Muestreo de sangre de la vena subclavia en ratas conscientes

Resumen

Aquí presentamos una combinación de métodos efectivos de restricción en ratas y punción de la vena subclavia que permiten la recolección de sangre rápida, segura y repetida en ratas sin anestesia.

Resumen

Existen varios métodos establecidos para obtener muestras de sangre repetidas de ratas, siendo los métodos más comúnmente empleados el muestreo de la vena lateral de la cola sin anestesia y el muestreo de la vena yugular con anestesia. Sin embargo, la mayoría de estos métodos requieren asistencia y equipo anestésico y, en ocasiones, plantean dificultades en cuanto a la extracción de sangre o la mala calidad de las muestras de sangre. Además, estos métodos de extracción de sangre consumen mucho tiempo y recursos humanos cuando se requiere la toma repetida de muestras de sangre para un gran número de ratas. Este estudio presenta una técnica para la toma repetitiva de muestras de sangre en ratas no anestesiadas por un solo individuo competente. Se pueden obtener muestras de sangre altamente satisfactorias mediante la punción de la vena subclavia. El método demostró una impresionante tasa de éxito general del 95%, con una mediana de tiempo de solo 2 minutos desde la sujeción de la rata hasta la finalización de la extracción de sangre. Además, realizar recolecciones de sangre consecutivas dentro del rango designado no inflige ningún daño a las ratas. Vale la pena promover este método para la recolección de sangre, especialmente en estudios farmacocinéticos a gran escala.

Introducción

Las ratas son uno de los animales de experimentación más comunes, y hay muchas formas de obtener muestras de sangre. En el caso de los experimentos que impliquen una sola extracción de sangre en la fase final, se puede obtener una cantidad suficiente de sangre mediante punción cardíaca o extracción de sangre de la aorta abdominal¹. Sin embargo, algunos estudios requieren la recolección repetida de sangre de ratas para análisis de sangre o bioquímicos de rutina, especialmente en estudios de farmacocinética y toxicología, donde se requiere la recolección repetida de sangre para determinar la absorción, distribución y metabolismo de los medicamentos².

En la actualidad, aunque la extracción de sangre en las venas de la cola es el método más común para la toma de muestras de sangre de ratas, a pesar de no requerir anestesia, este método puede ser un desafío para las recolecciones repetidas, y el volumen de sangre recolectado es relativamente pequeño ^3,4. Además, aunque se puede recolectar sangre de las venas safena y del pene, la cantidad de sangre obtenida es limitada y se requiere anestesia ^1,5. Además, las muestras de sangre recogidas del plexo venoso submandibular, así como de las venas sublingual, yugular y subclavia, proporcionan muestras de mayor calidad, pero suelen requerir anestesia o la asistencia de varios individuos 1,6,7,8,9. Por último, la extracción de sangre de los senos paranasales retroorbitarios no solo requiere anestesia, sino que también puede causar lesiones y estrés a las ratas⁹.

La calidad de las muestras de sangre que normalmente se obtienen de las venas principales es generalmente del más^{alto nivel.} En la actualidad, algunos estudios han encontrado que la microtoma continua a través de la vena yugular es un método muy adecuado para la investigación toxicológica en ratas, aunque este método suele requerir el cateterismo de la vena yugular 10,11,12. Por lo tanto, vale la pena explorar cómo obtener muestras de sangre de alta calidad de acuerdo con el principio de las 3R de la investigación con animales sin intervención quirúrgica. El objetivo de este estudio fue presentar un método para extraer sangre de la vena subclavia de manera eficiente en ratas. Esta técnica permite la rápida recogida de muestras satisfactorias a través de un procedimiento de una sola persona sin necesidad de anestesia.

Protocolo

Este estudio se adhirió a las directrices trazadas en la 8ª edición de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio¹³. La investigación recibió la aprobación del Comité de Ética del Segundo Hospital de la Universidad de Lanzhou y se documentó el cumplimiento de las directrices ARRIVE 2.0¹⁴. Doce ratas Wistar sanas (seis machos con un peso de 290-330 g y seis hembras con un peso de 250-280 g) de entre 12 y 16 semanas de edad se alojaron en el Laboratorio de Animales GLP de la Universidad de Lanzhou durante 3 días antes del experimento real. Las jaulas para ratas utilizadas eran del tipo R5, de 545 mm x 395 mm x 200 mm, y estaban equipadas con material de cama esterilizado en autoclave. A todas las ratas se les proporcionó acceso sin restricciones tanto a comida como a agua. El laboratorio mantuvo una humedad promedio de 25%, una temperatura promedio de 24 °C y un ciclo de luz que alternaba entre el día y la noche (7:00 AM/7:00 PM). Al final del estudio, todos los animales fueron sacrificados humanamente con una sobredosis de isoflurano. Para obtener información completa sobre los materiales e instrumentos empleados en este estudio, consulte la Tabla de materiales.

1. Cálculo del tamaño de la muestra y selección de animales

1. Elija el método de la ecuación de recursos¹⁵ para estimar el tamaño de la muestra animal utilizando la ecuación (1).
   E = Número total de animales − Número total de grupos (1)
   Donde E es el grado de libertad de análisis de varianza (ANOVA) y oscila entre 10 y 20.
   NOTA: En este estudio, 12 animales fueron divididos en dos grupos A y B (tres machos y tres hembras por grupo).
2. Defina el resultado primario de este estudio como la tasa de éxito y el consumo de tiempo de la toma repetida de muestras de sangre por parte de un solo individuo.
3. Defina las medidas de resultado secundarias como los cambios en el peso corporal de la rata, la ingesta de alimentos y agua, así como la incidencia de eventos adversos (como fracturas de clavícula, hematomas subcutáneos, neumotórax y mortalidad).
4. Defina el muestreo de sangre exitoso como el cumplimiento de los siguientes criterios: i) menos de tres punciones para una sola extracción de sangre; ii) un tiempo total (desde la inmovilización de las ratas hasta la finalización de la extracción de sangre) que no exceda de 5 min; y iii) lograr el volumen sanguíneo deseado mientras se obtiene plasma claro. Considere cualquier desviación de estos criterios como un error de muestreo.

2. Sujeción de animales y extracción de sangre

NOTA: Las muestras de sangre de ratas de los grupos A y B fueron recolectadas por dos investigadores experimentados, quienes habían extraído al menos 100 muestras de sangre. Se recogieron muestras de sangre de ambos grupos de ratas un total de 96 veces en el transcurso de 4 días. Este método de extracción de sangre no requiere anestesia ni dispositivos de sujeción adicionales para las ratas. Sin embargo, requiere técnicas de manejo expertas.

1. A las 8:00 a.m. del día anterior a la toma de muestras de sangre (día 1), asigne a cada rata a su jaula individual mientras se pesan su comida y agua. Luego, haga que otro investigador, ciego a las mediciones, registre el peso, el consumo de alimentos y la ingesta de agua de las ratas todos los días a las 8:00 a.m. desde el día 1 en adelante.
2. Para seguir este protocolo, primero se debe extraer sangre a las 10:00 a.m. y luego a las 10:00 p.m. todos los días, recolectando 0.15 mL de sangre alternativamente de las venas subclavias en ambos lados.
   NOTA: La cantidad de sangre a recolectar se determinó por el volumen máximo que la rata de menor peso podía tolerar dentro de una semana.
3. Enjuague una jeringa con heparina sódica (25 U/mL) y desinfecte el lugar de la inyección con alcohol.
4. Acaricia suavemente la piel de la espalda de la rata y pellizca su cuello repetidamente para ayudar a la rata a relajarse (Video 1).
5. Con el pulgar y el índice de la mano no dominante, agarre y levante firmemente la piel del cuello de la rata (Figura 1A y Video 1).
6. Con la coordinación de la mano dominante, use los tres dedos restantes y la palma de la mano no dominante para asegurar la piel de la espalda de la rata e inmovilizar sus extremidades delanteras (Figura 1B, C y Video 2).
   NOTA: Si la rata se resiste o lucha, este procedimiento se puede repetir varias veces para ayudar a la rata a acostumbrarse a la manipulación. Los siguientes pasos son clave para una recolección de sangre exitosa.
7. Usando el dedo índice de la mano no dominante, empuja suavemente hacia abajo la piel de la cabeza de la rata mientras los otros dedos, junto con la palma, ayudan a rotar hacia afuera la articulación del hombro. Durante este proceso, use la mano dominante para extender completamente la articulación del hombro de la rata (Figura 1D-F y Video 2).
8. Sujete a la rata firmemente con la mano no dominante para alinear la cabeza y el cuerpo de la rata en línea recta (Figura 1G, H). Luego, use la mano dominante para ubicar la posición de la clavícula y confirmar el sitio de punción (Figura 1I, Video 2 y Video 3).
   NOTA: No es necesario afeitar a la rata. En la Figura 1, el afeitado se realizó solo para mostrar la clavícula y la posición de punción en mayor medida. Al sujetar a las ratas, especialmente a las ratas >350 g, permitir que la rata descanse las patas sobre una superficie sólida ayudará a soportar su peso corporal. Además, el inmovilizador debe controlar la frecuencia respiratoria de cada rata mientras recolecta sangre para asegurarse de que la sujeción no esté demasiado apretada, lo que puede causar dificultad respiratoria.
9. Sosteniendo la jeringa paralela al cuerpo de la rata en la mano dominante, con la punta de la aguja hacia arriba y la escama de la jeringa hacia el experimentador, mantenga un ángulo de aproximadamente 15° con la línea media del cuerpo de la rata. Inserte la aguja 0,5 cm por debajo de la muesca de la clavícula (en la unión del tercio proximal de la clavícula y el esternón), asegurándose de que la aguja permanezca paralela al cuerpo de la rata (Figura 1J y Video 3).
   NOTA: Se debe prestar especial atención al ángulo y la profundidad de la inserción de la aguja para evitar perforar el vaso sanguíneo o causar daños inadvertidos a los vasos adyacentes.
10. Retire suavemente la jeringa ligeramente para crear una presión negativa, a menudo acompañada de una sensación palpable de avance al entrar en el vaso sanguíneo (particularmente pronunciada durante la extracción inicial de sangre). Mantenga esta posición y recoja 0,1-1,0 ml de sangre a una velocidad constante según sea necesario (siguiendo las pautas de la IACUC de aproximadamente 4-5,3 ml/kg de sangre por semana¹) (Figura 1K y video 3).
11. Si no hay sangre en el momento de la punción, intente ajustar suavemente el ángulo y la profundidad de la aguja o gire suavemente la jeringa (Video 3). Si tres intentos consecutivos en el mismo lado no tienen éxito, detenga todo el sangrado y luego cambie al lado opuesto para la punción.
    NOTA: Es aconsejable realizar una punción rápida a través de la piel para evitar que la rata luche debido a la incomodidad.
12. Aplique un hisopo de algodón para la hemostasia y devuelva a la rata a su jaula (Video 4).
13. Procesar las muestras de sangre de acuerdo con los requisitos experimentales.

3. Procesamiento de muestras de sangre

1. Deseche la aguja de la jeringa en un recipiente para objetos punzocortantes. Transferir la sangre recolectada a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente enjuagado con heparina. Coloque el tubo en una centrífuga, ajustándolo a 4 °C y 1.200 x g, y centrifugue durante 10 minutos para separar el plasma. Transfiera el suero con una pipeta Pasteur de 1,0 ml a un tubo de microcentrífuga limpio y guárdelo a -80 °C.
   NOTA: Para evitar la hemólisis debida a la presión, retire la punta de la aguja cuando sea necesario. Durante la aspiración de plasma, evite extraer células sanguíneas del fondo del tubo. Ocasionalmente, la superficie de la jeringa puede acumular pelo de rata; Tenga cuidado de no permitir que entre pelo en el tubo, ya que puede provocar coágulos.

4. Análisis estadístico

1. Presente todos los datos como media ± desviación estándar y pruebe la homogeneidad de la varianza.
2. Utilice la prueba exacta de Fisher para comparar las tasas de éxito entre los grupos.
3. Utilice una prueba t independiente de dos muestras para comparar las medias generales entre los dos grupos.
4. Utilice el análisis de varianza (ANOVA) para mediciones continuas como el tiempo de muestreo de sangre, el peso corporal, la ingesta de alimentos y el consumo de agua. Considere que P < 0,05 es estadísticamente significativo.

Resultados

Las muestras de plasma de alta calidad exhiben un tono, claridad y transparencia de color amarillo pálido, desprovistos de cualquier tinte rojo o coagulación, como se muestra en la Figura 2A. La Figura 2B muestra hemólisis (lado izquierdo) o coagulación (lado derecho) como resultado de procedimientos inadecuados, respectivamente. En el transcurso de 96 sesiones de extracción de sangre en 4 días, los tiempos promedio de extracción de sangre para los grupos...

Discusión

Aunque la extracción de sangre de la vena de la cola es el método más común para la toma repetida de muestras de sangre en ratas, podría estar influenciado por los fármacos anestésicos y, debido al pequeño tamaño de la vena de la cola, la cantidad de sangre que se puede recolectar en una sola instancia es limitada, lo que lleva a una mayor duración de la recolección de sangre ^4,5. Aunque los sistemas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% normal saline	Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	——	Prepared heparin sodium solution
1 mL Pasteur pipette	Biosharp	BS-XG-01-NS	Blood collection
1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm)	Shinva Medical Instrument Co.,Ltd.	0.45*12RWLB	Blood collection
1.5 mL Eppendorf tube	Biosharp	BS-15-M	Blood storage and collection
75% medical alcohol	Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.	——	Disinfection of rat blood collection site
Centrifuge tube holder	Biosharp	BS-05/15-SM60	——
Electronic scale	Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd.	JE1002	Weigh
Heparin sodium injection	Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd.	——	Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL
Low temperature centrifuge	HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument  Co., Ltd.	H1750R	Separation of serum