Bilinçli Sıçanlarda Subklavyen Ven Kan Örneklemesi

Özet

Burada, sıçanlarda anestezi olmadan hızlı, güvenli ve tekrarlanan kan alımını sağlayan etkili sıçan kısıtlaması ve subklavyen ven ponksiyon yöntemlerinin bir kombinasyonunu sunuyoruz.

Özet

Sıçanlardan tekrarlanan kan örnekleri elde etmek için birkaç yerleşik yöntem vardır, en sık kullanılan yöntemler anestezisiz lateral kuyruk ven örneklemesi ve anestezi ile juguler ven örneklemesidir. Ancak bu yöntemlerin çoğu yardım ve anestezik ekipman gerektirmekte ve bazen kan alınması veya kan örneklerinin kalitesizliği açısından zorluklar yaratmaktadır. Ek olarak, bu kan toplama yöntemleri, çok sayıda sıçan için tekrarlanan kan örneklemesi gerektiğinde önemli ölçüde zaman ve insan kaynağı tüketir. Bu çalışma, anestezi uygulanmamış sıçanlarda tek bir yetkin birey tarafından tekrarlayan kan örneklemesi için bir teknik sunmaktadır. Subklavyen venin delinmesi ile oldukça tatmin edici kan örnekleri alınabilir. Yöntem, sıçan kısıtlamasından kan alımının tamamlanmasına kadar sadece 2 dakikalık bir medyan süre ile %95'lik etkileyici bir genel başarı oranı gösterdi. Ayrıca, belirlenen aralıkta ardışık kan alımlarının yapılması sıçanlara herhangi bir zarar vermez. Bu yöntem, özellikle büyük ölçekli farmakokinetik çalışmalarda kan toplama için teşvik edilmeye değerdir.

Giriş

Sıçanlar en yaygın deney hayvanlarından biridir ve kan örnekleri almanın birçok yolu vardır. Sonuç aşamasında tek bir kan alımını içeren deneyler için, kardiyak ponksiyon veya abdominal aort kan alımı yoluyla yeterli miktarda kan elde edilebilir¹. Bununla birlikte, bazı çalışmalar, özellikle ilaçların emilimini, dağılımını ve metabolizmasını belirlemek için tekrarlanan kan alımının gerekli olduğu farmakokinetik ve toksikoloji çalışmalarında, rutin kan veya biyokimyasal analiz için sıçanlardan tekrarlanan kan alınmasını gerektirir².

Şu anda, kuyruk ven kanı alımı, sıçanlardan kan örneklemesi için en yaygın yöntem olmasına rağmen, anestezi gerektirmemesine rağmen, bu yöntem tekrarlanan toplamalar için zorlayıcı olabilir ve toplanan kan hacmi nispeten küçüktür ^3,4. Ek olarak, safen ve penil damarlardan kan alınabilmesine rağmen, elde edilen kan miktarı sınırlıdır ve anestezi gerekir ^1,5. Ayrıca, submandibular venöz pleksusun yanı sıra dil altı, juguler ve subklavyen damarlardan toplanan kan örnekleri daha yüksek kaliteli örnekler sağlar, ancak tipik olarak anestezi veya birden fazla kişinin yardımını gerektirir 1,6,7,8,9. Son olarak, retro-orbital sinüs/kanal kan alımı sadece anestezi gerektirmekle kalmaz, aynı zamanda sıçanlarda potansiyel olarak yaralanma ve strese neden olabilir⁹.

Tipik olarak ana damarlardan elde edilen kan örneklerinin kalitesi genellikle en yüksek standarttır¹. Şu anda, bazı çalışmalar, juguler ven yoluyla sürekli mikrosampasyonun sıçanlarda toksikolojik araştırmalar için çok uygun bir yöntem olduğunu bulmuştur, ancak bu yöntem genellikle juguler ven kateterizasyonu gerektirir 10,11,12. Bu nedenle, cerrahi müdahale olmadan hayvan araştırmalarının 3R ilkesine uygun olarak yüksek kaliteli kan örneklerinin nasıl elde edileceğini araştırmaya değer. Bu çalışmanın amacı, sıçanlarda subklavyen venden etkili bir şekilde kan ekstraksiyonu için bir yöntem sunmaktı. Bu teknik, anesteziye gerek kalmadan tek kişilik bir prosedürle tatmin edici örneklerin hızlı bir şekilde toplanmasını sağlar.

Protokol

Bu çalışma, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun 8. baskısında belirtilen yönergelere bağlı kalmıştır¹³. Araştırma, Lanzhou Üniversitesi İkinci Hastanesi Etik Kurulu'ndan onay aldı ve ARRIVE yönergeleri 2.0^14'e uygun olarak belgelendi. 12-16 haftalık on iki sağlıklı Wistar sıçanı (290-330 g ağırlığında altı erkek ve 250-280 g ağırlığında altı dişi), gerçek deneyden 3 gün önce Lanzhou Üniversitesi GLP Hayvan Laboratuvarı'na yerleştirildi. Kullanılan sıçan kafesleri, 545 mm x 395 mm x 200 mm ölçülerinde R5 tipindeydi ve otoklavlanmış yatak malzemesi ile donatılmıştı. Tüm sıçanlara hem yiyecek hem de suya sınırsız erişim sağlandı. Laboratuvarda ortalama nem oranı %25, sıcaklık ortalama 24 °C ve gece ile gündüz arasında değişen bir ışık döngüsü (07:00/19:00) sağlandı. Çalışmanın sonunda, tüm hayvanlara aşırı dozda izofluran kullanılarak insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı. Bu çalışmada kullanılan malzeme ve araçlarla ilgili kapsamlı bilgi için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.

1. Örneklem büyüklüğü hesaplaması ve hayvan seçimi

1. Denklem⁽¹⁵) kullanarak hayvan örneklem büyüklüğünü tahmin etmek için kaynak denklem yöntemini 1 seçin.
   E = Toplam hayvan sayısı − Toplam grup sayısı (1)
   Burada E , varyans analizi serbestlik derecesidir (ANOVA) ve 10 ile 20 arasında değişir.
   NOT: Bu çalışmada 12 hayvan A ve B olmak üzere iki gruba ayrıldı (grup başına üç erkek ve üç dişi).
2. Bu çalışmanın birincil sonucunu, tek bir kişi tarafından tekrarlanan kan örneklemesinin başarı oranı ve zaman tüketimi olarak tanımlayın.
3. İkincil sonuç ölçütlerini, sıçan vücut ağırlığı, yiyecek ve su alımındaki değişikliklerin yanı sıra advers olayların (klavikula kırıkları, deri altı hematomlar, pnömotoraks ve mortalite gibi) insidansı olarak tanımlayın.
4. Başarılı kan örneklemesini aşağıdaki kriterleri karşılayacak şekilde tanımlayın: i) tek bir kan alımı için üçten az delinme; ii) 5 dakikayı geçmeyen toplam süre (sıçan kısıtlamasından kan alımının tamamlanmasına kadar); ve iii) berrak plazma elde ederken hedeflenen kan hacmine ulaşmak. Bu kriterlerden herhangi bir sapmayı örnekleme hatası olarak kabul edin.

2. Hayvan kısıtlama ve kan alma

NOT: A ve B grubu sıçanlardan alınan kan örnekleri, her ikisi de en az 100 kan örneği almış olan iki deneyimli araştırmacı tarafından toplanmıştır. Her iki sıçan grubundan 4 gün boyunca toplam 96 kez kan örnekleri toplandı. Bu kan alma yöntemi, sıçanlar için anestezi veya ek kısıtlama cihazları gerektirmez. Ancak, usta kullanım teknikleri gerektirir.

1. Kan örneklemesinden önceki gün (1. gün) sabah saat 8:00'de, yiyecek ve suyu tartılırken her sıçanı kendi kafesine atayın. Daha sonra, ölçümlere kör olan başka bir araştırmacıya, farelerin ağırlığını, yiyecek tüketimini ve su alımını 1. günden itibaren her gün saat 8: 00'de kaydedin.
2. Bu protokolü takip etmek için, önce her gün saat 10:00'da ve daha sonra saat 10:00'da kan alın, her iki taraftaki subklavyen damarlardan dönüşümlü olarak 0.15 mL kan alın.
   NOT: Toplanacak kan miktarı, en düşük ağırlıktaki sıçanın bir hafta içinde tolere edebileceği maksimum hacme göre belirlendi.
3. Bir şırıngayı sodyum heparin (25 U/mL) ile yıkayın ve enjeksiyon bölgesini alkolle dezenfekte edin.
4. Sıçanın sırt derisini nazikçe okşayın ve sıçanın rahatlamasına yardımcı olmak için boynunu tekrar tekrar sıkıştırın (Video 1).
5. Baskın olmayan elin başparmağını ve işaret parmağını kullanarak, sıçanın boyun derisini sıkıca kavrayın ve kaldırın (Şekil 1A ve Video 1).
6. Baskın elin koordinasyonuyla, sıçanın arka derisini sabitlemek ve ön uzuvlarını hareketsiz hale getirmek için baskın olmayan elin kalan üç parmağını ve avuç içini kullanın (Şekil 1B, C ve Video 2).
   NOT: Sıçan direnir veya mücadele ederse, sıçanın kullanıma alışmasına yardımcı olmak için bu prosedür birkaç kez tekrarlanabilir. Aşağıdaki adımlar başarılı kan alımının anahtarıdır.
7. Baskın olmayan elin işaret parmağını kullanarak, farenin kafa derisini hafifçe aşağı doğru bastırın, diğer parmaklar avuç içi ile birlikte omuz eklemini dışa doğru döndürmeye yardımcı olur. Bu işlem sırasında, sıçanın omuz eklemini tamamen uzatmak için baskın elinizi kullanın (Şekil 1D-F ve Video 2).
8. Sıçanın başını ve vücudunu düz bir çizgide hizalamak için baskın olmayan elinizle sıçanı sıkıca kavrayın (Şekil 1G,H). Ardından, klavikulanın konumunu bulmak ve delinme bölgesini doğrulamak için baskın elinizi kullanın (Şekil 1I, Video 2 ve Video 3).
   NOT: Fareyi tıraş etmek gerekli değildir. Şekil 1'de tıraşlama sadece köprücük kemiği ve ponksiyon pozisyonunu daha büyük ölçüde göstermek için yapılmıştır. Sıçanları, özellikle sıçanları >350 g kısıtlarken, sıçanın ayaklarını sağlam bir yüzeye koymasına izin vermek, vücut ağırlığını desteklemeye yardımcı olacaktır. Ek olarak, kısıtlayıcı, kısıtlamanın solunum sıkıntısına neden olabilecek çok sıkı olmadığından emin olmak için kan toplarken her sıçanın solunum hızını izlemelidir.
9. Şırıngayı baskın elde sıçanın vücuduna paralel tutarak, iğne ucu yukarı bakacak ve şırınga ölçeği deneyciye doğru bakacak şekilde, sıçanın vücudunun orta hattı ile yaklaşık 15°'lik bir açı sağlayın. İğneyi klavikula çentiğinin 0,5 cm altına (klavikula proksimal üçte birlik kısmının ve sternumun birleştiği yere) sokarak iğnenin sıçanın vücuduna paralel kalmasını sağlayın (Şekil 1J ve Video 3).
   NOT: Kan damarını delmekten veya bitişik damarlarda yanlışlıkla hasara neden olmaktan kaçınmak için iğne batırma açısına ve derinliğine özellikle dikkat edilmelidir.
10. Negatif bir basınç oluşturmak için şırıngayı hafifçe geri çekin, genellikle kan damarına girdikten sonra elle tutulur bir atılım hissi eşlik eder (özellikle ilk kan toplama sırasında belirgindir). Bu pozisyonu koruyun ve gerektiğinde sabit bir hızda 0.1-1.0 mL kan toplayın (haftada yaklaşık 4-5.3 mL/kg kan^IACUC yönergelerini izleyerek 1) (Şekil 1K ve Video 3).
11. Delindikten sonra kan yoksa, iğnenin açısını ve derinliğini nazikçe ayarlamayı deneyin veya şırıngayı hafifçe döndürün (Video 3). Aynı tarafta art arda üç deneme başarısız olursa, tüm kanamayı durdurun ve ardından delinme için karşı tarafa geçin.
    NOT: Sıçanın rahatsızlıktan dolayı mücadele etmesini önlemek için deriden hızlı bir şekilde delinmesi tavsiye edilir.
12. Hemostaz için pamuklu çubuk uygulayın ve fareyi kafesine geri koyun (Video 4).
13. Kan örneklerini deneysel gereksinimlere göre işleyin.

3. Kan örneği işleme

1. Şırınga iğnesini keskin bir kaba atın. Toplanan kanı daha önce heparin ile durulanmış 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 4 °C ve 1.200 x g'ye ayarlayarak bir santrifüje yerleştirin ve plazmayı ayırmak için 10 dakika santrifüjleyin. Serumu 1.0 mL'lik bir Pasteur pipeti kullanarak temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve -80 °C'de saklayın.
   NOT: Basınca bağlı hemolizi önlemek için gerektiğinde iğne ucunu çıkarın. Plazma aspirasyonu sırasında, tüpün dibinden kan hücreleri çekmekten kaçının. Bazen, şırınganın yüzeyi sıçan kürkü toplayabilir; Pıhtılaşmaya neden olabileceğinden tüpe herhangi bir kürk girmemesine dikkat edin.

4. İstatistiksel analiz

1. Tüm verileri ortalama ± standart sapma olarak sunun ve varyansın homojenliği için test edin.
2. Gruplar arasındaki başarı oranlarını karşılaştırmak için Fisher'ın kesin testini kullanın.
3. İki grup arasındaki genel ortalamaları karşılaştırmak için iki örneklemden bağımsız bir t-testi kullanın.
4. Kan örnekleme süresi, vücut ağırlığı, gıda alımı ve su tüketimi gibi sürekli ölçümler için varyans analizini (ANOVA) kullanın. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı kabul edin.

Sonuçlar

Yüksek kaliteli plazma örnekleri, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, herhangi bir kırmızı renk tonu veya pıhtılaşma olmadan soluk sarı bir renk tonu, berraklık ve şeffaflık sergiler. Şekil 2B'de sırasıyla yanlış işlemler sonucu hemoliz (sol taraf) veya pıhtılaşma (sağ taraf) görülmektedir. 4 gün içinde 96 kan alma seansı boyunca, A ve B grupları için ortalama tek kan alma süreleri sırasıyla 119.87 ...

Tartışmalar

Kuyruk damarı kan alımı, sıçanlarda tekrarlanan kan örneklemesi için en yaygın yöntem olmasına rağmen, anestezi ilaçlarından etkilenebilir ve kuyruk damarının küçük boyutu nedeniyle, tek bir örnekte toplanabilecek kan miktarı sınırlıdır ve bu da daha uzun bir kan alma süresine yol açar ^4,5. Sıçan kuyruğu damarlarının kılcal mikrosampasyonu (CMS) ile birleştirilmiş yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) -tandem kütle ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% normal saline	Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	——	Prepared heparin sodium solution
1 mL Pasteur pipette	Biosharp	BS-XG-01-NS	Blood collection
1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm)	Shinva Medical Instrument Co.,Ltd.	0.45*12RWLB	Blood collection
1.5 mL Eppendorf tube	Biosharp	BS-15-M	Blood storage and collection
75% medical alcohol	Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.	——	Disinfection of rat blood collection site
Centrifuge tube holder	Biosharp	BS-05/15-SM60	——
Electronic scale	Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd.	JE1002	Weigh
Heparin sodium injection	Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd.	——	Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL
Low temperature centrifuge	HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument  Co., Ltd.	H1750R	Separation of serum