تصور البروتينات منخفضة الوفرة والتعديلات اللاحقة للترجمة في أجنة ذبابة الفاكهة الحية عن طريق حقن الأجسام المضادة الفلورية

Summary

يصف هذا البروتوكول وضع العلامات الفلورية المخصصة القائمة على الأجسام المضادة وحقنها في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة لتمكين التصوير المباشر للبروتينات منخفضة الوفرة أو التعديلات اللاحقة للترجمة التي يصعب اكتشافها باستخدام أساليب GFP / mCherry-tag التقليدية.

Abstract

أدى تصور البروتينات في الخلايا الحية باستخدام GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) وعلامات الفلورسنت الأخرى إلى تحسين فهم توطين البروتين وديناميكياته ووظيفته بشكل كبير. بالمقارنة مع التألق المناعي ، يعكس التصوير الحي بشكل أكثر دقة توطين البروتين دون حدوث قطع أثرية محتملة ناتجة عن تثبيت الأنسجة. الأهم من ذلك ، يتيح التصوير الحي التوصيف الكمي والزمني لمستويات البروتين والتوطين ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات البيولوجية الديناميكية مثل حركة الخلية أو انقسامها. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية لنهج وضع العلامات الفلورية هو الحاجة إلى مستويات تعبير عالية بما فيه الكفاية من البروتين لتحقيق تصور ناجح. وبالتالي ، لا يمكن اكتشاف العديد من البروتينات الفلورية الموسومة داخليا بمستويات تعبير منخفضة نسبيا. من ناحية أخرى ، يمكن أن يؤدي التعبير خارج الرحم باستخدام المروجين الفيروسيين في بعض الأحيان إلى سوء توطين البروتين أو تغيرات وظيفية في السياقات الفسيولوجية. لمعالجة هذه القيود ، يتم تقديم نهج يستخدم الكشف عن البروتين بوساطة الأجسام المضادة الحساسة للغاية في الأجنة الحية ، مما يؤدي بشكل أساسي إلى التألق المناعي دون الحاجة إلى تثبيت الأنسجة. كدليل على المبدأ ، يمكن تصور مستقبلات Notch الموسومة داخليا والتي بالكاد يمكن اكتشافها في الأجنة الحية بنجاح بعد حقن الأجسام المضادة. علاوة على ذلك ، تم تكييف هذا النهج لتصور تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) في الأجنة الحية ، مما يسمح بالكشف عن التغيرات الزمنية في أنماط فسفرة التيروزين أثناء التطور الجنيني المبكر والكشف عن مجموعة فرعية جديدة من الفوسفوتيروزين (p-Tyr) تحت الأغشية القمية. يمكن تعديل هذا النهج لاستيعاب الأجسام المضادة الأخرى الخاصة بالبروتين أو العلامات أو PTM ويجب أن يكون متوافقا مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى القابلة للحقن أو خطوط الخلايا. يفتح هذا البروتوكول إمكانيات جديدة للتصوير الحي للبروتينات منخفضة الوفرة أو PTMs التي كان من الصعب اكتشافها في السابق باستخدام طرق وضع العلامات الفلورية التقليدية.

Introduction

التألق المناعي هو تقنية أساسية لبيولوجيا الخلية الحديثة التي طورها في الأصل ألبرت كونز ، والتي تمكن من اكتشاف الجزيئات في مقصوراتها الخلوية الأصلية وتوصيف التركيبات الجزيئية للعضيات أو الآلات تحت الخلوية¹. إلى جانب التلاعب الجيني ، يساعد التألق المناعي في تأسيس المفهوم المقبول الآن بأن توطين البروتين ضروري لوظيفته². بصرف النظر عن الأجسام المضادة الأولية المحددة والأصباغ الفلورية الساطعة ، يعتمد نجاح هذه التقنية على عملية أولية تسمى التثبيت والنفاذية ، والتي تحافظ على التشكل الخلوي ، وتشل المستضدات ، وتزيد من إمكانية الوصول إلى الأجسام المضادة في المقصورات داخل الخلايا. حتما ، فإن عملية التثبيت والنفاذية ستقتل الخلايا وتن....

Protocol

أجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية وموافقة كلية علوم الحياة ، جامعة SUSTech. الكائن الحي المستخدم هو ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، والأنماط الجينية هي Notch-Knockin-GFP (الكروموسوم X) و Sqh-sqh-GFP (الكروموسوم الثاني) ، التي توفرها بسخاء مختبرات الدكتور فرانسوا شويسغوث (معهد باستور) والدكتورة جنيفر زالين (معهد سلون كيترينج) ، على التوالي. بينما يركز هذا البروتوكول بشكل أساسي على جوانب وضع العلامات على الأجسام المضادة والتصوير الحي ، يرجى الرجوع إلى التقارير المنشورة للحصول على أوصاف أكثر تفصيلا لجمع أجنة ذبابة الفاكهة وحقنها^15،16.

1. وضع العلامات الفلورية ل....

النتائج

لإثبات مزايا طريقة حقن الأجسام المضادة على التصوير الحي القائم على علامة الفلورسنت أو التألق المناعي ، تم توفير دراستي حالة تميزان التوطين الديناميكي لمستقبل الغشاء منخفض الوفرة ، Notch ، ونوع من التعديل بعد الترجمة يسمى فسفرة التيروزين في الأجنة الحية.

يلعب نشاط إشارات الش?.......

Discussion

يحدد هذا الإجراء المقدم الطريقة المتخصصة لوضع العلامات الفلورية بالأجسام المضادة المخصصة والحقن اللاحق في أجنة ذبابة الفاكهة في المراحل المبكرة. تسهل هذه التقنية التصور في الوقت الفعلي للبروتينات أو التعديلات اللاحقة للترجمة الموجودة بكميات منخفضة والتي يصعب ملاحظتها عادة من خلا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt