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要約

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ の初期胚への注入について説明します。

要約

GFP(Green Fluorescent Protein)やその他の蛍光タグを用いて生細胞内のタンパク質を可視化することで、タンパク質の局在、動態、機能の理解が大幅に向上しました。免疫蛍光法と比較して、ライブイメージングは、組織固定から生じる潜在的なアーチファクトなしに、タンパク質の局在をより正確に反映します。重要なことは、ライブイメージングにより、細胞の動きや分裂などの動的な生物学的プロセスを理解するために重要な、タンパク質レベルと局在の定量的および時間的特性評価が可能になることです。しかし、蛍光標識法の主な制限は、可視化を成功させるために十分に高いタンパク質発現レベルが必要であることです。その結果、発現レベルが比較的低い内因性タグ付き蛍光タンパク質の多くは検出できません。一方、ウイルスプロモーターを用いた異所性発現は、生理学的状況におけるタンパク質の誤局在や機能的変化につながることがあります。これらの制限に対処するために、生体胚における高感度の抗体媒介タンパク質検出を利用し、本質的に組織固定を必要とせずに免疫蛍光を実行するアプローチが提示されます。原理の証明として、生体胚ではほとんど検出できない内因性GFPタグ付きノッチ受容体を、抗体注入後にうまく可視化することができます。さらに、このアプローチは、生きた胚の翻訳後修飾(PTM)を可視化するために適用され、初期胚発生中のチロシンリン酸化パターンの経時的変化の検出を可能にし、頂端膜下のホスホチロシン(p-Tyr)の新しい亜集団を明らかにしました。このアプローチは、他のタンパク質特異的抗体、タグ特異的抗体、またはPTM特異的抗体に対応するように変更することができ、他の注入に適したモデル生物または細胞株と適合性があるはずです。このプロトコルは、従来の蛍光タグ法では検出が困難であった低存在量タンパク質またはPTMのライブイメージングに新たな可能性を開きます。

概要

免疫蛍光法は、アルバート・クーンズによって最初に開発された現代細胞生物学の基礎技術であり、天然の細胞区画で分子を検出し、細胞内オルガネラまたは機械の分子組成の特性評価を可能にします1。遺伝子操作と相まって、免疫蛍光法は、タンパク質の局在化がその機能に不可欠であるという、現在広く受け入れられている概念の確立に役立ちます2。この技術の成功は、特異的な一次抗体と明るい蛍光色素の他に、細胞形態を維持し、抗原を固定化し、細胞内コンパートメントへの抗体のアクセス性を高める固定および透過化という予備プロセスに依存しています。必然的に、固定と透過のプロセスは細胞を殺し、すべての生物学的プロセスを終了させます3。したがって、免疫蛍光法は、タンパク質のライフジャーニーのスナップショットを提供するだけです。しかし、細胞の遊走や分裂などの多くの生物学的プロセスは本質的に動的であり、時空間的に分解された方法でタンパク質の挙動を調べる必要があります4,5。

生体内の蛋白質動態を調べるために、緑色蛍光蛋白質(GFP)6 などの遺伝子にコードされた蛍光蛋白質を用いたライブイメージング法や高速共焦点顕微鏡が開発されています。簡単に説明すると、目的のタンパク質を遺伝子操作してGFP7と融合させ、サイトメガロウイルス(CMV)8 や上流活性化配列(UAS)9などのウイルスまたは酵母のプロモーターから異所的に発現させることができます。GFPは本質的に自家蛍光であるため、標的タンパク質の局在を明らかにするために蛍光色素結合抗体は必要なく、固定または透過処理の予備プロセスの必要性を回避します。過去20年間で、波長の全スペクトルにわたる蛍光タグが開発され10、複数の標的タンパク質のマルチカラーライブイメージングを同時に可能にしました。しかし、AlexaFluorやATTOなどの化学的に操作された蛍光色素と比較して、これらの遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の自家蛍光は、内因性プロモーターから発現する場合、特により長い時間スケールにわたるライブイメージング中に、比較的弱く不安定である10。この不足は、蛍光タグ付き標的タンパク質を過剰発現させることで軽減できますが、キナーゼやホスファターゼなどの酵素活性を持つ多くは、生理学的レベルで発現しない場合、正常な生物学的プロセスを著しく破壊します。

このプロトコルは、ライブ画像セットアップで光安定性抗体ベースのターゲット照明を可能にする方法を示しており、固定または透過処理のプロセスなしで本質的に免疫蛍光を可能にします(図1)。単純なNHSベースの第一級アミン反応11により、AlexaFluor 488や594などの蛍光色素を、基本的に任意の一次抗体またはGFP/HA/Mycナノボディ12と結合させることができます。ショウ ジョウバエ の胚細胞は合胞体期13で共通の細胞質を共有するという発生上の特徴を利用して、色素標識抗体の注入後、胚全体にわたる抗原結合と照明を達成することができます。ショウ ジョウバエ やその他のモデル系で利用可能な内因性タグ付きタンパク質のライブラリが拡大しているため14、この方法は、生体組織における少量の蛍光タグ付きタンパク質およびその他の非蛍光タグ付き(HA / Mycタグ付き)タンパク質のダイナミクスを明らかにすることにより、これらのライブラリのアプリケーションを潜在的に広げることができます。

プロトコル

実験は、SUSTech University生命科学部のガイドラインと承認に従って行われました。使用される生物はショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)で、遺伝子型はNotch-Knockin-GFP(染色体X)とSqh-sqh-GFP(染色体II)で、それぞれフランソワ・シュヴァイスグース博士(パスツール研究所)とジェニファー・ザレン博士(スローン・ケタリング研究所)の研究室から寛大に提供されました。このプロトコルが抗体の分類および生きているイメージ投射の面に主に焦点を合わせている間、ショウジョウバエの胚のコレクションおよび注入15,16のより詳しい記述のための出版されたレポートを参照して下さい。

1. 抗体の蛍光標識

  1. 好ましくは、目的のタンパク質にはモノクローナル抗体またはナノボディを使用します。抗体のストック濃度は1 mg/mL以上で調製してください。
    注:この研究では、GFPナノボディ( 材料表を参照)を例として使用しています。市販のGFPナノボディは、濃度1.0 mg/mL、容量250 μLで包装されています。 さらに、市販の抗体標識キット( 材料表を参照)が利用され、スクシンイミジルエステル反応によってAlexa Fluor 594をタンパク質の第一級アミンに結合させます11。重要なことは、この標識プロセスによって抗体濃度が有意に変化しないことです。
  2. 成分B(抗体標識キットに付属)を1 mLの脱イオン水に再懸濁して、1 Mの重炭酸ナトリウム溶液を調製します。
  3. 抗体濃度を1.0 mg/mLに調整し、1 M重炭酸ナトリウム溶液の1/10容量(GFPナノボディ100 μLの場合は10 μL)を加えます。
  4. 110 μLの抗体ミックス(ステップ1.3)をAlexa Fluor 594色素の入ったチューブに直接添加します。反転させて混合し(ボルテックス不可)、ローテーター上で室温で1時間インキュベートします。
  5. コンジュゲーションキットから精製カラムを組み立てます( 材料表を参照)。1.5 mLのレジンベッド(抗体標識キットに付属)を調製し、カラムを1100 x g で室温(RT)で3分間遠心分離し、レジンから余分な液体を取り除きます。
  6. 反応混合物(ステップ1.4)をレジンカラムの上部に滴下し、1100 x g 、4°Cで5分間遠心分離して標識抗体を回収します。採取した抗体はピンク色に見え、容量は100μLをわずかに下回るはずです。 ホイルで包まれたチューブまたは濃い色のチューブに入れて4°Cで保管してください。

2. ショウジョウバエ 胚の作製

  1. 孵化したばかりのショウ ジョウバエ の成虫200匹を、雄対雌の比率が1:10のプラスチック製の円筒形のケージ(直径= 5 cm、高さ= 8 cm)に入れます。片側を通気のために多孔質の金属メッシュで密封し、もう片側をフルーツジュース/酵母ペースト寒天プレートで密封します。
  2. 胚採取の3日前から12時間ごとにプレートを交換してください。これにより、 ショウジョウバエ の産卵の同期が可能になり、採卵効率が向上します。
  3. 注射当日に、ケージを最小限の酵母ペーストを含む果汁プレートに変更し、25°Cで1時間胚を採取します。最初のコレクションで十分な胚(<50個の胚)が得られない場合は、最初のプレートを廃棄し、1時間以内に100個以上の胚が産卵されるまで、2回目のコレクションでこのステップを繰り返します。
  4. プレートをケージから取り出して産卵を停止し、25°Cでさらに2時間インキュベートして、2〜3時間齢の胚を取得します。抗体注射を成功させるには、胚の正しい段階が重要です。
  5. 胚の卵殻を取り除くには、果汁プレートに50%漂白剤2 mLを加え、絵筆を使用してプレートから胚をそっと取り除きます(図2A-4)。多くの場合、胚は酵母ペーストの上に直接置かれます。この場合、酵母ペーストを漂白剤溶液に刷毛で塗り、すべての胚を採取することは許容されます。
  6. 浮遊胚を50%漂白剤で2分間インキュベートし、30秒ごとにフルーツジュースプレートを渦巻かせて、卵殻の除去効率を向上させます。
  7. 胚/漂白剤の混合物を70μmのナイロンセルストレーナーに注ぎ、移します(図2A-7)。水筒を使用して胚を完全に洗浄し、残っている漂白剤と酵母ペーストを取り除きます。セルストレーナーをペーパータオルで完全に乾かし、胚の周りの余分な水分が取り除かれていることを確認します。

3. 胚のアライメントと乾燥

  1. 5 cm x 5 cm x 0.5 cm(幅、長さ、高さ)の4%アガロースゲル(図2A-9)を調製し、ゲルを室温まで冷まします。清潔なカミソリの刃を使用して、1 cm x 3 cm x 0.5 cm(幅、長さ、高さ)のアガロースブロックを切断し、スライドガラスの上に置きます(図2A-2)。解剖スコープの下でゲルブロックを調べて、エッジがまっすぐに切断され、表面が平らで乾燥していることを確認します。
  2. 絵筆を使用して、ストレーナーからゲルブロックに胚を移します。優しくブラッシングして、ブロックの正中線に沿って胚を均等に広げます。理想的には、胚のクラスターは、互いに触れることなく、単一のものまたはダブレットに分離されます。
  3. 2本の脚をしっかりとテープで固定したピンセットを用意して、1つの細い先端を作成します(図2A-5)。解剖スコープの下で、ピンセットを使用して個々の胚を拾い上げ、ゲルブロックの長辺に沿って配置します。20〜30個の胚を整列させ、前後軸が端に平行になるようにします(図2C)。
  4. 24 mm x 50 mmのカバーガラス(図2A-1)の中央に10 μLのヘプタン接着剤(材料表を参照)をピペットで移し、ピペットチップを使用して接着剤を0.5 cm x 3 cmの長方形の領域に広げます。接着剤が完全に乾くのを待ってから使用してください。
  5. ゲルブロックのあるスライドガラスを机の端に置き、胚を外側に向けて置きます。平らな先端ピンセットを使用して接着剤でカバーガラスを持ち上げ(図2A-6)、接着剤の側面を約45度の傾斜角度で胚に向け、胚の上に静止させます。
    注意: 胚が接着剤と接触するようにカバーガラスをゲルブロックにそっと押し付けてから、すぐに圧力を解放してカバーガラスを持ち上げます。加えられる張力の量は、胚が強く押されて破裂することなく接着剤に安定して付着できるようにするために重要です。
  6. 新しいスライドガラスの中央に10 μLの水をピペットで移し、胚の側面を上に向けてカバーガラスをその上に置きます(図2B)。カバーガラスのこちら側はライブイメージングのために共焦点レンズの上に直接配置されるため、カバーガラスをスライドガラスに取り付けるには、マニキュアやその他の接着剤の代わりに水を使用してください。
  7. 乾燥チャンバー(図2A-3)(材料表を参照)で、ビテリン膜のしわが寄るまで10〜15分間胚を乾燥させます(図2E)。必要な時間は部屋の湿度によって異なる場合があり、ラボの条件ごとに実験的にテストする必要があります。
  8. 胚ストリップの一端に40μLのハロカーボンオイル(タイプ27とタイプ700の体積1:1の比率で混合したもの、 材料表を参照)をピペットで固定します。ハロカーボンオイルが胚の表面全体を覆うまでスライドを傾けます。

4. 抗体注入とイメージング

  1. マイクロピペットプーラーを使用して数本のガラス注射針を調製し(パラメーター設定については 材料表 を参照)、各針に5 μLのAlexaFluor標識抗体溶液をロードします(ステップ1.6から)。
  2. スライドガラスの上に25 mm x 25 mmのカバーガラスを置きます。40 μLのハロカーボンオイルをピペットで移し、カバーガラスの端に沿って広げます。
  3. 注射スコープの下で、針の先端をオイルの下でカバーガラスの端に合わせます。ピコポンプの注入空気圧(材料表参照)を調整して、1つのポンプ で抗体を充填した気泡を1つ発生させます。気泡の直径は20〜50μmに制限する必要があります(図2F)。
  4. 空のスライドガラスを、油下の胚を含むスライドガラスと交換します。注射針の先端を胚の前後軸に対して垂直に合わせます(図2D、G)。
  5. 胚の段階をチェックして、ほとんどの胚が細胞化を開始したが、まだ原腸形成を開始しておらず(ステージ4およびステージ5)、合胞体として残っていることを確認します(図2F、G)。
    注:この段階の特徴は、溝や折り目がなく、胚の中心に見える楕円形の濃い色の卵黄嚢が存在することです。油下での胚期の形態学的特徴付けは、Volker Hartenstein17 の著書「ショウジョウバエの胚発生の段階」の章に基づいています。
  6. X-Yステージマニピュレーターを使用して、先端が卵黄の中心に到達するまで胚を針に向かって移動させます。卵黄に抗体を注入するために2〜3回ポンプします。注入が成功したことは、胚が抗体溶液から体積を得るにつれて、ビテリン膜のしわが急速に消失することで示されます(図2G)。
  7. X-Yステージマニピュレーターを使用して、注射後に胚を針から遠ざけ、次の胚まで下向きに移動します。スライド上のすべての胚が注入されるまで、手順6を繰り返します。
  8. 胚を注入したスライドガラスを加湿チャンバーに移します(図2A-8)。胚発生の望ましい段階に達するまで25°Cでインキュベートします。
  9. 24 mm x 50 mmのカバーガラスを持ち上げてスライドガラスから外し、顕微鏡のスライドホルダーに直接入れます。胚のない側が目的に向かいます。明視野照明下で低倍率レンズを使用して胚の位置を特定し、高解像度の蛍光ライブイメージングのために40倍または63倍のレンズに切り替えます。

結果

蛍光タグベースのライブイメージングや免疫蛍光法に対する抗体注入法の利点を実証するために、存在量の少ない膜貫通受容体であるNotchの動的局在と、生きた胚におけるチロシンリン酸化と呼ばれる翻訳後修飾の一種を特徴付ける2つのケーススタディを提供します。

ノッチシグナル伝達活性は、胚発生および成体臓器の恒常性維持における細胞運命の決定に大きな役?...

ディスカッション

この手順では、カスタム抗体による蛍光標識と、その後の初期段階の ショウジョウバエ 胚への注入の特殊な方法の概要を説明します。この手法により、従来のGFP/mCherryタグ法では観察が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾をリアルタイムで可視化することができます。

この方法を拡張して野生型胚と変異胚の定量的比較を行う場合は注意が必要です。一次抗体?...

開示事項

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

謝辞

Sqh-GFP ショウジョウバエ ラインを提供し、この技術の初期開発を支援してくださったJennifer A. Zallen博士と、Notch-GFPショウ ジョウバエ ラインを提供してくれたFrancois Schweisguth博士に感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金会(32270809)からH.H.Yuへの資金提供、SUSTech生命科学院からの寛大な財政的およびスタッフ的支援、および深セン科学技術イノベーション委員会/JCYJ20200109140201722からのY. Yanへの資金提供によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSangon Biotech A620014 
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling KitInvitrogen A20185Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological MicroscopeSOPTOPEX20Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
BleachClorox®
Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision InstrumentsTW100F-4
CentrifugeEppendorf5245
Cell StrainerFALCON352350
Desiccation chamber LOCK&LOCKHSM8200320ml
Dissecting MicroscopeMshotMZ62Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided TapeScotch665
Fine Super TweezerVETUSST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: RectanglesFisherbrand12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
ForcepVETUS33A-SA
Halocarbon oil 27Sigma-AldrichH8773-100ML
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898-100ML
HeptaneSigma-AldrichH2198-1LHeptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent TOKAI1-7315-01Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301R
Micropipette pullerWorld Precision InstrumentsPUL-1000Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50.
Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 
Pneumatic picopumpWorld Precision InstrumentsPV 830Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20Santa CruzSC-508
Square petri dishesBiosharpBS-100-SD
GFP nanobodyChromotekgt

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