Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

Resumo

Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Resumo

A visualização de proteínas em células vivas usando GFP (Green Fluorescent Protein) e outras etiquetas fluorescentes melhorou muito a compreensão da localização, dinâmica e função de proteínas. Em comparação com a imunofluorescência, a imagem viva reflete com mais precisão a localização de proteínas sem potenciais artefatos decorrentes da fixação tecidual. É importante ressaltar que imagens ao vivo permitem a caracterização quantitativa e temporal dos níveis e localização de proteínas, cruciais para a compreensão de processos biológicos dinâmicos, como movimento ou divisão celular. No entanto, uma das principais limitações das abordagens de marcação fluorescente é a necessidade de níveis de expressão proteica suficientemente altos para alcançar uma visualização bem-sucedida. Consequentemente, muitas proteínas fluorescentes marcadas endogenamente com níveis de expressão relativamente baixos não podem ser detectadas. Por outro lado, a expressão ectópica usando promotores virais pode, por vezes, levar à má localização de proteínas ou alterações funcionais em contextos fisiológicos. Para abordar essas limitações, é apresentada uma abordagem que utiliza a detecção de proteínas mediadas por anticorpos altamente sensíveis em embriões vivos, essencialmente realizando imunofluorescência sem a necessidade de fixação tecidual. Como prova de princípio, o receptor Notch marcado com GFP endogenamente que é pouco detectável em embriões vivos pode ser visualizado com sucesso após a injeção de anticorpos. Além disso, essa abordagem foi adaptada para visualizar modificações pós-traducionais (MPTs) em embriões vivos, permitindo a detecção de mudanças temporais nos padrões de fosforilação da tirosina durante o início da embriogênese e revelando uma nova subpopulação de fosfotirosina (p-Tyr) sob membranas apicais. Essa abordagem pode ser modificada para acomodar outros anticorpos específicos para proteínas, específicos para tags ou específicos para PTM e deve ser compatível com outros organismos modelo ou linhagens celulares passíveis de injeção. Este protocolo abre novas possibilidades para imagens ao vivo de proteínas de baixa abundância ou PTMs que anteriormente eram difíceis de detectar usando métodos tradicionais de marcação fluorescente.

Introdução

A imunofluorescência é uma técnica fundamental da biologia celular moderna originalmente desenvolvida por Albert Coons, que permite a detecção de moléculas em seus compartimentos celulares nativos e a caracterização das composições moleculares de organelas ou máquinas^{subcelulares1}. Aliada às manipulações genéticas, a imunofluorescência ajuda a estabelecer o conceito hoje bem aceito de que a localização de proteínas é essencial para sua função². Além de anticorpos primários específicos e corantes fluorescentes brilhantes, o sucesso dessa técnica depende de um processo preliminar denominado fixação e permeabilização, que preserva morfologias celulares, imobiliza antígenos e aumenta a acessibilidade dos anticorpos nos compartimentos intracelulares. Inevitavelmente, o processo de fixação e permeabilização mataria as células e encerraria todos os processos biológicos³. Portanto, a imunofluorescência fornece apenas instantâneos da jornada de vida das proteínas. Entretanto, muitos processos biológicos, como migração e divisão celular, são de natureza dinâmica, exigindo investigação do comportamento proteico de forma espacial-temporalmente resolvida ^4,5.

Para examinar a dinâmica de proteínas em organismos vivos, métodos de imagem vivos baseados em proteínas fluorescentes codificadas geneticamente, como a proteína fluorescente verde (GFP)⁶ e microscópios confocais de alta velocidade, foram desenvolvidos. Resumidamente, a proteína de interesse pode ser geneticamente manipulada para ser fundida com GFP⁷ e, em seguida, expressa ectopicamente a partir de promotores virais ou de leveduras, como citomegalovírus (CMV)⁸ ou sequência de ativação a montante (UAS)⁹. Como a GFP é de natureza autofluorescente, não são necessários anticorpos acoplados a fluoróforos para revelar a localização das proteínas-alvo, o que ignora a necessidade de processos preliminares de fixação ou permeabilização. Nas últimas duas décadas, etiquetas fluorescentes abrangendo todo o espectro de comprimento de onda foram desenvolvidas¹⁰, permitindo imagens ao vivo multicoloridas de várias proteínas-alvo ao mesmo tempo. No entanto, em comparação com corantes fluorescentes quimicamente modificados, como AlexaFluor ou ATTO, a autofluorescência dessas proteínas fluorescentes codificadas geneticamente é relativamente fraca e instável quando expressa a partir de promotores endógenos, especialmente durante imagens ao vivo em escalas de tempo mais longas¹⁰. Embora essa deficiência possa ser atenuada pela superexpressão de proteínas-alvo marcadas fluorescentemente, muitas com atividades enzimáticas, como quinases e fosfatases, interrompem severamente os processos biológicos normais se não forem expressas em níveis fisiológicos.

Este protocolo apresenta um método que permite a iluminação do alvo fotoestável baseada em anticorpos em uma configuração de imagem ao vivo, permitindo essencialmente a imunofluorescência sem o processo de fixação ou permeabilização (Figura 1). Através de uma reação de amina primária simples baseada no NHS¹¹, pode-se conjugar corantes fluorescentes como AlexaFluor 488 ou 594 com essencialmente qualquer anticorpo primário ou nanocorpo GFP/HA/Myc¹². Aproveitando uma característica de desenvolvimento de que todas as células embrionárias de Drosophila compartilham um citoplasma comum durante o estágio de sincício¹³, pode-se obter ligação e iluminação antigênica em embriões inteiros após a injeção de anticorpos conjugados com corante. Com a expansão de bibliotecas de proteínas marcadas endogenamente disponíveis em Drosophila e outros sistemas modelo¹⁴, este método pode potencialmente ampliar as aplicações dessas bibliotecas revelando a dinâmica de proteínas marcadas fluorescentemente de baixa abundância e outras proteínas marcadas não fluorescentemente (HA/Myc-tagged) em tecidos vivos.

Protocolo

Os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes e aprovação da Faculdade de Ciências da Vida da Universidade SUSTech. O organismo utilizado é Drosophila melanogaster, e os genótipos são Notch-Knockin-GFP (Cromossomo X) e Sqh-sqh-GFP (Cromossomo II), generosamente fornecidos pelos laboratórios do Dr. François Schweisguth (Instituto Pasteur) e da Dra. Jennifer Zallen (Instituto Sloan Kettering), respectivamente. Embora este protocolo se concentre principalmente em aspectos de marcação de anticorpos e imagens vivas, consulte os relatórios publicados para descrições mais detalhadas da coleta e injeção de embriões de Drosophila ^15,16.

1. Marcação fluorescente de anticorpos

1. Preferencialmente, utilizar anticorpos monoclonais ou nanocorpos para a proteína de interesse. Preparar a concentração de estoque de anticorpos em 1 mg/mL ou superior.
   NOTA: Neste estudo, o nanocorpo GFP (ver Tabela de Materiais) é usado como exemplo. O nanocorpo de GFP comercialmente disponível é embalado a uma concentração de 1,0 mg/mL e um volume de 250 μL. Além disso, é utilizado um kit de marcação de anticorpos comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais), que conjuga Alexa Fluor 594 a aminas primárias de proteínas por meio de uma reação de éster succinimidílico¹¹. É importante ressaltar que esse processo de marcação não altera significativamente a concentração de anticorpos.
2. Preparar uma solução de bicarbonato de sódio 1 M ressuspendendo o componente B (fornecido no kit de marcação de anticorpos) em 1 mL de água deionizada.
3. Ajustar a concentração de anticorpos para 1,0 mg/mL e, em seguida, adicionar 1/10^{do volume} (10 μL para 100 μL de nanocorpo GFP) da solução de bicarbonato de sódio 1 M.
4. Adicionar 110 μL da mistura de anticorpos (a partir do passo 1.3) diretamente ao tubo contendo o corante Alexa Fluor 594. Inverter para misturar (não vórtice) e incubar em um rotador por 1 h à temperatura ambiente.
5. Montar a coluna de purificação a partir do kit de conjugação (ver Tabela de Materiais). Preparar um leito de resina de 1,5 ml (fornecido no kit de marcação de anticorpos) e centrifugar a coluna a 1100 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente (TR) para remover o excesso de líquido da resina.
6. Adicionar a mistura de reacção (a partir do passo 1.4) no topo da coluna de resina e centrifugar a 1100 x g durante 5 minutos a 4 °C para recolher o anticorpo marcado. O anticorpo coletado deve aparecer de cor rosa, e o volume deve ser ligeiramente inferior a 100 μL. Armazenar em tubos de papel alumínio ou de cor escura a 4 °C.

2. Preparação de embriões de Drosophila

1. Coloque 200 Drosophila adultas recém-eclodidas em uma gaiola em forma de cilindro plástico (diâmetro = 5 cm, altura = 8 cm) com uma proporção macho/fêmea de 1: 10. Sele um lado com malha metálica porosa para ventilação e o outro lado com uma placa de ágar suco de frutas/pasta de levedura.
2. Troque a placa a cada 12 h por três dias antes da coleta do embrião. Isso permite a sincronização da postura de ovos de Drosophila e melhora a eficiência da coleta.
3. No dia da injeção, troque a gaiola para um prato de suco de frutas com pasta de levedura mínima e colete embriões a 25 °C por 1 h. Se a primeira rodada de coleta não produzir embriões suficientes (<50 embriões), descarte a primeira placa e repita essa etapa para uma segunda rodada de coleta até que mais de 100 embriões sejam colocados dentro de 1 h.
4. Retire a placa da gaiola para parar a postura de ovos e incube a 25 °C por mais 2 h para obter embriões com 2-3 h de idade. O estágio correto dos embriões é fundamental para o sucesso da injeção de anticorpos.
5. Para remover a casca dos embriões, adicione 2 mL de água sanitária a 50% à placa de suco de frutas e desaloje suavemente os embriões da placa usando um pincel (Figura 2A-4). Muitas vezes, os embriões serão colocados diretamente sobre a pasta de levedura. Neste caso, é aceitável escovar a pasta de levedura na solução de água sanitária para coletar todos os embriões.
6. Incubar os embriões flutuantes em água sanitária a 50% por 2 min e agitar a placa de suco de frutas a cada 30 s para melhorar a eficiência da remoção da casca do ovo.
7. Transfira a mistura embrião/água sanitária despejando-a em um filtro de células de nylon de 70 μm (Figura 2A-7). Lave bem os embriões usando uma garrafa de água para remover qualquer água sanitária residual e pasta de levedura. Seque completamente o filtro celular com papel toalha, garantindo que qualquer excesso de água ao redor dos embriões seja removido.

3. Alinhamento e dessecação do embrião

1. Prepare um gel de agarose 4% de 5 cm x 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (largura, comprimento, altura) (Figura 2A-9) e deixe o gel arrefecer até à temperatura ambiente. Corte um bloco de agarose de 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (largura, comprimento, altura) usando uma lâmina de barbear limpa e coloque o bloco em uma lâmina de vidro (Figura 2A-2). Examine o bloco de gel sob o escopo de dissecação para garantir que as bordas sejam cortadas retas e a superfície seja plana e seca.
2. Transfira embriões do filtro para o bloco de gel usando um pincel. Espalhe os embriões uniformemente ao longo da linha média do bloco, escovando suavemente. O ideal é que os aglomerados de embriões sejam separados em solteiros ou duplos sem se tocar.
3. Prepare uma pinça com duas pernas bem unidas para criar uma única ponta fina (Figura 2A-5). Sob um escopo de dissecação, pegue embriões individuais usando a pinça e coloque-os ao longo da borda longa do bloco de gel. Alinhar 20-30 embriões, garantindo que seu eixo anteroposterior seja paralelo à borda (Figura 2C).
4. Pipetar cola de heptano de 10 μL (ver Tabela de Materiais) no centro de uma lamínula de 24 mm x 50 mm (Figura 2A-1) e espalhar a cola em uma área retangular de 0,5 cm x 3 cm usando uma ponta de pipeta. Espere a cola secar completamente antes de usar.
5. Coloque a lâmina de vidro com o bloco de gel na borda da mesa, com os embriões voltados para fora. Levante a lamínula com cola usando uma pinça de ponta plana (Figura 2A-6) e segure-a ainda em cima dos embriões, com o lado da cola voltado para os embriões em um ângulo inclinado de cerca de 45 graus.
   NOTA: Pressione suavemente a lamínula contra o bloco de gel para que os embriões fiquem em contato com a cola e, em seguida, solte rapidamente a pressão e levante a lamínula. A quantidade de tensão aplicada é fundamental para que os embriões possam ser fixados de forma estável à cola sem serem pressionados com muita força e estourarem.
6. Pipetar 10 μL de água no centro de uma nova lâmina de vidro e colocar a lamínula com os embriões por cima, com o lado do embrião voltado para cima (Figura 2B). Certifique-se de usar água em vez de esmalte de unha ou outra cola adesiva para prender a tampa à lâmina de vidro, pois este lado da tampa será colocado diretamente sobre a lente confocal para imagens ao vivo.
7. Secar os embriões em câmara de dessecação (Figura 2A-3) (ver Tabela de Materiais) por 10-15 min até que a membrana vitelínica enruge (Figura 2E). O tempo necessário pode variar de acordo com a umidade da sala e deve ser testado experimentalmente para cada condição de laboratório.
8. Pipetar 40 μL de óleo de halocarbono (uma mistura do tipo 27 e do tipo 700 numa proporção de 1: 1 em volume, ver Tabela de Materiais) numa extremidade da tira de embriões. Incline a lâmina até que o óleo de halocarbono cubra toda a superfície dos embriões.

4. Injeção de anticorpos e exames de imagem

1. Prepare algumas agulhas de vidro de injeção usando um extrator de micropipeta (consulte a Tabela de materiais para configurações de parâmetros) e carregue cada agulha com 5 μL de solução de anticorpos marcada com AlexaFluor (a partir da etapa 1.6).
2. Coloque uma tampa de 25 mm x 25 mm em cima de uma lâmina de vidro. Pipetar 40 μL de óleo de halocarbono e espalhá-lo ao longo da borda da lamínula.
3. Sob o escopo de injeção, alinhe a ponta da agulha contra a borda da tampa sob óleo. Ajuste a pressão do ar de injeção da picobomba (consulte a Tabela de Materiais) para que uma bomba gere uma bolha cheia de anticorpos. O diâmetro da bolha deve ser limitado a 20-50 μm (Figura 2F).
4. Substitua a lâmina de vidro vazia por uma que contenha embriões sob óleo. Alinhar a ponta da agulha de injeção perpendicularmente ao eixo anteroposterior dos embriões (Figura 2D,G).
5. Verificar o estágio dos embriões para certificar-se de que a maioria iniciou a celularização, mas ainda não iniciou a gastrulação (estágio 4 e estágio 5), permanecendo como sincício (Figura 2F,G).
   NOTA: A característica desta fase é a ausência de quaisquer sulcos ou dobras e a presença de um saco vitelino de forma oval de cor escura visível no centro do embrião. A caracterização morfológica do estágio embrionário sob óleo é baseada no capítulo de livro "Estágios da embriogênese de Drosophila" de Volker^{Hartenstein17}.
6. Use o manipulador de estágio X-Y para mover os embriões em direção à agulha até que a ponta chegue ao centro da gema. Bombeie de duas a três vezes para injetar anticorpos na gema. O sucesso da injeção é indicado pelo rápido desaparecimento da ruga da membrana vitelínica, à medida que os embriões ganham volume da solução de anticorpos (Figura 2G).
7. Use o manipulador de estágio X-Y para afastar os embriões da agulha após a injeção e mover-se para baixo para o próximo embrião. Repita o passo 6 até que todos os embriões na lâmina sejam injetados.
8. Transferir a lâmina de vidro com embriões injetados para uma câmara de umidade (Figura 2A-8). Incubar a 25 °C até atingir a fase desejada de desenvolvimento embrionário.
9. Retire a tampa de 24 mm x 50 mm da lâmina de vidro e coloque-a diretamente no suporte da lâmina do microscópio. O lado sem embriões estará voltado para os objetivos. Localize os embriões usando uma lente de baixa ampliação sob iluminação de campo brilhante e mude para uma lente de 40x ou 63x para imagens ao vivo fluorescentes de alta resolução.

Resultados

Para demonstrar as vantagens do método de injeção de anticorpos sobre imagens ao vivo baseadas em etiquetas fluorescentes ou imunofluorescência, são fornecidos dois estudos de caso que caracterizam a localização dinâmica de um receptor transmembrana de baixa abundância, Notch, e um tipo de modificação pós-traducional chamada fosforilação de tirosina em embriões vivos.

A atividade de sinalização da fossa desempenha um papel importante na determinação do destino celular durant...

Discussão

Este procedimento apresentado descreve o método especializado de marcação por fluorescência com anticorpos personalizados e subsequente injeção em embriões de Drosophila em estágio inicial. Esta técnica facilita a visualização em tempo real de proteínas ou modificações pós-traducionais que existem em baixas quantidades e são tipicamente difíceis de observar através de métodos convencionais de marcação GFP/mCherry.

Deve-se ter cautela ao estender esse método para ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt