Визуализация белков с низкой распространенностью и посттрансляционных модификаций в живых эмбрионах дрозофилы с помощью инъекции флуоресцентных антител

Резюме

Этот протокол описывает индивидуальную флуоресцентную мечение на основе антител и инъекцию в ранние эмбрионы дрозофилы , чтобы обеспечить живую визуализацию белков с низкой распространенностью или посттрансляционных модификаций, которые трудно обнаружить с помощью традиционных подходов GFP/mCherry-tag.

Аннотация

Визуализация белков в живых клетках с помощью GFP (Green Fluorescent Protein) и других флуоресцентных меток значительно улучшила понимание локализации, динамики и функции белков. По сравнению с иммунофлуоресценцией, визуализация в реальном времени более точно отражает локализацию белка без потенциальных артефактов, возникающих в результате фиксации тканей. Важно отметить, что визуализация в реальном времени позволяет количественно и во времени охарактеризовать уровни и локализацию белков, что имеет решающее значение для понимания динамических биологических процессов, таких как движение или деление клеток. Тем не менее, основным ограничением флуоресцентных подходов к мечению является необходимость достаточно высоких уровней экспрессии белка для достижения успешной визуализации. Следовательно, многие эндогенно меченные флуоресцентные белки с относительно низким уровнем экспрессии не могут быть обнаружены. С другой стороны, эктопическая экспрессия с использованием вирусных промоторов иногда может привести к неправильной локализации белка или функциональным изменениям в физиологическом контексте. Для устранения этих ограничений представлен подход, который использует высокочувствительное антитело-опосредованное обнаружение белка у живых эмбрионов, по сути, выполняя иммунофлуоресценцию без необходимости фиксации тканей. В качестве доказательства принципа, эндогенный рецептор Notch, помеченный GFP, который едва обнаруживается в живых эмбрионах, может быть успешно визуализирован после инъекции антител. Кроме того, этот подход был адаптирован для визуализации посттрансляционных модификаций (ПТМ) у живых эмбрионов, что позволило обнаружить временные изменения в паттернах фосфорилирования тирозина во время раннего эмбриогенеза и выявить новую субпопуляцию фосфотирозина (p-Tyr) под апикальными мембранами. Этот подход может быть модифицирован для размещения других белково-специфических, меткоспецифических или PTM-специфических антител и должен быть совместим с другими поддающимися инъекциям модельными организмами или клеточными линиями. Этот протокол открывает новые возможности для визуализации в реальном времени белков с низкой распространенностью или PTM, которые ранее было сложно обнаружить с помощью традиционных методов флуоресцентного мечения.

Введение

Иммунофлуоресценция является краеугольным камнем современной клеточной биологии, первоначально разработанным Альбертом Кунсом, который позволяет обнаруживать молекулы в их собственных клеточных компартментах и характеризовать молекулярный состав субклеточных органелл или^{механизмов.} В сочетании с генетическими манипуляциями иммунофлуоресценция помогает установить общепринятую концепцию о том, что локализация белка имеет важное значение для^{его функционирования.} Помимо специфических первичных антител и ярких флуоресцентных красителей, успех этого метода основан на предварительном процессе, называемом фиксацией и пермеабилизацией, который сохраняет клеточную морфологию, иммобилизует антигены и увеличивает доступ антител во внутриклеточные компартменты. Процесс фиксации и пермеабилизации неизбежно убьет клетки и завершит все биологические^{процессы.} Таким образом, иммунофлуоресценция дает только моментальные снимки жизненного пути белков. Однако многие биологические процессы, такие как миграция и деление клеток, являются динамическими по своей природе, что требует исследования поведения белков в пространственно-временном ^{разрешении.}

Для изучения динамики белков в живых организмах были разработаны методы визуализации в реальном времени, основанные на генетически кодируемых флуоресцентных белках, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP)⁶ и высокоскоростные конфокальные микроскопы. Вкратце, интересующий нас белок может быть генетически модифицирован для слияния с GFP⁷, а затем эктопически экспрессирован из вирусных или дрожжевых промоторов, таких как цитомегаловирус (ЦМВ)⁸ или восходящая последовательность активации (UAS)⁹. Поскольку GFP является автофлуоресцентным по своей природе, для выявления локализации белков-мишеней не требуется никаких флуорофорных антител, что позволяет избежать необходимости предварительных процессов фиксации или пермеабилизации. За последние два десятилетия были разработаны флуоресцентные метки, охватывающие весь спектр длин^волн10, что позволяет получать многоцветную живую визуализацию нескольких белков-мишеней одновременно. Однако, по сравнению с химически модифицированными флуоресцентными красителями, такими как AlexaFluor или ATTO, автофлуоресценция этих генетически кодируемых флуоресцентных белков относительно слаба и нестабильна при экспрессии от эндогенных промоторов, особенно во время визуализации в реальном времени в более длительных^{временных} масштабах. Хотя этот недостаток может быть смягчен чрезмерной экспрессией флуоресцентно меченных белков-мишеней, многие из них с ферментативной активностью, такой как киназы и фосфатазы, серьезно нарушают нормальные биологические процессы, если не экспрессируются на физиологическом уровне.

Этот протокол представляет собой метод, который позволяет подсвечивать мишень на основе фотостабильных антител в режиме реального времени, по сути, обеспечивая иммунофлуоресценцию без процесса фиксации или пермеабилизации (рис. 1). С помощью простой первичной аминовой реакции¹¹ на основе NHS можно конъюгировать флуоресцентные красители, такие как AlexaFluor 488 или 594, практически с любым первичным антителом или GFP/HA/Myc nanobody¹². Используя особенность развития, заключающуюся в том, что все эмбриональные клетки дрозофилы имеют общую цитоплазму во время^13-й стадии синцития, можно добиться связывания антигена и освещения целых эмбрионов после инъекции антител, конъюгированных с красителем. С расширением библиотек эндогенно меченых белков, доступных в дрозофиле и других модельных системах¹⁴, этот метод потенциально может расширить применение этих библиотек, выявляя динамику флуоресцентно меченных белков с низким содержанием и других нефлуоресцентно меченных белков (HA/Myc-меченых) в живых тканях.

протокол

Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями и одобрением Школы наук о жизни Университета SUSTech. Используемый микроорганизм - Drosophila melanogaster, а генотипы - Notch-Knockin-GFP (хромосома X) и Sqh-sqh-GFP (хромосома II), любезно предоставленные лабораториями доктора Франсуа Швайсгута (Институт Пастера) и доктора Дженнифер Заллен (Институт Слоуна-Кеттеринга) соответственно. Несмотря на то, что этот протокол в основном сосредоточен на аспектах мечения антител и визуализации в реальном времени, более подробное описание сбора и инъекции эмбрионов дрозофилы см. в опубликованных отчетах ^15,16.

1. Флуоресцентное мечение антител

1. Предпочтительно использовать моноклональные антитела или нанотела для интересующего белка. Приготовьте исходную концентрацию антител на уровне 1 мг/мл или выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании в качестве примера используется GFP nanobody (см. Таблицу материалов). Коммерчески доступный GFP nanobody упакован в концентрацию 1,0 мг/мл и объем 250 мкл. Кроме того, используется коммерчески доступный набор для маркировки антител (см. Таблицу материалов), который конъюгирует Alexa Fluor 594 с первичными аминами белков посредством реакции¹¹ сукцинимидилового эфира. Важно отметить, что этот процесс мечения существенно не влияет на концентрацию антител.
2. Приготовьте 1 М раствор бикарбоната натрия, повторно суспендировав компонент B (входит в комплект для маркировки антител) в 1 мл деионизированной воды.
3. Отрегулируйте концентрацию антител до 1,0 мг/мл, затем добавьте 1/10^{объема (} 10 мкл для 100 мкл нанотела GFP) 1 М раствора бикарбоната натрия.
4. Добавьте 110 мкл смеси антител (с шага 1.3) непосредственно в пробирку, содержащую краситель Alexa Fluor 594. Перемешать (не перемешивать) и выдержать на ротаторе в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Соберите очистительную колонку из комплекта сопряжения (см. Таблицу материалов). Приготовьте слой смолы объемом 1,5 мл (входит в комплект для маркировки антител) и центрифугируйте колонку при 1100 x g в течение 3 минут при комнатной температуре (RT), чтобы удалить лишнюю жидкость из смолы.
6. Добавьте реакционную смесь (из шага 1.4) по каплям в верхнюю часть столбика смолы и центрифугируйте при 1100 x g в течение 5 минут при 4 °C, чтобы собрать меченое антитело. Собранное антитело должно иметь розовый цвет, а объем должен быть чуть меньше 100 мкл. Хранить в тюбиках, завернутых в фольгу или темного цвета, при температуре 4 °C.

2. Подготовка эмбрионов дрозофилы

1. Поместите 200 только что вылупившихся взрослых дрозофил в пластиковую клетку цилиндрической формы (диаметр = 5 см, высота = 8 см) с соотношением самцов и самок 1:10. Загерметизируйте одну сторону пористой металлической сеткой для вентиляции, а другую — тарелкой из фруктового сока/дрожжевой пасты.
2. Меняйте пластинку каждые 12 ч в течение трех дней до забора эмбрионов. Это позволяет синхронизировать яйцекладку дрозофилы и повышает эффективность сбора.
3. В день инъекции смените клетку на тарелку с фруктовым соком с минимальным количеством дрожжевой пасты и собирайте эмбрионы при 25 °C в течение 1 ч. Если первый этап сбора не дает достаточного количества эмбрионов (<50 эмбрионов), выбросьте первую пластину и повторяйте этот шаг для второго раунда сбора до тех пор, пока в течение 1 часа не будет отложено более 100 эмбрионов.
4. Выньте пластину из клетки, чтобы остановить яйцекладку, и инкубируйте при 25 °C еще 2 ч для получения эмбрионов возрастом 2-3 ч. Правильная стадия эмбрионов имеет решающее значение для успеха инъекции антител.
5. Чтобы удалить яичную скорлупу эмбрионов, добавьте 2 мл 50% отбеливателя в пластину с фруктовым соком и осторожно вытесните эмбрионы из чашки с помощью кисти (Рисунок 2A-4). Часто эмбрионы будут откладываться прямо поверх дрожжевой пасты. В этом случае допустимо смазать дрожжевую пасту в раствор хлорной извести, чтобы собрать все эмбрионы.
6. Инкубируйте плавающие эмбрионы в 50% отбеливателе в течение 2 минут и перемешивайте тарелку с фруктовым соком каждые 30 с, чтобы повысить эффективность удаления яичной скорлупы.
7. Перенесите смесь эмбрионов и отбеливателя, вылив ее в ситечко из нейлоновых ячеек размером 70 мкм (Рисунок 2A-7). Тщательно промойте эмбрионы с помощью бутылки с водой, чтобы удалить остатки отбеливателя и дрожжевой пасты. Полностью высушите ситечко бумажными полотенцами, убедившись, что лишняя вода вокруг эмбрионов удалена.

3. Выравнивание и высыхание эмбрионов

1. Приготовьте 4% агарозный гель размером 5 см х 5 см х 0,5 см (ширина, длина, высота) (рис. 2А-9) и дайте гелю остыть до комнатной температуры. Отрежьте агарозный блок размером 1 см x 3 см x 0,5 см (ширина, длина, высота) чистым лезвием бритвы и поместите блок на предметное стекло (рис. 2A-2). Осмотрите гелевый блок под эндоскопом, чтобы убедиться, что края срезаны прямо, а поверхность ровная и сухая.
2. Перенесите эмбрионы из ситечка на гелевый блок с помощью кисти. Равномерно распределите эмбрионы по средней линии блока, аккуратно расчесывая их. В идеале кластеры эмбрионов разделяют на одиночные или дублеты, не соприкасаясь друг с другом.
3. Подготовьте пинцет с двумя ножками, плотно приклеенными друг к другу, чтобы получился один тонкий кончик (Рисунок 2A-5). Под препарирующим эндоскопом возьмите пинцетом отдельные эмбрионы и поместите их вдоль длинного края гелевого блока. Выровняйте 20-30 эмбрионов, убедившись, что их передняя задняя ось параллельна краю (рис. 2C).
4. Нанесите на пипетку 10 мкл гептанового клея (см. таблицу материалов) в центр покровного стекла размером 24 мм x 50 мм (Рисунок 2A-1) и распределите клей по прямоугольному участку размером 0,5 см x 3 см с помощью наконечника пипетки. Перед использованием дождитесь полного высыхания клея.
5. Поместите предметное стекло с гелевым блоком на край стола эмбрионами наружу. Приподнимите покровное стекло с клеем с помощью пинцета с плоским кончиком (Рисунок 2A-6) и держите его неподвижно поверх эмбрионов так, чтобы клеевая сторона была обращена к эмбрионам под углом около 45 градусов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно прижмите покровное стекло к гелевому блоку, чтобы эмбрионы соприкасались с клеем, а затем быстро ослабьте давление и поднимите покровное стекло. Величина приложенного натяжения имеет решающее значение для того, чтобы эмбрионы могли быть стабильно прикреплены к клею, не прижимаясь слишком сильно и не разрываясь.
6. Налейте пипетку 10 мкл воды в центр нового предметного стекла и поместите покровное стекло с эмбрионами поверх него стороной эмбриона вверх (Рисунок 2B). Убедитесь, что вы используете воду вместо лака для ногтей или другого клея для крепления покровного стекла к предметному стеклу, так как эта сторона покровного стекла будет размещена непосредственно поверх конфокальной линзы для получения изображения в реальном времени.
7. Высушите эмбрионы в сушильной камере (Рисунок 2А-3) (см. Таблицу материалов) в течение 10-15 мин до тех пор, пока вителлиновая мембрана не сморщится (Рисунок 2Е). Требуемое время может варьироваться в зависимости от влажности помещения и должно быть экспериментально проверено для каждого лабораторного условия.
8. Пипетка 40 мкл галогеноуглеродного масла (смесь типа 27 и типа 700 в соотношении 1:1 по объему, см. таблицу материалов) на один конец полоски эмбриона. Наклоняйте предметное стекло до тех пор, пока галогеноуглеродное масло не покроет всю поверхность эмбрионов.

4. Инъекция антител и визуализация

1. Подготовьте несколько стеклянных игл для инъекций с помощью съемника микропипетки (настройки параметров см. в таблице материалов ) и загрузите в каждую иглу 5 мкл раствора антител, меченного AlexaFluor (начиная с шага 1.6).
2. Поместите защитное стекло размером 25 мм x 25 мм на предметное стекло. Наберите пипетку 40 мкл галогеноуглеродного масла и распределите ее по краю покровного стекла.
3. Под эндоскопом для инъекций совместите кончик иглы с краем покровного стекла под маслом. Отрегулируйте давление воздуха для впрыска пиконасоса (см. Таблицу материалов) таким образом, чтобы один насос генерировал один пузырь, наполненный антителами. Диаметр пузырька должен быть ограничен 20-50 мкм (рис. 2F).
4. Замените пустое предметное стекло на предметное скоб, содержащее эмбрионы под маслом. Выровняйте кончик инъекционной иглы перпендикулярно передне-задней оси эмбрионов (рис. 2D, G).
5. Проверьте стадию эмбрионов, чтобы убедиться, что большинство из них инициировали целлюляризацию, но еще не начали гаструляцию (стадии 4 и 5), оставаясь в виде синцития (рис. 2F, G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отличительной чертой этой стадии является отсутствие каких-либо бороздок или складок и наличие желточного мешка овальной формы темного цвета, видимого в центре эмбриона. Морфологическая характеристика стадии эмбриона под действием масла основана на главе книги Фолькера Хартенштейна «Стадии эмбриогенеза дрозофилы»¹⁷.
6. Используйте манипулятор стадии X-Y, чтобы перемещать эмбрионы к игле до тех пор, пока кончик не достигнет центра желтка. Накачайте два-три раза, чтобы ввести антитела в желток. Об успешном впрыске свидетельствует быстрое исчезновение складки вителлиновой мембраны по мере того, как эмбрионы набирают объем из раствора антител (рис. 2G).
7. Используйте манипулятор стадии X-Y, чтобы отодвинуть эмбрионы от иглы после инъекции и переместить их вниз к следующему эмбриону. Повторяйте шаг 6 до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы на предметном стекле.
8. Перенесите предметное стекло с введенными эмбрионами во влажную камеру (рис. 2A-8). Инкубируйте при температуре 25 °C до тех пор, пока не будет достигнута желаемая стадия развития эмбриона.
9. Снимите покровное стекло размером 24 мм x 50 мм со предметного стекла и поместите его непосредственно в держатель предметного стекла микроскопа. Перед задачами будет стоять сторона, у которой нет эмбрионов. Определите местонахождение эмбрионов с помощью линзы с малым увеличением при ярком освещении и переключитесь на линзу с 40-кратным или 63-кратным увеличением для получения флуоресцентной визуализации в реальном времени с высоким разрешением.

Результаты

Чтобы продемонстрировать преимущества метода введения антител по сравнению с флуоресцентной визуализацией или иммунофлуоресценцией на основе флуоресцентных меток, представлены два тематических исследования, характеризующих динамическую локализацию трансмембранного рецептора с ?...

Обсуждение

Данная методика представляет собой специализированный метод флуоресцентного мечения с помощью специальных антител и последующей инъекции эмбрионам дрозофилы на ранних стадиях. Этот метод облегчает визуализацию в режиме реального времени белков или посттрансляционных модифик?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt