Visualizzazione di proteine a bassa abbondanza e modificazioni post-traduzionali in embrioni di Drosophila viventi tramite iniezione di anticorpi fluorescenti

Riepilogo

Questo protocollo descrive la marcatura e l'iniezione di fluorescenza personalizzata basata su anticorpi negli embrioni precoci di Drosophila per consentire l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o modifiche post-traduzionali che sono difficili da rilevare utilizzando i tradizionali approcci GFP/mCherry-tag.

Abstract

La visualizzazione delle proteine nelle cellule viventi utilizzando GFP (Green Fluorescent Protein) e altri tag fluorescenti ha notevolmente migliorato la comprensione della localizzazione, della dinamica e della funzione delle proteine. Rispetto all'immunofluorescenza, l'imaging dal vivo riflette in modo più accurato la localizzazione delle proteine senza potenziali artefatti derivanti dalla fissazione dei tessuti. È importante sottolineare che l'imaging dal vivo consente la caratterizzazione quantitativa e temporale dei livelli e della localizzazione delle proteine, fondamentali per la comprensione di processi biologici dinamici come il movimento o la divisione cellulare. Tuttavia, una delle principali limitazioni degli approcci di marcatura fluorescente è la necessità di livelli di espressione proteica sufficientemente elevati per ottenere una visualizzazione di successo. Di conseguenza, molte proteine fluorescenti marcate endogenamente con livelli di espressione relativamente bassi non possono essere rilevate. D'altra parte, l'espressione ectopica mediante promotori virali può talvolta portare a una dislocalizzazione delle proteine o ad alterazioni funzionali in contesti fisiologici. Per affrontare queste limitazioni, viene presentato un approccio che utilizza la rilevazione di proteine mediate da anticorpi altamente sensibili negli embrioni viventi, essenzialmente eseguendo l'immunofluorescenza senza la necessità di fissazione tissutale. Come prova di principio, il recettore Notch marcato endogenamente con GFP, che è appena rilevabile negli embrioni viventi, può essere visualizzato con successo dopo l'iniezione di anticorpi. Inoltre, questo approccio è stato adattato per visualizzare le modificazioni post-traduzionali (PTM) negli embrioni viventi, consentendo di rilevare cambiamenti temporali nei modelli di fosforilazione della tirosina durante l'embriogenesi precoce e rivelando una nuova sottopopolazione di fosfotirosina (p-Tyr) sotto le membrane apicali. Questo approccio può essere modificato per adattarsi ad altri anticorpi proteina-specifici, tag-specifici o PTM-specifici e dovrebbe essere compatibile con altri organismi modello o linee cellulari suscettibili di iniezione. Questo protocollo apre nuove possibilità per l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o PTM che in precedenza erano difficili da rilevare con i tradizionali metodi di marcatura fluorescente.

Introduzione

L'immunofluorescenza è una tecnica fondamentale della moderna biologia cellulare originariamente sviluppata da Albert Coons, che consente la rilevazione di molecole nei loro compartimenti cellulari nativi e la caratterizzazione delle composizioni molecolari di organelli subcellulari o macchinari¹. Insieme alle manipolazioni genetiche, l'immunofluorescenza aiuta a stabilire il concetto, ormai ben accettato, che la localizzazione delle proteine è essenziale per la sua funzione². A parte gli anticorpi primari specifici e i coloranti fluorescenti brillanti, il successo di questa tecnica si basa su un processo preliminare chi....

Protocollo

Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida e l'approvazione della School of Life Sciences dell'Università SUSTech. L'organismo utilizzato è Drosophila melanogaster, e i genotipi sono Notch-Knockin-GFP (Cromosoma X) e Sqh-sqh-GFP (Cromosoma II), generosamente forniti rispettivamente dai laboratori del Dr. Francois Schweisguth (Institute Pasteur) e della Dr.ssa Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute). Sebbene questo protocollo si concentri principalmente sugli aspetti della marcatura degli anticorpi e dell'imaging dal vivo, si prega di fare riferimento ai rapporti pubblicati per descrizioni più dettagliate della raccolta e dell'ini....

Discussione

Questa procedura presentata delinea il metodo specializzato di marcatura a fluorescenza con anticorpi personalizzati e successiva iniezione in embrioni di Drosophila in fase iniziale. Questa tecnica facilita la visualizzazione in tempo reale di proteine o modificazioni post-traduzionali che esistono in piccole quantità e sono in genere difficili da osservare attraverso i metodi convenzionali di marcatura GFP/mCherry.

Occorre prestare attenzione quando si estende questo metodo per eff.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt