Visualizzazione di proteine a bassa abbondanza e modificazioni post-traduzionali in embrioni di Drosophila viventi tramite iniezione di anticorpi fluorescenti

Riepilogo

Questo protocollo descrive la marcatura e l'iniezione di fluorescenza personalizzata basata su anticorpi negli embrioni precoci di Drosophila per consentire l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o modifiche post-traduzionali che sono difficili da rilevare utilizzando i tradizionali approcci GFP/mCherry-tag.

Abstract

La visualizzazione delle proteine nelle cellule viventi utilizzando GFP (Green Fluorescent Protein) e altri tag fluorescenti ha notevolmente migliorato la comprensione della localizzazione, della dinamica e della funzione delle proteine. Rispetto all'immunofluorescenza, l'imaging dal vivo riflette in modo più accurato la localizzazione delle proteine senza potenziali artefatti derivanti dalla fissazione dei tessuti. È importante sottolineare che l'imaging dal vivo consente la caratterizzazione quantitativa e temporale dei livelli e della localizzazione delle proteine, fondamentali per la comprensione di processi biologici dinamici come il movimento o la divisione cellulare. Tuttavia, una delle principali limitazioni degli approcci di marcatura fluorescente è la necessità di livelli di espressione proteica sufficientemente elevati per ottenere una visualizzazione di successo. Di conseguenza, molte proteine fluorescenti marcate endogenamente con livelli di espressione relativamente bassi non possono essere rilevate. D'altra parte, l'espressione ectopica mediante promotori virali può talvolta portare a una dislocalizzazione delle proteine o ad alterazioni funzionali in contesti fisiologici. Per affrontare queste limitazioni, viene presentato un approccio che utilizza la rilevazione di proteine mediate da anticorpi altamente sensibili negli embrioni viventi, essenzialmente eseguendo l'immunofluorescenza senza la necessità di fissazione tissutale. Come prova di principio, il recettore Notch marcato endogenamente con GFP, che è appena rilevabile negli embrioni viventi, può essere visualizzato con successo dopo l'iniezione di anticorpi. Inoltre, questo approccio è stato adattato per visualizzare le modificazioni post-traduzionali (PTM) negli embrioni viventi, consentendo di rilevare cambiamenti temporali nei modelli di fosforilazione della tirosina durante l'embriogenesi precoce e rivelando una nuova sottopopolazione di fosfotirosina (p-Tyr) sotto le membrane apicali. Questo approccio può essere modificato per adattarsi ad altri anticorpi proteina-specifici, tag-specifici o PTM-specifici e dovrebbe essere compatibile con altri organismi modello o linee cellulari suscettibili di iniezione. Questo protocollo apre nuove possibilità per l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o PTM che in precedenza erano difficili da rilevare con i tradizionali metodi di marcatura fluorescente.

Introduzione

L'immunofluorescenza è una tecnica fondamentale della moderna biologia cellulare originariamente sviluppata da Albert Coons, che consente la rilevazione di molecole nei loro compartimenti cellulari nativi e la caratterizzazione delle composizioni molecolari di organelli subcellulari o macchinari¹. Insieme alle manipolazioni genetiche, l'immunofluorescenza aiuta a stabilire il concetto, ormai ben accettato, che la localizzazione delle proteine è essenziale per la sua funzione². A parte gli anticorpi primari specifici e i coloranti fluorescenti brillanti, il successo di questa tecnica si basa su un processo preliminare chiamato fissazione e permeabilizzazione, che preserva le morfologie cellulari, immobilizza gli antigeni e aumenta l'accessibilità degli anticorpi nei compartimenti intracellulari. Inevitabilmente, il processo di fissazione e permeabilizzazione ucciderebbe le cellule e porrebbe fine a tutti i processi biologici³. Pertanto, l'immunofluorescenza fornisce solo istantanee del percorso di vita delle proteine. Tuttavia, molti processi biologici come la migrazione e le divisioni cellulari sono di natura dinamica e richiedono lo studio dei comportamenti delle proteine in modo spazio-temporalmente risolto ^4,5.

Per esaminare la dinamica delle proteine negli organismi viventi, sono stati sviluppati metodi di imaging dal vivo basati su proteine fluorescenti geneticamente codificate come la proteina fluorescente verde (GFP)⁶ e microscopi confocali ad alta velocità. In breve, la proteina di interesse può essere manipolata geneticamente per essere fusa con GFP⁷ e quindi espressa ectopicamente da promotori virali o di lievito come il citomegalovirus (CMV)⁸ o la sequenza di attivazione a monte (UAS)⁹. Poiché la GFP è di natura autofluorescente, non sono necessari anticorpi accoppiati a fluorofori per rivelare la localizzazione delle proteine bersaglio, il che bypassa la necessità di processi preliminari di fissazione o permeabilizzazione. Negli ultimi due decenni, sono stati sviluppati tag fluorescenti che coprono l'intero spettro della lunghezza d'onda¹⁰, consentendo l'imaging dal vivo multicolore di diverse proteine bersaglio contemporaneamente. Tuttavia, rispetto ai coloranti fluorescenti ingegnerizzati chimicamente come AlexaFluor o ATTO, l'autofluorescenza di queste proteine fluorescenti geneticamente codificate è relativamente debole e instabile quando espressa da promotori endogeni, specialmente durante l'imaging dal vivo su scale temporali più lunghe¹⁰. Mentre questa carenza può essere mitigata sovraesprimendo proteine bersaglio marcate con fluorescenza, molte con attività enzimatiche come chinasi e fosfatasi interrompono gravemente i normali processi biologici se non espresse a livelli fisiologici.

Questo protocollo presenta un metodo che consente l'illuminazione del bersaglio basata su anticorpi fotostabili in una configurazione di immagine dal vivo, consentendo essenzialmente l'immunofluorescenza senza il processo di fissazione o permeabilizzazione (Figura 1). Attraverso una semplice reazione amminica primaria basata su NHS¹¹, è possibile coniugare coloranti fluorescenti come AlexaFluor 488 o 594 con essenzialmente qualsiasi anticorpo primario o GFP/HA/Myc nanobody¹². Sfruttando una caratteristica di sviluppo che tutte le cellule embrionali di Drosophila condividono un citoplasma comune durante lo stadio¹³ del sincizio, è possibile ottenere il legame dell'antigene e l'illuminazione in interi embrioni dopo l'iniezione di anticorpi coniugati con coloranti. Con l'espansione delle librerie di proteine marcate endogenamente disponibili in Drosophila e in altri sistemi modello¹⁴, questo metodo può potenzialmente ampliare le applicazioni di queste librerie rivelando le dinamiche di proteine marcate fluorescenti a bassa abbondanza e di altre proteine marcate in modo fluorescente (HA/Myc-tagged) nei tessuti viventi.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida e l'approvazione della School of Life Sciences dell'Università SUSTech. L'organismo utilizzato è Drosophila melanogaster, e i genotipi sono Notch-Knockin-GFP (Cromosoma X) e Sqh-sqh-GFP (Cromosoma II), generosamente forniti rispettivamente dai laboratori del Dr. Francois Schweisguth (Institute Pasteur) e della Dr.ssa Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute). Sebbene questo protocollo si concentri principalmente sugli aspetti della marcatura degli anticorpi e dell'imaging dal vivo, si prega di fare riferimento ai rapporti pubblicati per descrizioni più dettagliate della raccolta e dell'iniezione di embrioni di Drosophila ^15,16.

1. Marcatura fluorescente degli anticorpi

1. Preferibilmente, utilizzare anticorpi monoclonali o nanocorpi per la proteina di interesse. Preparare la concentrazione madre di anticorpi a 1 mg/mL o superiore.
   NOTA: In questo studio, il nanocorpo GFP (vedi Tabella dei materiali) viene utilizzato come esempio. Il nanocorpo GFP disponibile in commercio è confezionato a una concentrazione di 1,0 mg/mL e un volume di 250 μL. Inoltre, viene utilizzato un kit di marcatura degli anticorpi disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), che coniuga Alexa Fluor 594 alle ammine primarie delle proteine attraverso una reazione di estere succinimidilico¹¹. È importante sottolineare che questo processo di marcatura non altera in modo significativo la concentrazione di anticorpi.
2. Preparare una soluzione di bicarbonato di sodio 1 M risospendendo il componente B (fornito nel kit di marcatura degli anticorpi) in 1 mL di acqua deionizzata.
3. Regolare la concentrazione di anticorpi a 1,0 mg/mL, quindi aggiungere 1/10^{del volume (} 10 μL per 100 μL di nanocorpo GFP) della soluzione di bicarbonato di sodio 1 M.
4. Aggiungere 110 μL della miscela di anticorpi (dal punto 1.3) direttamente alla provetta contenente il colorante Alexa Fluor 594. Capovolgere per mescolare (non vorticare) e incubare su un rotatore per 1 ora a temperatura ambiente.
5. Assemblare la colonna di purificazione dal kit di coniugazione (vedi Tabella dei materiali). Preparare un letto di resina da 1,5 mL (fornito nel kit di marcatura degli anticorpi) e centrifugare la colonna a 1100 x g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT) per rimuovere il liquido in eccesso dalla resina.
6. Aggiungere la miscela di reazione (dal punto 1.4) goccia a goccia sulla parte superiore della colonna di resina e centrifugare a 1100 x g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere l'anticorpo marcato. L'anticorpo raccolto deve apparire di colore rosa e il volume deve essere leggermente inferiore a 100 μL. Conservare in provette avvolte in pellicola o di colore scuro a 4 °C.

2. Preparazione degli embrioni di Drosophila

1. Metti 200 Drosophila adulte appena nate in una gabbia di plastica a forma di cilindro (diametro = 5 cm, altezza = 8 cm) con un rapporto maschio-femmina di 1:10. Sigillare un lato con una rete metallica porosa per la ventilazione e l'altro lato con una piastra di agar di succo di frutta/pasta di lievito.
2. Cambiare la piastra ogni 12 ore per tre giorni prima del prelievo degli embrioni. Ciò consente la sincronizzazione della deposizione delle uova di Drosophila e migliora l'efficienza della raccolta.
3. Il giorno dell'iniezione, sostituire la gabbia in un piatto di succo di frutta con una quantità minima di pasta di lievito e raccogliere gli embrioni a 25 °C per 1 ora. Se il primo ciclo di raccolta non produce un numero sufficiente di embrioni (<50 embrioni), scartare la prima piastra e ripetere questa fase per un secondo ciclo di raccolta fino a quando non vengono deposti più di 100 embrioni entro 1 ora.
4. Rimuovere la piastra dalla gabbia per fermare la deposizione dell'uovo e incubare a 25 °C per altre 2 ore per ottenere embrioni di 2-3 ore. Il corretto stadio degli embrioni è fondamentale per il successo dell'iniezione di anticorpi.
5. Per rimuovere il guscio d'uovo degli embrioni, aggiungere 2 ml di candeggina al 50% nel piatto del succo di frutta e rimuovere delicatamente gli embrioni dal piatto usando un pennello (Figura 2A-4). Spesso, gli embrioni vengono deposti direttamente sopra la pasta di lievito. In questo caso, è accettabile spennellare la pasta di lievito nella soluzione di candeggina per raccogliere tutti gli embrioni.
6. Incubare gli embrioni galleggianti in candeggina al 50% per 2 minuti e far roteare il piatto di succo di frutta ogni 30 secondi per migliorare l'efficienza della rimozione del guscio d'uovo.
7. Trasferire la miscela di embrioni/candeggina versandola in un colino per celle di nylon da 70 μm (Figura 2A-7). Lavare accuratamente gli embrioni con una bottiglia d'acqua per rimuovere eventuali residui di candeggina e pasta di lievito. Asciugare completamente il colino cellulare con carta assorbente, assicurandosi che l'acqua in eccesso intorno agli embrioni venga rimossa.

3. Allineamento ed essiccazione dell'embrione

1. Preparare un gel di agarosio al 4% di 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (larghezza, lunghezza, altezza) (Figura 2A-9) e lasciare raffreddare il gel a temperatura ambiente. Tagliare un blocco di agarosio di 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (larghezza, lunghezza, altezza) utilizzando una lametta pulita e posizionare il blocco su un vetrino (Figura 2A-2). Esaminare il blocco di gel sotto il cannocchiale di dissezione per assicurarsi che i bordi siano tagliati dritti e che la superficie sia piana e asciutta.
2. Trasferire gli embrioni dal colino sul blocco di gel utilizzando un pennello. Distribuire gli embrioni in modo uniforme lungo la linea mediana del blocco spazzolando delicatamente. Idealmente, i gruppi di embrioni vengono separati in singoli embrioni o doppietti senza toccarsi.
3. Preparate una pinzetta con due gambe strettamente legate insieme per creare un'unica punta sottile (Figura 2A-5). Sotto un cannocchiale da dissezione, prelevare i singoli embrioni con la pinzetta e posizionarli lungo il bordo lungo del blocco di gel. Allineare 20-30 embrioni, assicurandosi che il loro asse antero-posteriore sia parallelo al bordo (Figura 2C).
4. Pipettare colla eptanica da 10 μL (vedere la tabella dei materiali) al centro di un vetrino coprioggetto da 24 mm x 50 mm (Figura 2A-1) e stendere la colla in un'area rettangolare di 0,5 cm x 3 cm utilizzando un puntale per pipetta. Attendere che la colla si asciughi completamente prima dell'uso.
5. Posiziona il vetrino con il blocco di gel sul bordo della scrivania, con gli embrioni rivolti verso l'esterno. Sollevate il vetrino coprioggetto con la colla usando una pinzetta a punta piatta (Figura 2A-6) e tenetelo fermo sopra gli embrioni, con il lato della colla rivolto verso gli embrioni con un angolo inclinato di circa 45 gradi.
   NOTA: Premere delicatamente il vetrino coprioggetto contro il blocco di gel in modo che gli embrioni siano a contatto con la colla, quindi rilasciare rapidamente la pressione e sollevare il vetrino coprioggetto. La quantità di tensione applicata è fondamentale in modo che gli embrioni possano essere attaccati stabilmente alla colla senza essere premuti troppo forte e scoppiare.
6. Pipettare 10 μL di acqua al centro di un nuovo vetrino e posizionare il vetrino coprioggetti con gli embrioni sopra di esso, con il lato dell'embrione rivolto verso l'alto (Figura 2B). Assicurati di utilizzare acqua al posto dello smalto per unghie o di altra colla adesiva per fissare il vetrino coprioggetti al vetrino, poiché questo lato del vetrino coprioggetto verrà posizionato direttamente sopra la lente confocale per l'imaging dal vivo.
7. Essiccare gli embrioni in una camera di essiccazione (Figura 2A-3) (vedi Tabella dei materiali) per 10-15 minuti fino a quando la membrana vitellina non si raggrinzisce (Figura 2E). Il tempo richiesto può variare con l'umidità della stanza e deve essere testato sperimentalmente per ogni condizione di laboratorio.
8. Pipettare 40 μL di olio di alocarburi (una miscela di tipo 27 e tipo 700 in volume 1:1, vedi tabella dei materiali) a un'estremità della striscia embrionale. Inclinare il vetrino fino a quando l'olio di alocarburi copre l'intera superficie degli embrioni.

4. Iniezione di anticorpi e imaging

1. Preparare alcuni aghi di vetro per iniezione utilizzando un estrattore per micropipette (vedere la Tabella dei materiali per le impostazioni dei parametri) e caricare ciascun ago con 5 μL di soluzione anticorpale marcata con AlexaFluor (dal punto 1.6).
2. Posizionare un vetrino coprioggetti da 25 mm x 25 mm sopra un vetrino. Pipettare 40 μL di olio di alocarburi e distribuirlo lungo il bordo del vetrino coprioggetto.
3. Sotto l'endoscopio di iniezione, allineare la punta dell'ago contro il bordo del vetrino coprioggetto sotto l'olio. Regolare la pressione dell'aria di iniezione della picopompa (vedere Tabella dei materiali) in modo che una pompa generi una bolla piena di anticorpi. Il diametro della bolla deve essere limitato a 20-50 μm (Figura 2F).
4. Sostituisci il vetrino vuoto con uno contenente embrioni sott'olio. Allineare perpendicolarmente la punta dell'ago per iniezione contro l'asse antero-posteriore degli embrioni (Figura 2D,G).
5. Controllare lo stadio degli embrioni per assicurarsi che la maggior parte abbia iniziato la cellularizzazione ma non abbia ancora iniziato la gastrulazione (stadio 4 e stadio 5), rimanendo come un sincizio (Figura 2F,G).
   NOTA: Il segno distintivo di questa fase è l'assenza di scanalature o pieghe e la presenza di un sacco vitellino di forma ovale, di colore scuro, visibile al centro dell'embrione. La caratterizzazione morfologica dello stadio embrionale sott'olio si basa sul capitolo del libro "Stages of Drosophila Embryogenesis" di Volker Hartenstein¹⁷.
6. Utilizzare il manipolatore dello stadio X-Y per spostare gli embrioni verso l'ago fino a quando la punta non arriva al centro del tuorlo. Pompare due o tre volte per iniettare gli anticorpi nel tuorlo. Il successo dell'iniezione è indicato dalla rapida scomparsa della ruga della membrana vitellina mentre gli embrioni guadagnano volume dalla soluzione anticorpale (Figura 2G).
7. Utilizzare il manipolatore dello stadio X-Y per allontanare gli embrioni dall'ago dopo l'iniezione e spostarli verso il basso fino all'embrione successivo. Ripetere il passaggio 6 fino a quando tutti gli embrioni sul vetrino non sono stati iniettati.
8. Trasferire il vetrino con gli embrioni iniettati in una camera di umidità (Figura 2A-8). Incubare a 25 °C fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo embrionale desiderato.
9. Sollevare il vetrino coprioggetti da 24 mm x 50 mm dal vetrino e inserirlo direttamente nel supporto per vetrini del microscopio. La parte senza embrioni affronterà gli obiettivi. Individua gli embrioni utilizzando una lente a basso ingrandimento sotto l'illuminazione in campo chiaro e passa a una lente 40x o 63x per l'imaging fluorescente dal vivo ad alta risoluzione.

Risultati

Per dimostrare i vantaggi del metodo di iniezione degli anticorpi rispetto all'imaging dal vivo basato su tag fluorescenti o all'immunofluorescenza, vengono forniti due casi di studio che caratterizzano la localizzazione dinamica di un recettore transmembrana a bassa abbondanza, Notch, e un tipo di modificazione post-traduzionale chiamata fosforilazione della tirosina negli embrioni viventi.

L'attività di segnalazione di Notch svolge un ruolo importante nella determinazione del destino cellul...

Discussione

Questa procedura presentata delinea il metodo specializzato di marcatura a fluorescenza con anticorpi personalizzati e successiva iniezione in embrioni di Drosophila in fase iniziale. Questa tecnica facilita la visualizzazione in tempo reale di proteine o modificazioni post-traduzionali che esistono in piccole quantità e sono in genere difficili da osservare attraverso i metodi convenzionali di marcatura GFP/mCherry.

Occorre prestare attenzione quando si estende questo metodo per eff...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt