通过荧光抗体注射观察活果蝇胚胎中的低丰度蛋白质和翻译后修饰

摘要

该协议描述了定制的基于抗体的荧光标记和注射到早期 果蝇 胚胎中，以实现使用传统GFP / mCherry标签方法难以检测的低丰度蛋白质或翻译后修饰的实时成像。

摘要

使用 GFP（绿色荧光蛋白）和其他荧光标签对活细胞中的蛋白质进行可视化，极大地提高了对蛋白质定位、动力学和功能的理解。与免疫荧光相比，实时成像更准确地反映了蛋白质的定位，而不会因组织固定而产生潜在的伪影。重要的是，实时成像能够对蛋白质水平和定位进行定量和时间表征，这对于理解细胞运动或分裂等动态生物过程至关重要。然而，荧光标记方法的一个主要局限性是需要足够高的蛋白质表达水平才能实现成功的可视化。因此，无法检测到许多表达水平相对较低的内源性标记荧光蛋白。另一方面，使用病毒启动子的异位表达有时会导致蛋白质错定位或生理环境中的功能改变。为了解决这些局限性，提出了一种在活胚胎中利用高灵敏度抗体介导的蛋白质检测的方法，基本上无需组织固定即可进行免疫荧光。作为原理证明，在活胚胎中几乎无法检测到的内源性 GFP 标记的 Notch 受体在抗体注射后可以成功可视化。此外，这种方法适用于可视化活胚胎中的翻译后修饰 （PTM），允许检测早期胚胎发生过程中酪氨酸磷酸化模式的时间变化，并揭示顶膜下磷酸酪氨酸 （p-Tyr） 的新亚群。这种方法可以修改以适应其他蛋白质特异性、标签特异性或 PTM 特异性抗体，并且应该与其他适合注射的模式生物或细胞系兼容。该协议为低丰度蛋白质或PTM的实时成像开辟了新的可能性，而这些蛋白质或PTM以前很难使用传统的荧光标记方法进行检测。

引言

免疫荧光是现代细胞生物学的一项基石技术，最初由 Albert Coons 开发，它能够检测其天然细胞区室的分子并表征亚细胞器或机器的分子组成¹。结合基因操作，免疫荧光有助于建立现在广为接受的概念，即蛋白质定位对其功能至关重要²。除了特异性一抗和明亮的荧光染料外，该技术的成功还依赖于称为固定和透化的初步过程，该过程保留了细胞形态，固定了抗原，并增加了抗体进入细胞内区室的可及性。不可避免地，固定和透化过程会杀死细胞并终止所有生物过程³.因此，免疫荧光仅提供蛋白质生命旅程的快照。然而，许多生物过程（如细胞迁移和分裂）本质上是动态的，需要以时空分辨的方式研究蛋白质行为^4,5。

为了研究生物体中的蛋白质动力学，已经开发了基于基因编码荧光蛋白（如绿色荧光蛋白 （GFP）⁶ 和高速共聚焦显微镜）的实时成像方法。简而言之，目标蛋白可以通过基因操作与GFP⁷融合，然后从病毒或酵母启动子（如巨细胞病毒（CMV）⁸ 或上游激活序列（UAS）⁹）异位表达....

研究方案

实验是按照南方科技大学生命科学学院的指导和批准进行的。使用的生物体是黑腹果蝇，基因型是Notch-Knockin-GFP（X染色体）和Sqh-sqh-GFP（染色体II），分别由Francois Schweisguth博士（巴斯德研究所）和Jennifer Zallen博士（斯隆凯特琳研究所）的实验室慷慨提供。虽然该协议主要侧重于抗体标记和实时成像方面，但有关果蝇胚胎收集和注射的更详细描述，请参阅已发表的报告^15,16。

1. 抗体的荧光标记

1. 优选地，使用单克隆抗体或纳米抗体来获取目标蛋白。制备 1 mg/mL 或更高的抗体储备浓度。
   注：在本研究中，以GFP纳米抗体（见 材料表）为例。市售的GFP纳米抗体的包装浓度为1.0 mg/mL，体积为250 μL。 此外，还利用了市售的抗体标记试剂盒（参见 材料表），该试剂盒通过琥珀酰亚胺酯反应将 Alexa Fluor 594 偶联到蛋白质的伯胺上¹¹。重要的是，这种标记过程不会显著改变抗体浓度。
2. 通过将组分 B（在抗体标记试剂盒中提供）重悬于 1 mL 去离子水中来制备 1 M 碳酸氢....

讨论

该介绍的程序概述了使用定制抗体进行荧光标记并随后注射到早期 果蝇 胚胎中的专用方法。该技术有助于实时可视化少量存在的蛋白质或翻译后修饰，这些蛋白质或翻译后修饰通常难以通过传统的GFP/mCherry标记方法观察到。

在扩展该方法以在野生型和突变型胚胎之间进行定量比较时应谨慎行事。虽然在免疫荧光中，对照组和实验组之间的一抗和二抗浓度可以保持相同?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt