Prélèvement sanguin de la veine sous-clavière chez des rats conscients

Résumé

Nous présentons ici une combinaison de méthodes efficaces de restriction chez le rat et de ponction veineuse sous-clavière qui permettent une collecte de sang rapide, sûre et répétée chez le rat sans anesthésie.

Résumé

Il existe plusieurs méthodes établies pour obtenir des échantillons de sang répétés de rats, les méthodes les plus couramment utilisées étant le prélèvement latéral de la veine caudale sans anesthésie et le prélèvement de la veine jugulaire sous anesthésie. Cependant, la plupart de ces méthodes nécessitent une assistance et un matériel anesthésique et posent parfois des difficultés en termes de prélèvement sanguin ou de mauvaise qualité des prélèvements sanguins. De plus, ces méthodes de prélèvement sanguin consomment beaucoup de temps et de ressources humaines lorsque des prélèvements sanguins répétés sont nécessaires pour un grand nombre de rats. Cette étude présente une technique de prélèvement sanguin répétitif chez des rats non anesthésiés par un seul individu compétent. Des échantillons de sang très satisfaisants peuvent être obtenus en ponctionnant la veine sous-clavière. La méthode a démontré un taux de réussite global impressionnant de 95 %, avec un temps médian de seulement 2 minutes entre la contention du rat et la fin de la collecte de sang. De plus, le fait d’effectuer des prélèvements sanguins consécutifs dans la plage désignée n’inflige aucun dommage aux rats. Cette méthode mérite d’être encouragée pour la collecte de sang, en particulier dans les études pharmacocinétiques à grande échelle.

Introduction

Les rats sont l’un des animaux de laboratoire les plus courants, et il existe de nombreuses façons d’obtenir des échantillons de sang. Pour les expériences impliquant un seul prélèvement sanguin au stade final, une quantité suffisante de sang peut être obtenue par ponction cardiaque ou prélèvement sanguin de l’aorte abdominale¹. Cependant, certaines études nécessitent des prélèvements sanguins répétés sur des rats pour des analyses sanguines ou biochimiques de routine, en particulier dans les études de pharmacocinétique et de toxicologie, où des prélèvements sanguins répétés sont nécessaires pour déterminer l’absorption, la distribution et le métabolisme des médicaments².

À l’heure actuelle, bien que le prélèvement sanguin dans les veines caudales soit la méthode la plus courante pour le prélèvement sanguin chez les rats, bien qu’elle ne nécessite pas d’anesthésie, cette méthode peut être difficile pour les prélèvements répétés, et le volume de sang prélevé est relativement faible ^3,4. De plus, bien que le sang puisse être prélevé dans les veines saphènes et péniennes, la quantité de sang obtenue est limitée et une anesthésie est nécessaire ^1,5. De plus, les échantillons de sang prélevés dans le plexus veineux sous-maxillaire, ainsi que dans les veines sublinguales, jugulaires et sous-clavières fournissent des échantillons de meilleure qualité, mais nécessitent généralement une anesthésie ou l’assistance de plusieurs personnes 1,6,7,8,9. Enfin, le prélèvement sanguin des sinus et des canaux rétro-orbitaires nécessite non seulement une anesthésie, mais peut également causer des blessures et du stress aux rats⁹.

La qualité des échantillons de sang généralement obtenus à partir des principales veines est généralement de la plus haute qualité¹. À l’heure actuelle, certaines études ont montré que le microéchantillonnage continu à travers la veine jugulaire est une méthode très appropriée pour la recherche toxicologique chez le rat, bien que cette méthode nécessite généralement un cathétérisme de la veine jugulaire 10,11,12. Par conséquent, il vaut la peine d’explorer comment obtenir des échantillons de sang de haute qualité conformément au principe des 3R de la recherche animale sans intervention chirurgicale. L’objectif de cette étude était de présenter une méthode permettant d’extraire efficacement le sang de la veine sous-clavière chez le rat. Cette technique permet de prélever rapidement des échantillons satisfaisants par le biais d’une procédure par une seule personne sans avoir besoin d’anesthésie.

Protocole

Cette étude a respecté les lignes directrices énoncées dans la 8e édition du Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire¹³. La recherche a reçu l’approbation du comité d’éthique du deuxième hôpital de l’Université de Lanzhou et a été documentée conformément aux directives ARRIVE 2.0¹⁴. Douze rats Wistar en bonne santé (six mâles pesant entre 290 et 330 g et six femelles pesant entre 250 et 280 g) âgés de 12 à 16 semaines ont été hébergés dans le laboratoire animalier BPL de l’Université de Lanzhou pendant 3 jours avant l’expérience proprement dite. Les cages à rats utilisées étaient de type R5, mesurant 545 mm x 395 mm x 200 mm, et étaient équipées d’une litière autoclave. Tous les rats ont eu un accès illimité à la nourriture et à l’eau. Le laboratoire a maintenu une humidité moyenne de 25%, une température moyenne de 24 °C et un cycle de lumière alternant entre le jour et la nuit (7h00/19h00). À la fin de l’étude, tous les animaux ont été euthanasiés sans cruauté à l’aide d’une surdose d’isoflurane. Pour obtenir des renseignements complets sur les matériaux et les instruments utilisés dans cette étude, veuillez consulter le tableau des matériaux.

1. Calcul de la taille de l’échantillon et sélection des animaux

1. Choisissez la méthode¹⁵ de l’équation des ressources pour estimer la taille de l’échantillon d’animaux à l’aide de l’équation (1).
   E = Nombre total d’animaux − Nombre total de groupes (1)
   Où E est le degré de liberté d’analyse de la variance (ANOVA) et est compris entre 10 et 20.
   REMARQUE : Dans cette étude, 12 animaux ont été divisés en deux groupes A et B (trois mâles et trois femelles par groupe).
2. Définissez le critère de jugement principal de cette étude comme le taux de réussite et le temps nécessaire à des prélèvements sanguins répétés par un seul individu.
3. Définissez les critères de jugement secondaires comme les changements dans le poids corporel du rat, la consommation de nourriture et d’eau, ainsi que l’incidence des événements indésirables (tels que les fractures de la clavicule, les hématomes sous-cutanés, le pneumothorax et la mortalité).
4. Définir la réussite de l’échantillonnage sanguin comme répondant aux critères suivants : i) moins de trois ponctions pour un seul prélèvement sanguin ; ii) un temps total (de la contention des rats à la fin du prélèvement sanguin) n’excédant pas 5 minutes ; et iii) atteindre le volume sanguin ciblé tout en obtenant du plasma clair. Considérez tout écart par rapport à ces critères comme un échec d’échantillonnage.

2. Contention des animaux et prélèvement sanguin

REMARQUE : Des échantillons de sang de rats des groupes A et B ont été prélevés par deux chercheurs expérimentés, qui avaient tous deux prélevé au moins 100 échantillons de sang. Des échantillons de sang ont été prélevés sur les deux groupes de rats pour un total de 96 fois sur une période de 4 jours. Cette méthode de prélèvement sanguin ne nécessite pas d’anesthésie ou de dispositifs de contention supplémentaires pour les rats. Cependant, cela nécessite des techniques de manipulation habiles.

1. À 8h00 la veille de la prise de sang (jour 1), assignez chaque rat à sa cage individuelle pendant que sa nourriture et son eau sont pesées. Ensuite, demandez à un autre chercheur, aveugle aux mesures, d’enregistrer le poids, la consommation de nourriture et la consommation d’eau des rats tous les jours à 8h00 à partir du jour 1.
2. Pour suivre ce protocole, faites d’abord une prise de sang à 10h00, puis à 22h00 chaque jour, en prélevant 0,15 mL de sang alternativement dans les veines sous-clavières des deux côtés.
   REMARQUE : La quantité de sang à prélever a été déterminée par le volume maximal que le rat de poids le plus faible pouvait tolérer en une semaine.
3. Rincer une seringue avec de l’héparine de sodium (25 U/mL) et désinfecter le site d’injection avec de l’alcool.
4. Caressez doucement la peau du dos du rat et pincez son cou à plusieurs reprises pour l’aider à se détendre (vidéo 1).
5. À l’aide du pouce et de l’index de la main non dominante, saisissez et soulevez fermement la peau du cou du rat (figure 1A et vidéo 1).
6. Avec la coordination de la main dominante, utilisez les trois doigts restants et la paume de la main non dominante pour fixer la peau du dos du rat et immobiliser ses membres avant (Figure 1B, C et vidéo 2).
   REMARQUE : Si le rat résiste ou se débat, cette procédure peut être répétée plusieurs fois pour aider le rat à s’habituer à la manipulation. Les étapes suivantes sont essentielles à la réussite de la collecte de sang.
7. À l’aide de l’index de la main non dominante, appuyez doucement sur la peau de la tête du rat tandis que les autres doigts, ainsi que la paume, aident à faire pivoter l’articulation de l’épaule vers l’extérieur. Au cours de ce processus, utilisez la main dominante pour étendre complètement l’articulation de l’épaule du rat (Figure 1D-F et vidéo 2).
8. Saisissez fermement le rat avec la main non dominante pour aligner la tête et le corps du rat en ligne droite (Figure 1G,H). Ensuite, utilisez la main dominante pour localiser la position de la clavicule et confirmez le site de ponction (Figure 1I, Vidéo 2 et Vidéo 3).
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de raser le rat. Dans la figure 1, le rasage n’a été effectué que pour montrer la position de la clavicule et de la ponction dans une plus grande mesure. Lorsque vous retenez les rats, en particulier les rats >350 g, le fait de permettre au rat de reposer ses pattes sur une surface solide aidera à supporter le poids de son corps. De plus, le dispositif de contention doit surveiller la fréquence respiratoire de chaque rat pendant la collecte de sang pour s’assurer que la contention n’est pas trop serrée, ce qui pourrait causer une détresse respiratoire.
9. En tenant la seringue parallèle au corps du rat dans la main dominante, avec la pointe de l’aiguille vers le haut et l’échelle de la seringue vers l’expérimentateur, maintenez un angle d’environ 15° avec la ligne médiane du corps du rat. Insérez l’aiguille à 0,5 cm sous l’encoche de la clavicule (à la jonction du tiers proximal de la clavicule et du sternum), en veillant à ce que l’aiguille reste parallèle au corps du rat (Figure 1J et Vidéo 3).
   REMARQUE : Une attention particulière doit être portée à l’angle et à la profondeur de l’insertion de l’aiguille pour éviter de percer le vaisseau sanguin ou de causer des dommages involontaires aux vaisseaux adjacents.
10. Retirez légèrement la seringue pour créer une pression négative, souvent accompagnée d’une sensation palpable de percée à l’entrée dans le vaisseau sanguin (particulièrement prononcée lors de la prise de sang initiale). Maintenez cette position et prélevez de 0,1 à 1,0 mL de sang à une vitesse constante au besoin (en suivant les directives de l’IACUC d’environ 4 à 5,3 mL/kg de sang par semaine¹) (Figure 1K et Vidéo 3).
11. S’il n’y a pas de sang lors de la ponction, essayez d’ajuster doucement l’angle et la profondeur de l’aiguille ou faites pivoter doucement la seringue (vidéo 3). Si trois tentatives consécutives du même côté sont infructueuses, arrêtez toute hémorragie, puis passez du côté opposé pour la ponction.
    REMARQUE : Une ponction rapide à travers la peau est conseillée pour éviter que le rat ne se débatte en raison de l’inconfort.
12. Appliquez un coton-tige pour l’hémostase et remettez le rat dans sa cage (vidéo 4).
13. Traiter les échantillons de sang conformément aux exigences expérimentales.

3. Traitement des échantillons de sang

1. Jetez l’aiguille de la seringue dans un récipient pour objets tranchants. Transférez le sang recueilli dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL préalablement rincé à l’héparine. Placez le tube dans une centrifugeuse, en le réglant à 4 °C et 1 200 x g, et centrifugez pendant 10 minutes pour séparer le plasma. Transférez le sérum à l’aide d’une pipette Pasteur de 1,0 ml dans un tube de microcentrifugation propre et conservez-le à -80 °C.
   REMARQUE : Pour éviter l’hémolyse due à la pression, retirez la pointe de l’aiguille si nécessaire. Lors de la ponction plasmatique, évitez de prélever des cellules sanguines au fond du tube. Parfois, la surface de la seringue peut recueillir de la fourrure de rat ; Veillez à ne pas laisser de fourrure pénétrer dans le tube, car cela peut entraîner la coagulation.

4. Analyse statistique

1. Présentez toutes les données sous forme de moyenne ±écart-type et testez-les pour vérifier l’homogénéité de la variance.
2. Utilisez le test exact de Fisher pour comparer les taux de réussite entre les groupes.
3. Utilisez un test t indépendant à deux échantillons pour comparer les moyennes globales entre les deux groupes.
4. Utilisez l’analyse de variance (ANOVA) pour des mesures continues telles que le temps de prélèvement sanguin, le poids corporel, l’apport alimentaire et la consommation d’eau. Considérons que P < 0,05 est statistiquement significatif.

Résultats

Les échantillons de plasma de haute qualité présentent une teinte, une clarté et une transparence jaune pâle, dépourvues de toute teinte rouge ou coagulation, comme le montre la figure 2A. La figure 2B montre l’hémolyse (côté gauche) ou la coagulation (côté droit) à la suite de procédures inappropriées, respectivement. Au cours de 96 séances de prélèvement sanguin en 4 jours, les temps moyens de prélèvement sanguin pour les groupes A...

Discussion

Bien que le prélèvement sanguin dans la veine caudale soit la méthode la plus courante pour les prélèvements sanguins répétés chez le rat, elle peut être influencée par les médicaments anesthésiques et, en raison de la petite taille de la veine caudale, la quantité de sang qui peut être prélevée en une seule fois est limitée, ce qui entraîne une durée de prélèvement sanguin plus longue ^4,5. Bien que les systèmes de chromatographie liquide (H...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% normal saline	Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	——	Prepared heparin sodium solution
1 mL Pasteur pipette	Biosharp	BS-XG-01-NS	Blood collection
1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm)	Shinva Medical Instrument Co.,Ltd.	0.45*12RWLB	Blood collection
1.5 mL Eppendorf tube	Biosharp	BS-15-M	Blood storage and collection
75% medical alcohol	Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.	——	Disinfection of rat blood collection site
Centrifuge tube holder	Biosharp	BS-05/15-SM60	——
Electronic scale	Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd.	JE1002	Weigh
Heparin sodium injection	Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd.	——	Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL
Low temperature centrifuge	HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument  Co., Ltd.	H1750R	Separation of serum