在小鼠成肌细胞研究中使用靶标和标记下的切割（CUT&Tag）测定

摘要

刚进入表观遗传学领域的研究人员会发现 CUT&Tag 是 ChIP 检测的明显更容易的替代品。CUT&Tag极大地促进了稀有细胞群和原代细胞群的表观遗传学研究，从极少数细胞中生成了高质量的数据。该协议描述了在从小鼠后肢肌肉分离的小鼠成肌细胞上进行H3K4me1 CUT和Tag测定。

摘要

该协议论文旨在为新研究人员提供使用靶标和标记下的切割（CUT&Tag）来分析染色质结合因子，组蛋白标记和组蛋白变体的基因组位置的全部详细信息。CUT&Tag协议对小鼠成肌细胞和新鲜分离的肌肉干细胞（MuSCs）效果非常好。只要细胞可以被刀豆球-A珠固定，它们就可以很容易地应用于许多其他细胞类型。与CUT&Tag相比，染色质免疫沉淀（ChIP）测定是耗时的实验。ChIP 检测需要先对染色质进行预处理，然后才能将染色质材料用于免疫沉淀。在交联 ChIP （X-ChIP） 中，染色质的预处理涉及交联和超声处理以片段化染色质。在天然 ChIP （N-ChIP） 的情况下，片段化的染色质通常通过微球菌核酸酶 （MNase） 消化来实现。超声处理和 MNase 酶解都会给 ChIP 实验带来一些偏差。与ChIPs相比，CUT&Tag检测可以在更少的步骤内完成，并且需要的细胞要少得多，但可以提供有关不同基因组位置的转录因子或组蛋白标记的更公正的信息。CUT&Tag可以处理低至5,000个单元格。由于其比 ChIP 具有更高的灵敏度和更低的背景信号，因此研究人员有望在测序后仅从数百万个reads中获得可靠的峰数据。

引言

CUT&Tag 检测的发明是为了弥补 ChIPs¹ 的一些明显缺陷。ChIP 的两个主要缺点是 1） 染色质片段化时引入的偏差和 2） 无法处理低细胞数。X-ChIP 检测依靠超声处理或 MNase 消化来获得染色质片段，而 N-ChIP 主要使用 MNase 消化来获得核小体。超声处理显示偏向于松弛的染色质位置，例如启动子区域²，显然，MNase 消化对松弛的染色质纤维也更有效。此外，一些报道称，MNase消化也显示出DNA序列依赖性偏倚^3。因此，在 ChIP 检测的起始制备步骤中，不可能以完全随机的方式从各种基因组位置获得染色质片段。此外，与 CUT&Tag 相比，ChIP 检测通常产生更高的背景信号，并且需要比 CUT&Tag 多 10 倍以上的读取才能在峰为^1、4、5 的地方突出。这就解释了为什么 ChIP 实验必须从比 CUT&Tag 多得多的细胞开始。在研究细胞系时，这不是问题，因为它们可以重复传代以获得非常高的细胞数量。然而，ChIP 检测绝对不是研究稀有或珍贵原代细胞群的强大表观遗传学工具，尽管原代细胞显然具有更多的实用和医学意义。

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研究方案

本文介绍的方法均得到广州实验室机构动物护理和使用委员会的认可。用于生成本手稿代表性结果的小鼠按照广州实验室机构动物护理和使用委员会的指南进行饲养和维护。

1. 从小鼠后肢肌肉中分离成肌细胞（使用 1 只小鼠的示例）

1. 用ddH₂O稀释冰醋酸至0.02M，然后高压灭菌。
2. 用0.02M乙酸将胶原蛋白（来自大鼠尾巴）稀释至0.1mg / mL。
3. 将该胶原蛋白溶液添加到培养皿中，以在37°C细胞培养箱中覆盖培养皿底部过夜。
4. 使用前，去除胶原蛋白溶液并用1x PBS清洗培养皿两次。胶原蛋白溶液可重复使用8-10次。
5. 牺牲一只 8-12 周大的老鼠。（老年小鼠的MuSCs和成肌细胞产量低。
6. 将小鼠的所有后肢肌肉分离并放入10厘米的培养皿中。
7. 使用 1x PBS（含青霉素/链霉素）冲洗肌肉 4 次。每次冲洗后，始终将肌肉转移到新的板中。
8. 最后冲洗后，去除 PBS 并用剪刀切碎肌肉。
9. 加入 6 mL 含有分散酶 II （1.1 U/mL） 和胶原酶 II （830 U/mL） 的 1x PBS 以消化切碎的肌肉，消化应持续 ~1.5 小时。
10. 为了进行消化，将切碎的肌肉转移到37°C水浴中的管中，或者直接将切碎的肌肉留在培养皿内，并将其置于37....

讨论

某种CUT&Tag反应中所需的特定细胞数量完全依赖于要测试的组蛋白标记/变体或染色质结合蛋白的富集。通常，对于非常富集的组蛋白标记，如H3K4me1，H3K4me3和H3K27ac等，25,000-50,000个成肌细胞对于一个CUT&Tag反应来说是相当足够的。然而，一些罕见的染色质结合蛋白可能需要多达 250,000 个细胞。CUT&Tag检测中使用的细胞数量至关重要，如果处理不当，通常会导致检测失败。在CUT&Tag反应中使用过多的细胞?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Collagen	Corning	354236
Collagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 antibody	abcam	ab8895
Ham's F10 media	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina	Vazyme	TD903	This kit has been tested by us to function well
Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes	Qualityard	QYM06
Magnetic rack for 8-PCR tube stripes	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	For library-making PCR reaction
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Needs to be mounted with adaptors before use
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG)	Antibodies-online	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD202	This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411	Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size