Blutentnahme der Vena subclavia bei bewussten Ratten

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Kombination aus effektiver Rattenrestriktion und Subclaviavenenpunktionsmethoden vor, die eine schnelle, sichere und wiederholte Blutentnahme bei Ratten ohne Anästhesie ermöglichen.

Zusammenfassung

Es gibt mehrere etablierte Methoden zur Gewinnung wiederholter Blutproben von Ratten, wobei die am häufigsten verwendeten Methoden die laterale Schwanzvenenentnahme ohne Anästhesie und die Jugularvenenentnahme mit Anästhesie sind. Die meisten dieser Methoden erfordern jedoch Hilfe und Anästhesiegeräte und werfen manchmal Schwierigkeiten in Bezug auf die Blutentnahme oder die schlechte Qualität der Blutproben auf. Darüber hinaus verbrauchen diese Methoden der Blutentnahme viel Zeit und personelle Ressourcen, wenn bei einer großen Anzahl von Ratten wiederholte Blutentnahmen erforderlich sind. In dieser Studie wird eine Technik zur wiederholten Blutentnahme bei nicht anästhesierten Ratten durch eine einzelne kompetente Person vorgestellt. Sehr zufriedenstellende Blutproben können durch Punktion der Vena subclavia gewonnen werden. Die Methode zeigte eine beeindruckende Gesamterfolgsrate von 95 % mit einer medianen Zeit von nur 2 Minuten von der Fixierung der Ratte bis zum Abschluss der Blutentnahme. Darüber hinaus fügt die Durchführung von aufeinanderfolgenden Blutentnahmen innerhalb des vorgesehenen Bereichs den Ratten keinen Schaden zu. Diese Methode ist es wert, für die Blutentnahme gefördert zu werden, insbesondere in groß angelegten pharmakokinetischen Studien.

Einleitung

Ratten gehören zu den häufigsten Versuchstieren, und es gibt viele Möglichkeiten, Blutproben zu gewinnen. Bei Experimenten mit einer einzigen Blutentnahme in der Schlussphase kann eine ausreichende Menge Blut durch Herzpunktion oder Blutentnahme aus der Bauchaorta gewonnen werden¹. Einige Studien erfordern jedoch eine wiederholte Blutentnahme von Ratten für routinemäßige Blut- oder biochemische Analysen, insbesondere bei pharmakokinetischen und toxikologischen Studien, bei denen eine wiederholte Blutentnahme erforderlich ist, um die Resorption, Verteilung und den Metabolismus von Arzneimitteln zu bestimmen².

Obwohl die Blutentnahme aus der Schwanzvene die häufigste Methode für die Blutentnahme von Ratten ist, obwohl keine Anästhesie erforderlich ist, kann diese Methode bei wiederholten Blutentnahmen eine Herausforderung darstellen, und die Menge des entnommenen Blutes ist relativ gering ^3,4. Obwohl Blut aus den Stamm- und Penisvenen entnommen werden kann, ist die gewonnene Blutmenge begrenzt und eine Anästhesie ist erforderlich ^1,5. Darüber hinaus liefern Blutproben, die aus dem submandibulären Venenplexus sowie aus den Venen sublingual, jugularis und subclavia entnommen werden, qualitativ hochwertigere Proben, erfordern jedoch in der Regel eine Anästhesie oder die Unterstützung mehrerer Personen 1,6,7,8,9. Schließlich erfordert die retroorbitale Sinus-/Kanalblutentnahme nicht nur eine Anästhesie, sondern kann auch zu Verletzungen und Stress bei den Ratten führen⁹.

Die Qualität von Blutproben, die typischerweise aus großen Venen gewonnen werden, entspricht in der Regel dem höchsten Standard¹. Gegenwärtig haben einige Studien ergeben, dass die kontinuierliche Mikroprobenahme durch die Halsvene eine sehr geeignete Methode für die toxikologische Forschung an Ratten ist, obwohl diese Methode in der Regel eine Halsvenenkatheterisierung erfordert 10,11,12. Daher lohnt es sich zu erforschen, wie man ohne chirurgischen Eingriff qualitativ hochwertige Blutproben nach dem 3R-Prinzip der Tierversuche gewinnen kann. Das Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur effizienten Entnahme von Blut aus der Vena subclavia bei Ratten vorzustellen. Diese Technik ermöglicht die schnelle Entnahme zufriedenstellender Proben durch ein Ein-Personen-Verfahren, ohne dass eine Anästhesie erforderlich ist.

Protokoll

Diese Studie entsprach den Richtlinien der 8. Auflage des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren¹³. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Lanzhou University Second Hospital genehmigt und in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien 2.0¹⁴ dokumentiert. Zwölf gesunde Wistar-Ratten (sechs Männchen mit einem Gewicht von 290-330 g und sechs Weibchen mit einem Gewicht von 250-280 g) im Alter von 12-16 Wochen wurden vor dem eigentlichen Experiment für 3 Tage im GLP-Tierlabor der Universität Lanzhou untergebracht. Die verwendeten Rattenkäfige waren vom Typ R5 mit den Maßen 545 mm x 395 mm x 200 mm und mit autoklaviertem Einstreumaterial ausgestattet. Alle Ratten erhielten uneingeschränkten Zugang zu Futter und Wasser. Das Labor hatte eine durchschnittliche Luftfeuchtigkeit von 25 %, eine Durchschnittstemperatur von 24 °C und einen Lichtzyklus, der zwischen Tag und Nacht wechselte (7:00 Uhr/19:00 Uhr). Am Ende der Studie wurden alle Tiere mit einer Überdosis Isofluran auf humane Weise eingeschläfert. Umfassende Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Materialien und Instrumenten finden Sie in der Materialtabelle.

1. Berechnung der Stichprobengröße und Auswahl der Tiere

1. Wählen Sie die Ressourcengleichungsmethode¹⁵ aus, um die Stichprobengröße des Tieres anhand von Gleichung (1) zu schätzen.
   E = Gesamtzahl der Tiere − Gesamtzahl der Gruppen (1)
   Dabei ist E der Freiheitsgrad der Varianzanalyse (ANOVA) und reicht von 10 bis 20.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden 12 Tiere in zwei Gruppen A und B eingeteilt (drei Männchen und drei Weibchen pro Gruppe).
2. Definieren Sie den primären Endpunkt dieser Studie als die Erfolgsrate und den Zeitaufwand der wiederholten Blutentnahme durch eine einzelne Person.
3. Definieren Sie die sekundären Endpunkte als Veränderungen des Körpergewichts der Ratte, der Nahrungs- und Wasseraufnahme sowie der Häufigkeit unerwünschter Ereignisse (wie Schlüsselbeinfrakturen, subkutane Hämatome, Pneumothorax und Mortalität).
4. Definieren Sie eine erfolgreiche Blutentnahme als Erfüllung der folgenden Kriterien: i) weniger als drei Punktionen für eine einzige Blutentnahme; ii) eine Gesamtzeit (von der Fixierung der Ratte bis zur Beendigung der Blutentnahme) von höchstens 5 Minuten; und iii) das Erreichen des angestrebten Blutvolumens bei gleichzeitiger Gewinnung von klarem Plasma. Betrachten Sie jede Abweichung von diesen Kriterien als Stichprobenfehler.

2. Fixierung der Tiere und Blutentnahme

HINWEIS: Blutproben von Ratten der Gruppen A und B wurden von zwei erfahrenen Forschern entnommen, die beide mindestens 100 Blutproben entnommen hatten. Von beiden Rattengruppen wurden über einen Zeitraum von 4 Tagen insgesamt 96 Mal Blutproben entnommen. Diese Blutentnahmemethode erfordert keine Anästhesie oder zusätzliche Fixiervorrichtungen für die Ratten. Es erfordert jedoch geschickte Handhabungstechniken.

1. Am Tag vor der Blutentnahme (Tag 1) um 8:00 Uhr wird jede Ratte in ihren eigenen Käfig eingeteilt, während Futter und Wasser gewogen werden. Lassen Sie dann einen anderen Forscher, der für die Messungen blind ist, ab Tag 1 jeden Tag um 8:00 Uhr das Gewicht, die Nahrungsaufnahme und die Wasseraufnahme der Ratten aufzeichnen.
2. Um dieses Protokoll zu befolgen, nehmen Sie jeden Tag zuerst um 10:00 Uhr und dann um 22:00 Uhr Blut ab, wobei abwechselnd 0,15 ml Blut aus den Venen subclavia auf beiden Seiten entnommen werden.
   HINWEIS: Die zu entnehmende Blutmenge wurde durch das maximale Volumen bestimmt, das die Ratte mit dem niedrigsten Gewicht innerhalb einer Woche vertragen konnte.
3. Spülen Sie eine Spritze mit Natriumheparin (25 U/ml) und desinfizieren Sie die Injektionsstelle mit Alkohol.
4. Streicheln Sie vorsichtig über die Rückenhaut der Ratte und kneifen Sie wiederholt in den Hals, um der Ratte zu helfen, sich zu entspannen (Video 1).
5. Greifen und heben Sie mit dem Daumen und Zeigefinger der nicht dominanten Hand die Halshaut der Ratte fest an (Abbildung 1A und Video 1).
6. Verwenden Sie mit der Koordination der dominanten Hand die verbleibenden drei Finger und die Handfläche der nicht-dominanten Hand, um die Rückenhaut der Ratte zu sichern und ihre vorderen Gliedmaßen zu immobilisieren (Abbildung 1B, C und Video 2).
   HINWEIS: Wenn die Ratte Widerstand leistet oder sich wehrt, kann dieser Vorgang mehrmals wiederholt werden, um der Ratte zu helfen, sich an die Handhabung zu gewöhnen. Die folgenden Schritte sind der Schlüssel zu einer erfolgreichen Blutentnahme.
7. Drücken Sie mit dem Zeigefinger der nicht-dominanten Hand sanft auf die Kopfhaut der Ratte, während die anderen Finger zusammen mit der Handfläche helfen, das Schultergelenk nach außen zu drehen. Verwenden Sie während dieses Vorgangs die dominante Hand, um das Schultergelenk der Ratte vollständig zu strecken (Abbildung 1D-F und Video 2).
8. Fassen Sie die Ratte fest mit der nicht-dominanten Hand, um den Kopf und den Körper der Ratte in einer geraden Linie auszurichten (Abbildung 1G,H). Verwenden Sie dann die dominante Hand, um die Position des Schlüsselbeins zu lokalisieren und die Einstichstelle zu bestätigen (Abbildung 1I, Video 2 und Video 3).
   HINWEIS: Das Rasieren der Ratte ist nicht notwendig. In Abbildung 1 wurde nur rasiert, um die Schlüsselbein- und Punktionsposition stärker zu zeigen. Bei der Fixierung von Ratten, insbesondere Ratten >350 g, hilft es, der Ratte zu erlauben, ihre Füße auf einer festen Oberfläche abzulegen, um ihr Körpergewicht zu stützen. Darüber hinaus sollte der Fixierer die Atemfrequenz jeder Ratte überwachen, während er Blut entnimmt, um sicherzustellen, dass die Fessel nicht zu fest sitzt, was zu Atemnot führen kann.
9. Halten Sie die Spritze parallel zum Körper der Ratte in der dominanten Hand, wobei die Nadelspitze nach oben zeigt und die Spritzenskala zum Versuchsleiter zeigt, und halten Sie einen Winkel von etwa 15° zur Mittellinie des Rattenkörpers. Führen Sie die Nadel 0,5 cm unterhalb der Schlüsselbeinkerbe (an der Verbindung des proximalen Drittels des Schlüsselbeins und des Brustbeins) ein und achten Sie darauf, dass die Nadel parallel zum Körper der Ratte bleibt (Abbildung 1J und Video 3).
   HINWEIS: Besonderes Augenmerk sollte auf den Winkel und die Tiefe der Nadeleinführung gelegt werden, um ein Durchstechen des Blutgefäßes oder eine versehentliche Beschädigung benachbarter Gefäße zu vermeiden.
10. Ziehen Sie die Spritze vorsichtig leicht zurück, um einen Unterdruck zu erzeugen, der oft von einem spürbaren Durchbruchsgefühl beim Eintritt in das Blutgefäß begleitet wird (besonders ausgeprägt während der anfänglichen Blutentnahme). Halten Sie diese Position und entnehmen Sie bei Bedarf 0,1-1,0 ml Blut mit konstanter Geschwindigkeit (gemäß den IACUC-Richtlinien von ca. 4-5,3 ml/kg Blut pro Woche¹) (Abbildung 1K und Video 3).
11. Wenn bei der Punktion kein Blut vorhanden ist, versuchen Sie, den Winkel und die Tiefe der Nadel vorsichtig einzustellen oder die Spritze vorsichtig zu drehen (Video 3). Wenn drei aufeinanderfolgende Versuche auf derselben Seite erfolglos sind, stoppen Sie alle Blutungen und wechseln Sie dann für die Punktion auf die gegenüberliegende Seite.
    HINWEIS: Eine schnelle Punktion durch die Haut ist ratsam, um zu verhindern, dass die Ratte aufgrund von Beschwerden zu kämpfen hat.
12. Legen Sie ein Wattestäbchen zur Hämostase an und bringen Sie die Ratte in ihren Käfig zurück (Video 4).
13. Bereiten Sie die Blutproben entsprechend den experimentellen Anforderungen auf.

3. Verarbeitung von Blutproben

1. Entsorgen Sie die Spritzennadel in einem Behälter für scharfe und scharfe Gegenstände. Das entnommene Blut wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das zuvor mit Heparin gespült wurde. Stellen Sie das Röhrchen in eine Zentrifuge, stellen Sie es auf 4 °C und 1.200 x g ein und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang, um das Plasma abzutrennen. Das Serum wird mit einer 1,0-ml-Pasteurpipette in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei -80 °C gelagert.
   HINWEIS: Um eine Hämolyse aufgrund von Druck zu verhindern, entfernen Sie bei Bedarf die Nadelspitze. Vermeiden Sie während der Plasmaaspiration die Entnahme von Blutzellen vom Boden des Röhrchens. Gelegentlich kann sich auf der Oberfläche der Spritze Rattenfell sammeln. Achten Sie darauf, dass kein Fell in die Röhre gelangt, da dies zu Gerinnseln führen kann.

4. Statistische Analyse

1. Stellen Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dar und testen Sie sie auf Homogenität der Varianz.
2. Verwenden Sie den exakten Fisher-Test, um die Erfolgsquoten zwischen den Gruppen zu vergleichen.
3. Verwenden Sie einen unabhängigen t-Test mit zwei Stichproben, um die Gesamtmittelwerte zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen.
4. Verwenden Sie die Varianzanalyse (ANOVA) für kontinuierliche Messungen wie Blutentnahmezeit, Körpergewicht, Nahrungsaufnahme und Wasserverbrauch. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Hochwertige Plasmaproben weisen einen blassgelben Farbton, Klarheit und Transparenz auf, frei von jeglichem Rotstich oder Blutgerinnung, wie in Abbildung 2A dargestellt. Abbildung 2B zeigt die Hämolyse (linke Seite) bzw. die Gerinnung (rechte Seite) als Folge unsachgemäßer Eingriffe. Im Verlauf von 96 Blutabnahmesitzungen innerhalb von 4 Tagen betrugen die durchschnittlichen Einzelblutabnahmezeiten für die Gruppen A und B 11...

Diskussion

Obwohl die Blutentnahme der Schwanzvene die häufigste Methode zur wiederholten Blutentnahme bei Ratten ist, kann sie durch Anästhesiemedikamente beeinflusst werden, und aufgrund der geringen Größe der Schwanzvene ist die Blutmenge, die in einem einzigen Fall entnommen werden kann, begrenzt, was zu einer längeren Blutentnahmedauer führt ^4,5. Obwohl Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Systeme in Kombination mit...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% normal saline	Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	——	Prepared heparin sodium solution
1 mL Pasteur pipette	Biosharp	BS-XG-01-NS	Blood collection
1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm)	Shinva Medical Instrument Co.,Ltd.	0.45*12RWLB	Blood collection
1.5 mL Eppendorf tube	Biosharp	BS-15-M	Blood storage and collection
75% medical alcohol	Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.	——	Disinfection of rat blood collection site
Centrifuge tube holder	Biosharp	BS-05/15-SM60	——
Electronic scale	Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd.	JE1002	Weigh
Heparin sodium injection	Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd.	——	Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL
Low temperature centrifuge	HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument  Co., Ltd.	H1750R	Separation of serum