞培养箱进行消化，则每 15-30 分钟摇晃一次培养皿以充分混合消化物。
    注:分散酶 II 应首先用 DMEM 培养基（无血清）制备为 11 U/mL 储备液，胶原酶 II 应用 1x PBS 制备为 10,000 U/mL 储备液。
12. 消化完成后，使用 10 mL 塑料移液管上下冲洗消化组织数次，以彻底均质化消化混合物。
13. 加入 10 mL MuSC/成肌细胞生长培养基以减慢消化速度。有关MuSC / Myoblast生长培养基制备的详细信息，请参见第2节。
14. 将混合物通过 70 μm 过滤器。使用 1x PBS 冲洗消化板，并将该 PBS 也通过过滤器，以收集消化板中的所有细胞。
15. 以350× g 离心10分钟，并用真空弃去上清液。
16. 用 20 mL 1x PBS 重悬细胞沉淀，并将细胞流经 40 μm 过滤器。
17. 以350× g 离心5分钟，并用真空除去上清液。
18. 使用 20 mL MuSC/成肌细胞生长培养基重悬细胞并将细胞接种在 10 cm 正常塑料板中。在此期间，MuSC 无法附着在板底部，并且大部分时间会漂浮在培养基中。
    注意:这是第一次在塑料板上进行预电镀。
19. 1.5小时后，短暂摇晃板并将液体转移到两个胶原包被的10cm培养皿中，每个培养皿含有10mL培养物。现在，MuSCs将附着在胶原蛋白包被的板上并生长。2 天后更换介质。胶原包被板的制备方法如本节的步骤1-4所示。
20. 再过一天，传代细胞:取出培养基，用1x PBS洗涤细胞一次，然后胰蛋白酶消化细胞。
21. 使用MuSC / Myoblast生长培养基将细胞从板上冲洗，将细胞移动到新的塑料板上，并在细胞培养箱中孵育40分钟。
    注意:这是塑料板上的第二次预电镀。
22. 将培养物倒入新的塑料板中，并在细胞培养箱中再孵育 20 分钟。
    注意:这是塑料板上的第三次预电镀。
23. 然后将板中的上清液分成 8 个胶原包被的 10 cm 培养皿中，以传代培养细胞。这里的通过比例是2:8（1:4）。经过上述三次预镀后，成肌细胞的纯度可以达到90%以上。因此，在这一点之后，在进一步传代成肌细胞时，无需预先铺板。

2. MuSC / 成肌细胞生长培养基的制备（从 5 只小鼠制备的示例）

1. 处死5只年轻健康的野生型小鼠，分离脾脏，并用1x PBS（含青霉素/链霉素）冲洗脾脏一次。
2. 用剪刀去除脾脏上的深色部分/斑点（如果有）。如果脾脏大部分变黑，请丢弃脾脏。
3. 将所有 5 个脾脏放入 50 mL 管顶部的 40 μm 过滤器中。
4. 打开无菌 1 mL 注射器包装，拉出柱塞，丢弃针筒。
5. 在 40 μm 过滤器中，握住橡胶塞并使用柱塞的拇指托将脾组织研磨并解离成单细胞。撕开注射器包装时，注意不要触摸和污染柱塞的拇指托。
6. 在研磨脾脏时，偶尔使用1x PBS将解离的脾细胞洗掉到过滤器下方的50mL管中。
7. 将所有脾细胞通过过滤器冲洗到50mL管中后，将管以500× g 离心10分钟。
8. 使用 1 mL 1x 红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。裂解红细胞 ~1 分钟。
   注:10x红细胞裂解缓冲液含有155mM NH₄Cl，10mM NaHCO₃和1mM EDTA二钠盐，溶于ddH₂O.过滤灭菌，不要高压灭菌。使用前用 ddH₂O 稀释至 1x。
9. 用 1x PBS 填充 50 mL 管以停止红细胞的裂解过程。
10. 用40μm过滤器再次过滤细胞悬浮液，然后以500× g 离心10分钟。
11. 用 2 mL RPMI-1640 全培养基（含有 10% FBS 和青霉素/链霉素的 RPMI-1640 培养基）重悬细胞，轻轻移液。
12. 将更多的 RPMI-1640 全培养基加入试管中并充分混合。将细胞悬液分配到 10 个 T75 培养瓶中。每个 T75 培养瓶中的最终培养体积应为 20 mL。
13. 将 10 μL 刀豆球蛋白 A 原液加入每个 T75 培养瓶中，并充分混合。刀豆球蛋白-A 激活 T 细胞的增殖。
    注:刀豆球蛋白 A 原液为 4 mg/mL，通过将刀豆球蛋白 A 溶解在 1x PBS 中制备。这里使用了刀豆球蛋白-A本身，不要将其与以后在CUT&Tag检测中使用的刀豆球蛋白-A珠子混淆。
14. 48 小时后，用另外 20 mL 的 RPMI-1640 全培养基补充每个 T75 烧瓶，使总体积增加至 40 mL。
15. 再过24小时，收集每个T75烧瓶中的所有培养物，并以600× g 离心3分钟。
16. 上清液是T细胞条件培养基，可在-20°C至-80°C下储存长达2个月。丢弃脾细胞沉淀物。使用前，解冻 T 细胞条件培养基，并使用 0.22 μm 过滤器进一步灭菌培养基。
17. 要制备 Ham's F10 全培养基，请向 500 mL Ham's F10 培养基中加入 100 mL FBS、300 μL bFGF 储备液和 6 mL 青霉素/链霉素。
    注:bFGF 原液为 5 μg/mL，通过在 Ham's F10 培养基中溶解 bFGF 制备。
18. 将 Ham 的 F10 全培养基与上述过滤的 T 细胞条件培养基以 1:1 的比例混合，制成 MuSC/成肌细胞生长培养基。

3. 具有成肌细胞的 CUT&Tag（3 种 CUT&Tag 反应示例）

1. 关键试剂的制备
   1. 使用已发表的方法¹⁴ 在内部从细菌培养物中纯化 pA/G-Tn5 转座酶。这种酶只有在安装有造文库 DNA 接头后才能达到其功能形式。最重要的是，pA/G-Tn5 可以从许多来源获得商业价值。
   2. 用于制备接头的寡核苷酸如 表1所示。具体来说，分别用Oligo-A和Oligo-B退火Oligo-Rev，相应地制备双链Adaptor-A和Adaptor-B。退火以制造适配器的细节可以在其他地方找到¹⁴.
   3. 将 Adaptor-A 和 Adaptor-B 与 pA/G-Tn5 转座酶在室温 （RT） 下孵育 2 小时。然后，这种转座酶将采取其功能形式。在本手稿的以下部分中，pA/G-Tn5 的功能形式将被称为 pA/G-Tn5a。
      注意:如果 pA/G-Tn5 是购买的而不是内部制造的，请务必澄清购买的物品是否安装了适配器的 pA/G-Tn5（换句话说，即用型）或只是 pA/G-Tn5 酶本身。如果只是酶，请准备上述两个接头并将它们安装到 pA/G-Tn5 上，然后再最终将该酶用于 CUT&Tag。
   4. 关于结合缓冲液、洗涤缓冲液、Dig-wash缓冲液、300-Dig缓冲液和Tagmentation缓冲液的配方，读者也可以参考Kaya-Okur等人¹。
   5. 制备结合缓冲液，其中包含 20 mM HEPES pH 7.5、10 mM KCl、1 mM CaCl₂ 和 1 mM MnCl₂。
   6. 准备含有 20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.5 mM 亚精胺和 1x 蛋白酶抑制剂混合物的洗涤缓冲液。
   7. 将洋地黄皂苷作为DMSO中的浓缩储备液，然后通过将洋地黄皂苷加入Wash缓冲液中以0.5mg / mL的浓度制备Dig-wash缓冲液。
   8. 通过将浓度为 2 mM 的 EDTA 和浓度为 0.1% 的 BSA 加入 Dig-wash 缓冲液中来制备抗体缓冲液。
   9. 制备含有 20 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl、0.5 mM 亚精胺、1x 蛋白酶抑制剂混合物和 0.1-0.5 mg/mL 洋地黄皂苷的 300-Dig 缓冲液。
   10. 通过用 10 mM MgCl₂ 补充 300-Dig 缓冲液来制备标记缓冲液。MgCl₂ 可以激活 pA/G-Tn5a 的酶活性。
       注意: 材料表 文件中提供了其他材料的信息。
2. 刀豆球蛋白-A 珠活化
   1. 将 30 μL 刀豆球蛋白 A 珠（每次反应 10 μL）混合到 1.5 mL 离心管中的 300 μL 结合缓冲液中。倒置几次以充分混合。将管子放在磁性架上。液体澄清后，除去上清液。
   2. 从磁性架中取出试管，在试管中加入 300 μL 结合缓冲液，充分混合，并均匀分成 3 个 8-PCR 管条带的管。指定每个试管有一个 CUT&Tag 反应。
   3. 将8-PCR管条放在磁性架上，等待液体清澈。
   4. 吸出上清液并从磁性架中取出试管。将 10 μL 结合缓冲液加入每个试管中并充分混合。将准备好的珠子放在冰上或4°C下，直到细胞准备好继续进行。
3. 将细胞结合到刀豆球球 A 珠上
   1. 将培养的小鼠成肌细胞从平板上胰蛋白酶化，用 RT 1x PBS 洗涤细胞一次，最后在 RT 下将细胞重悬于洗涤缓冲液中。 避免过度胰蛋白酶消化，因为这会损害细胞膜对刀豆球蛋白 A 珠的亲和力。
   2. 在洗涤缓冲液中将细胞密度调节至约 7 x 10⁵ 个细胞/mL，使 100 μL 细胞悬液包含大约 70,000 个细胞，足以进行一次 CUT&Tag 反应。
   3. 将 100 μL 细胞悬液移液到 8-PCR 管条带的每个管中，该条带已经含有 10 μL 制备的刀豆球蛋白 A 珠。充分混合并在室温下在"跷跷板运动"振荡器上孵育 10 分钟。
   4. 将8-PCR管条放在磁性架上。等到它清除，然后取出上清液。
   5. 要评估刀豆球蛋白-A珠子是否有效地隔离了细胞，请在显微镜下检查上清液，看看上清液中还剩下多少细胞。在刀豆球蛋白-A 珠结合步骤之后，应在上清液中观察到很少或没有细胞。
4. 将细胞与一抗一起孵育
   1. 对于每个样品，将 1 μL H3K4me1 抗体稀释到 50 μL 抗体缓冲液中，并将稀释的抗体加入每个样品管中。将珠子与稀释的抗体充分混合，方法是将试管倒置数次。将样品放在"跷跷板运动"振荡器上，在4°C下孵育过夜。
      注意:正如 Steven Henikoff^{博士 1} 所提到的，没有必要在所有 CUT&Tag 测定中使用 IgG 阴性对照。与ChIPs相比，CUT&Tag检测具有更低的背景信号或没有背景信号。因此，使用IgG进行"阴性对照"CUT&Tag测定不会引入任何有用的信息。相比之下，使用CUT&Tag验证的抗体进行阳性对照对于评估CUT&Tag检测是否有效非常重要。
5. 将细胞与二抗一起孵育
   1. 第二天早上，将样品放在磁性架上，等待样品清除。
   2. 去除上清液，即一抗。无需清洗珠子;直接将 50 μL 稀释 （1:100） 二抗加入每个样品管中。
      注:二抗用 Dig-wash 缓冲液以 1:100 的比例稀释。为了更有效地识别 pA/G-Tn5a，二抗不应与任何分子或基团（如 HRP、生物素或荧光基团）偶联。
   3. 充分混合并在室温下在"跷跷板运动"振荡器上孵育 1 小时。
   4. 将样品放回磁性架上，等待样品清除，然后弃去上清液。
   5. 将 200 μL Dig-wash 缓冲液加入每个试管中，并倒置数次以洗去过多的抗体。
   6. 将其放回磁性架上，等待其清除，然后取出上清液。重复此洗涤两次，以完全去除过多的未结合抗体。
6. 将细胞与 pA/G-Tn5a 孵育
   1. 最后一次洗涤后，将样品放在磁性架上，等待样品清除，然后除去管中的所有液体。对于每个样品管，加入 100 μL 含有 pA/G-Tn5a 的 0.04 μM 的 300-Dig 缓冲液。 充分混合并在室温下在跷跷板运动振荡器上孵育 1 小时。
   2. 放在磁性架子上。等到样品清除并除去上清液。
   3. 向每个样品中加入 200 μL 300-Dig 缓冲液，充分混合，然后放在振荡器上以在室温下洗涤样品 3 分钟。
   4. 放在磁性架子上。等到样品清除并除去上清液。重复此洗涤两次以去除过多的 pA/G-Tn5a 并降低背景。
7. 基因组的切割和标记
   1. 最后一次洗涤后，将样品放在磁性架上，然后彻底将液体从管中移出。对于每个样品，加入 50 μL 标记缓冲液。充分混合并在37°C的PCR机中孵育1小时。请勿使用PCR仪的盖子加热功能。
      注:可选地，由于在后续基因组 DNA 纯化步骤中材料磨损，可以将一些加标 DNA 添加到标记缓冲液中，以便加标 DNA 将显示在最终测序结果中，并可用于归一化数据。制备和使用刺突DNA的方法可在别处找到¹⁴。
8. 全基因组DNA纯化
   1. 标记后，为每个样品再添加 150 μL 标记缓冲液。现在的总体积为 200 μL。
   2. 然后，对于每个样品，加入 10 μL 0.5 M EDTA、3 μL 10% SDS 和 2.5 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K. Vortex 充分混合并在 55^°C 下孵育 2 小时。
   3. 将每个样品移入 1.5 mL 离心管中的 200 μL 苯酚/氯仿中，涡旋 10 秒。以18,000× g 离心5分钟。将顶层转移到新的 1.5 mL 离心管中。
   4. 向每个试管中加入 200 μL 氯仿并涡旋 10 秒。以18,000× g 离心5分钟。
   5. 将顶层吸入新的 1.5 mL 离心管中。然后，对于每个样品，加入 550 μL 100% 乙醇，将 DNA 在 -80 °C 下沉淀 1 小时。为了更好地观察 DNA 沉淀，加入 1 μL 20 mg/mL 糖原。
   6. 以最大速度（>18,000× g）离心15分钟以沉淀DNA。
   7. 小心地倒出上清液，用75%乙醇洗涤糖原/ DNA沉淀一次，然后再次以最大速度离心5分钟。
   8. 去除 75% 乙醇，并用 21 μL ddH₂O 重悬糖原/DNA 沉淀。
9. 文库制备和测序
   1. 设置文库制备 PCR。要对要一起测序的样品进行索引，请为每个样品使用不同的N7XX Illumina引物和通用的N5XX Illumina引物。如果索引超过12个样品，则还需要不同的N5XX Illumina引物。Illumina提供了12个N7XX引物和8个N5XX引物，因此N7XX与N5XX组合的总数为12×8=96。PCR反应体系如 表2所示。
   2. 通过CUT&Tag测定中使用的细胞号粗略确定文库制备PCR中的PCR循环数。通常，对于使用 50,000-100,000 个细胞的 CUT&Tag 测定，9-12 个周期就足够了，而 10,000-50,000 个之间的细胞数量可能需要多达 14 个周期。PCR程序如 表3所示。
      注意:对于大多数CUT&Tag检测，如果抗体功能正常，则PCR循环数在9-14之间应始终生成用于测序的有用文库。一个好的文库的浓度通常为 10-50 ng/μL（通过 Qubit 测定法测定），体积为 20-30 μL。相反，如果抗体不能有效和特异性地起作用，那么仅仅增加循环次数就无法挽救实验。过多的循环次数对结果完全没有好处，反而会引入更多的PCR重复，这将使数据分析复杂化。
   3. 使用一些市售的 DNA 纯化/大小选择珠来纯化文库 DNA 并选择所需大小的 DNA。
   4. 用水稀释一小份纯化文库的等分试样，并将其用于使用位点特异性引物进行 qPCR，以检查富集，如在 ChIP-qPCR 实验中一样。在对库进行测序之前，这有助于确定 CUT&Tag 是否正常工作。
   5. 按照制造商的说明进行排序和数据分析。
      注意:CUT&Tag 套件可从少数几家公司购买，一个示例可以在材料表 文件中找到。

结果

在将细胞与刀豆球蛋白-A珠结合之前，请在显微镜下检查细胞悬液。因此，在用刀豆球蛋白-A珠孵育细胞后，将样品管放在磁性架上，并应再次使用显微镜观察上清液。这是为了评估刀豆球蛋白-A珠子捕获细胞的效率。含有 7 x 10⁵ 个细胞/mL 的洗涤缓冲液在显微镜下应如图 1A 所示。相比之下， 图1B 显示了刀豆球蛋白-A珠结合后的上清液，其中珠子...

讨论

某种CUT&Tag反应中所需的特定细胞数量完全依赖于要测试的组蛋白标记/变体或染色质结合蛋白的富集。通常，对于非常富集的组蛋白标记，如H3K4me1，H3K4me3和H3K27ac等，25,000-50,000个成肌细胞对于一个CUT&Tag反应来说是相当足够的。然而，一些罕见的染色质结合蛋白可能需要多达 250,000 个细胞。CUT&Tag检测中使用的细胞数量至关重要，如果处理不当，通常会导致检测失败。在CUT&Tag反应中使用过多的细胞?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size