蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

要約

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ の初期胚への注入について説明します。

要約

GFP(Green Fluorescent Protein)やその他の蛍光タグを用いて生細胞内のタンパク質を可視化することで、タンパク質の局在、動態、機能の理解が大幅に向上しました。免疫蛍光法と比較して、ライブイメージングは、組織固定から生じる潜在的なアーチファクトなしに、タンパク質の局在をより正確に反映します。重要なことは、ライブイメージングにより、細胞の動きや分裂などの動的な生物学的プロセスを理解するために重要な、タンパク質レベルと局在の定量的および時間的特性評価が可能になることです。しかし、蛍光標識法の主な制限は、可視化を成功させるために十分に高いタンパク質発現レベルが必要であることです。その結果、発現レベルが比較的低い内因性タグ付き蛍光タンパク質の多くは検出できません。一方、ウイルスプロモーターを用いた異所性発現は、生理学的状況におけるタンパク質の誤局在や機能的変化につながることがあります。これらの制限に対処するために、生体胚における高感度の抗体媒介タンパク質検出を利用し、本質的に組織固定を必要とせずに免疫蛍光を実行するアプローチが提示されます。原理の証明として、生体胚ではほとんど検出できない内因性GFPタグ付きノッチ受容体を、抗体注入後にうまく可視化することができます。さらに、このアプローチは、生きた胚の翻訳後修飾(PTM)を可視化するために適用され、初期胚発生中のチロシンリン酸化パターンの経時的変化の検出を可能にし、頂端膜下のホスホチロシン(p-Tyr)の新しい亜集団を明らかにしました。このアプローチは、他のタンパク質特異的抗体、タグ特異的抗体、またはPTM特異的抗体に対応するように変更することができ、他の注入に適したモデル生物または細胞株と適合性があるはずです。このプロトコルは、従来の蛍光タグ法では検出が困難であった低存在量タンパク質またはPTMのライブイメージングに新たな可能性を開きます。

概要

免疫蛍光法は、アルバート・クーンズによって最初に開発された現代細胞生物学の基礎技術であり、天然の細胞区画で分子を検出し、細胞内オルガネラまたは^{機械の分子}組成の特性評価を可能にします1。遺伝子操作と相まって、免疫蛍光法は、タンパク質の局在化が^{その機能に}不可欠であるという、現在広く受け入れられている概念の確立に役立ちます2。この技術の成功は、特異的な一次抗体と明るい蛍光色素の他に、細胞形態を維持し、抗原を固定化し、細胞内コンパートメントへの抗体のアクセス性を高める固定および透過化という予備プロセスに依存しています。必然的に、固定と透過のプロセスは細胞を殺し、すべての^{生物学的プロセスを終了}させます3。したがって、免疫蛍光法は、タンパク質のライフジャーニーのスナップショットを提供するだけです。しかし、細胞の遊走や分裂などの多くの生物学的プロセスは本質的に動的であり、時空間的に分解された方法でタンパク質の挙動を調べる必要があります^4,5。

生体内の蛋白質動態を調べるために、緑色蛍光蛋白質(GFP)⁶ などの遺伝子にコードされた蛍光蛋白質を用いたライブイメージング法や高速共焦点顕微鏡....

プロトコル

実験は、SUSTech University生命科学部のガイドラインと承認に従って行われました。使用される生物はショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)で、遺伝子型はNotch-Knockin-GFP(染色体X)とSqh-sqh-GFP(染色体II)で、それぞれフランソワ・シュヴァイスグース博士(パスツール研究所)とジェニファー・ザレン博士(スローン・ケタリング研究所)の研究室から寛大に提供されました。このプロトコルが抗体の分類および生きているイメージ投射の面に主に焦点を合わせている間、ショウジョウバエの胚のコレクションおよび注入^15,16のより詳しい記述のための出版されたレポートを参照して下さい。

1. 抗体の蛍光標識

1. 好ましくは、目的のタンパク質にはモノクローナル抗体またはナノボディを使用します。抗体のストック濃度は1 mg/mL以上で調製してください。
   注:この研究では、GFPナノボディ( 材料表を参照)を例として使用しています。市販のGFPナノボディは、濃度1.0 mg/mL、容量250 μLで包装されています。 さらに、市販の抗体標識キット( 材料表を参照)が利用....

ディスカッション

この手順では、カスタム抗体による蛍光標識と、その後の初期段階の ショウジョウバエ 胚への注入の特殊な方法の概要を説明します。この手法により、従来のGFP/mCherryタグ法では観察が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾をリアルタイムで可視化することができます。

この方法を拡張して野生型胚と変異胚の定量的比較を行う場合は注意が必要です。一次抗体?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt