أخذ عينات دم الوريد تحت الترقوة في الفئران الواعية

Summary

نقدم هنا مزيجا من القيود الفعالة للفئران وطرق ثقب الوريد تحت الترقوة التي تمكن من جمع الدم بسرعة وأمان وتكرار في الفئران دون تخدير.

Abstract

هناك العديد من الطرق المعمول بها للحصول على عينات دم متكررة من الفئران ، مع أكثر الطرق المستخدمة شيوعا هي أخذ عينات الوريد الجانبي بدون تخدير وأخذ عينات الوريد الوداجي مع التخدير. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الطرق تتطلب المساعدة ومعدات التخدير وأحيانا تشكل صعوبات من حيث جمع الدم أو رداءة نوعية عينات الدم. بالإضافة إلى ذلك ، تستهلك طرق جمع الدم هذه وقتا كبيرا وموارد بشرية عندما يكون أخذ عينات الدم المتكررة مطلوبا لعدد كبير من الفئران. تقدم هذه الدراسة تقنية لأخذ عينات الدم المتكررة في الفئران غير المخدرة من قبل فرد واحد بارع. يمكن الحصول على عينات دم مرضية للغاية عن طريق ثقب الوريد تحت الترقوة. أظهرت الطريقة معدل نجاح إجمالي مثير للإعجاب بنسبة 95٪ ، مع متوسط وقت يبلغ 2 دقيقة فقط من ضبط الفئران إلى الانتهاء من جمع الدم. علاوة على ذلك ، فإن إجراء عمليات جمع دم متتالية ضمن النطاق المحدد لا يلحق أي ضرر بالفئران. هذه الطريقة تستحق الترويج لجمع الدم ، خاصة في دراسات الحرائك الدوائية واسعة النطاق.

Introduction

الفئران هي واحدة من أكثر التجارب شيوعا ، وهناك العديد من الطرق للحصول على عينات الدم. بالنسبة للتجارب التي تتضمن جمع دم واحد في المرحلة الختامية ، يمكن الحصول على كمية كافية من الدم من خلال ثقب القلب أو جمع الدم من الشريان الأورطي البطني¹. ومع ذلك ، تتطلب بعض الدراسات جمع الدم المتكرر من الفئران للدم الروتيني أو التحليل الكيميائي الحيوي ، خاصة في دراسات الحرائك الدوائية والسموم ، حيث يلزم جمع الدم المتكرر لتحديد امتصاص الأدوية وتوزيعها واستقلابها².

حاليا ، على الرغم من أن جمع الدم في الوريد الذيل هو الطريقة الأكثر شيوعا لأخذ عينات الدم من الفئران ، على الرغم من عدم الحاجة إلى التخدير ، إلا أن هذه الطريقة يمكن أن تكون صعبة بالنسبة للمجموعات المتكررة ، وحجم الدم الذي تم جمعه صغير نسبيا ^3,4. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أنه يمكن جمع الدم من الأوردة الصافن والقضيب ، إلا أن كمية الدم التي تم الحصول عليها محدودة ، والتخدير مطلوب ^1,5. علاوة على ذلك ، توفر عينات الدم التي تم جمعها من الضفيرة الوريدية تحت الفك السفلي ، وكذلك الأوردة تحت اللسان والوداجية وتحت الترقوة عينات عالية الجودة ولكنها تتطلب عادة تخديرا أو مساعدة عدة أفراد^{1،6،7،8،9}. أخيرا ، لا يتطلب جمع الدم من الجيوب الأنفية / القناة خلف الحجاج تخديرا فحسب ، بل قد يتسبب أيضا في إصابة وإجهاد الفئران⁹.

عادة ما تكون جودة عينات الدم التي يتم الحصول عليها من الأوردة الرئيسية من أعلى المعايير¹. في الوقت الحاضر ، وجدت بعض الدراسات أن أخذ العينات المجهرية المستمرة من خلال الوريد الوداجي هو طريقة مناسبة جدا للبحث السمي في الفئران على الرغم من أن هذه الطريقة تتطلب عادة قسطرة الوريد الوداجي^10،11،12. لذلك ، يجدر استكشاف كيفية الحصول على عينات دم عالية الجودة وفقا لمبدأ 3R للبحوث الحيوانية دون تدخل جراحي. كان الهدف من هذه الدراسة هو تقديم طريقة لاستخراج الدم بكفاءة من الوريد تحت الترقوة في الفئران. تتيح هذه التقنية الجمع السريع للعينات المرضية من خلال إجراء شخص واحد دون الحاجة إلى التخدير.

Protocol

التزمت هذه الدراسة بالمبادئ التوجيهية الموضحة في الطبعة الثامنة من دليل رعاية واستخدام المختبر¹³. حصل البحث على موافقة من لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة لانتشو الثاني وتم توثيقه وفقا لإرشادات REACH 2.0¹⁴. تم إيواء اثني عشر فأرا من Wistar الأصحاء (ستة ذكور تزن 290-330 جم وست إناث تزن 250-280 جم) تتراوح أعمارهم بين 12-16 أسبوعا في مختبر GLP للحيوانات بجامعة Lanzhou لمدة 3 أيام قبل التجربة الفعلية. كانت أقفاص الفئران المستخدمة من النوع R5 ، بقياس 545 مم × 395 مم × 200 مم ، وكانت مجهزة بمواد فراش معقم. تم تزويد جميع الفئران بإمكانية الوصول غير المقيد إلى كل من الطعام والماء. حافظ المختبر على متوسط رطوبة يبلغ 25٪ ، ومتوسط درجة حرارة 24 درجة مئوية ، ودورة ضوئية تتناوب بين النهار والليل (7:00 صباحا / 7:00 مساء). في ختام الدراسة ، تم القتل الرحيم لجميع بشكل إنساني باستخدام جرعة زائدة من الأيزوفلوران. للحصول على معلومات شاملة بشأن المواد والأدوات المستخدمة في هذه الدراسة ، يرجى الرجوع إلى جدول المواد.

1. حساب حجم العينة واختيار

1. اختر طريقة معادلة الموارد¹⁵ لتقدير حجم عينة باستخدام المعادلة (1).
   E = إجمالي عدد - إجمالي عدد المجموعات (1)
   حيث E هي درجة حرية تحليل التباين (ANOVA) وتتراوح من 10 إلى 20.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم تقسيم 12 إلى مجموعتين A و B (ثلاثة ذكور وثلاث إناث لكل مجموعة).
2. حدد النتيجة الأولية لهذه الدراسة على أنها معدل النجاح واستهلاك الوقت لأخذ عينات الدم المتكررة من قبل فرد واحد.
3. حدد مقاييس النتائج الثانوية على أنها تغيرات في وزن جسم الفئران ، وتناول الطعام والماء ، بالإضافة إلى حدوث الأحداث الضائرة (مثل كسور الترقوة ، والأورام الدموية تحت الجلد ، واسترواح الصدر ، والوفيات).
4. تعريف أخذ عينات الدم الناجحة على أنها تستوفي المعايير التالية: ط) أقل من ثلاث ثقوب لجمع دم واحد ؛ ب) إجمالي الوقت (من ضبط الفئران إلى الانتهاء من جمع الدم) لا يتجاوز 5 دقائق ؛ و iii) تحقيق حجم الدم المستهدف مع الحصول على بلازما واضحة. اعتبر أي انحراف عن هذه المعايير فشلا في أخذ العينات.

2. ضبط النفس وجمع الدم

ملاحظة: تم جمع عينات الدم من فئران المجموعة A و B من قبل باحثين ذوي خبرة ، وكلاهما سحب ما لا يقل عن 100 عينة دم. تم جمع عينات الدم من كلا المجموعتين من الفئران لما مجموعه 96 مرة على مدار 4 أيام. لا تتطلب طريقة جمع الدم هذه تخديرا أو أجهزة تقييد إضافية للفئران. ومع ذلك ، فإنه يتطلب تقنيات معالجة بارعة.

1. في الساعة 8:00 صباحا في اليوم السابق لأخذ عينات الدم (اليوم 1) ، قم بتعيين كل فأر في قفصه الفردي أثناء وزن طعامه وماءه. بعد ذلك ، اطلب من باحث آخر ، أعمى عن القياسات ، تسجيل وزن الفئران واستهلاكها للطعام واستهلاك المياه كل يوم في الساعة 8:00 صباحا من اليوم 1 فصاعدا.
2. لاتباع هذا البروتوكول ، قم أولا بسحب الدم في الساعة 10:00 صباحا ثم في الساعة 10:00 مساء كل يوم ، وجمع 0.15 مل من الدم بالتناوب من الأوردة تحت الترقوة على كلا الجانبين.
   ملاحظة: تم تحديد كمية الدم التي سيتم جمعها من خلال الحد الأقصى للحجم الذي يمكن أن يتحمله الجرذ الأقل وزنا في غضون أسبوع.
3. اغسل حقنة تحتوي على هيبارين الصوديوم (25 وحدة / مل) وعقم موقع الحقن بالكحول.
4. قم بضرب جلد ظهر الجرذ برفق وقرص رقبته بشكل متكرر لمساعدة الفئران على الاسترخاء (فيديو 1).
5. باستخدام إبهام اليد غير المهيمنة والسبابة ، أمسك جلد رقبة الجرذ وارفعه بقوة (الشكل 1 أ والفيديو 1).
6. بالتنسيق مع اليد المهيمنة ، استخدم الأصابع الثلاثة المتبقية وراحة اليد غير المهيمنة لتأمين الجلد الخلفي للفأر وشل حركة أطرافه الأمامية (الشكل 1B و C والفيديو 2).
   ملاحظة: إذا قاوم الجرذ أو كافح ، يمكن تكرار هذا الإجراء عدة مرات لمساعدة الفئران على التعود على المناولة. الخطوات التالية هي مفتاح جمع الدم بنجاح.
7. باستخدام السبابة غير المهيمنة ، اضغط برفق على جلد رأس الجرذ بينما تساعد الأصابع الأخرى ، جنبا إلى جنب مع راحة اليد ، في تدوير مفصل الكتف للخارج. خلال هذه العملية ، استخدم اليد المهيمنة لتمديد مفصل كتف الجرذ بالكامل (الشكل 1D-F والفيديو 2).
8. أمسك الجرذ بقوة باليد غير المهيمنة لمحاذاة رأس الجرذ وجسمه في خط مستقيم (الشكل 1G ، H). بعد ذلك ، استخدم اليد المهيمنة لتحديد موضع الترقوة وتأكيد موقع البزل (الشكل 1I والفيديو 2 والفيديو 3).
   ملاحظة: حلق الفئران ليست ضرورية. في الشكل 1 ، تم إجراء الحلاقة فقط لإظهار موضع الترقوة والثقب إلى حد كبير. عند تقييد الفئران ، وخاصة الفئران >350 جم ، فإن السماح للفأر بإراحة قدميه على سطح صلب سيساعد في دعم وزن الجسم. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المقيد مراقبة معدل التنفس لكل فأر أثناء جمع الدم للتأكد من أن ضبط النفس ليس ضيقا جدا ، مما قد يسبب ضائقة تنفسية.
9. إمساك المحقنة بالتوازي مع جسم الجرذ في اليد المهيمنة ، مع توجيه طرف الإبرة لأعلى ومقياس المحقنة نحو المجرب ، والحفاظ على زاوية 15 درجة تقريبا مع خط الوسط لجسم الجرذ. أدخل الإبرة 0.5 سم أسفل الشق الترقوي (عند تقاطع الثلث القريب من الترقوة والقص) ، مع التأكد من بقاء الإبرة موازية لجسم الجرذ (الشكل 1J والفيديو 3).
   ملاحظة: يجب إيلاء اهتمام خاص لزاوية وعمق إدخال الإبرة لتجنب ثقب الأوعية الدموية أو التسبب في تلف غير مقصود للأوعية المجاورة.
10. اسحب المحقنة برفق قليلا لخلق ضغط سلبي ، وغالبا ما يكون مصحوبا بإحساس واضح بالاختراق عند دخول الأوعية الدموية (واضح بشكل خاص أثناء جمع الدم الأولي). حافظ على هذا الوضع واجمع 0.1-1.0 مل من الدم بسرعة ثابتة حسب الحاجة (باتباع إرشادات IACUC لحوالي 4-5.3 مل / كجم من الدم أسبوعيا¹) (الشكل 1K والفيديو 3).
11. إذا لم يكن هناك دم عند الثقب ، فحاول ضبط زاوية الإبرة وعمقها برفق أو قم بتدوير المحقنة برفق (فيديو 3). إذا لم تنجح ثلاث محاولات متتالية على نفس الجانب ، أوقف كل النزيف ثم انتقل إلى الجانب الآخر للثقب.
    ملاحظة: ينصح بالثقب السريع عبر الجلد لمنع الفئران من النضال بسبب عدم الراحة.
12. ضع قطعة قطن للإرقاء وأعد الفئران إلى قفصها (فيديو 4).
13. معالجة عينات الدم وفقا للمتطلبات التجريبية.

3. معالجة عينات الدم

1. تخلص من إبرة المحقنة في وعاء الأدوات الحادة. نقل الدم الذي تم جمعه إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل تم شطفه مسبقا بالهيبارين. ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي ، واضبطه على 4 درجات مئوية و 1200 × جم ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق لفصل البلازما. انقل المصل باستخدام ماصة باستور سعة 1.0 مل إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: لمنع انحلال الدم بسبب الضغط ، قم بإزالة طرف الإبرة عند الضرورة. أثناء شفط البلازما ، تجنب سحب خلايا الدم من أسفل الأنبوب. في بعض الأحيان ، قد يجمع سطح المحقنة فراء الفئران. احرص على عدم السماح لأي فرو بدخول الأنبوب ، لأنه قد يؤدي إلى التخثر.

4. التحليل الإحصائي

1. عرض جميع البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري واختبارها للتأكد من تجانس التباين.
2. استخدم اختبار فيشر الدقيق لمقارنة معدلات النجاح بين المجموعات.
3. استخدم اختبار t المستقل المكون من عينتين لمقارنة المتوسط العام بين المجموعتين.
4. استخدم تحليل التباين (ANOVA) للقياسات المستمرة مثل وقت أخذ عينات الدم ووزن الجسم وتناول الطعام واستهلاك المياه. ضع في اعتبارك P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تظهر عينات البلازما عالية الجودة لونا أصفر باهتا ووضوحا وشفافية ، خالية من أي مسحة حمراء أو تخثر ، كما هو موضح في الشكل 2 أ. يوضح الشكل 2B انحلال الدم (الجانب الأيسر) أو التخثر (الجانب الأيمن) نتيجة لإجراءات غير لائقة ، على التوالي. على مدار 96 جلسة جمع دم في غضون...

Discussion

على الرغم من أن جمع الدم في الوريد الذيل هو الطريقة الأكثر شيوعا لأخذ عينات الدم المتكررة في الفئران ، إلا أنه قد يتأثر بأدوية التخدير ، وبسبب صغر حجم الوريد الذيل ، فإن كمية الدم التي يمكن جمعها في حالة واحدة محدودة ، مما يؤدي إلى مدة أطول لجمع الدم ^4,5. على ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% normal saline	Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	——	Prepared heparin sodium solution
1 mL Pasteur pipette	Biosharp	BS-XG-01-NS	Blood collection
1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm)	Shinva Medical Instrument Co.,Ltd.	0.45*12RWLB	Blood collection
1.5 mL Eppendorf tube	Biosharp	BS-15-M	Blood storage and collection
75% medical alcohol	Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.	——	Disinfection of rat blood collection site
Centrifuge tube holder	Biosharp	BS-05/15-SM60	——
Electronic scale	Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd.	JE1002	Weigh
Heparin sodium injection	Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd.	——	Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL
Low temperature centrifuge	HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument  Co., Ltd.	H1750R	Separation of serum