Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die maßgeschneiderte antikörperbasierte Fluoreszenzmarkierung und Injektion in frühe Drosophila-Embryonen , um Live-Imaging von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, die mit herkömmlichen GFP/mCherry-Tag-Ansätzen nur schwer zu erkennen sind.

Zusammenfassung

Die Visualisierung von Proteinen in lebenden Zellen mit GFP (Green Fluorescent Protein) und anderen fluoreszierenden Markierungen hat das Verständnis der Lokalisierung, Dynamik und Funktion von Proteinen erheblich verbessert. Im Vergleich zur Immunfluoreszenz spiegelt die Live-Bildgebung die Proteinlokalisierung genauer wider, ohne dass potenzielle Artefakte durch die Gewebefixierung entstehen. Wichtig ist, dass die Live-Bildgebung eine quantitative und zeitliche Charakterisierung von Proteinspiegeln und -lokalisierungen ermöglicht, was für das Verständnis dynamischer biologischer Prozesse wie Zellbewegung oder -teilung entscheidend ist. Eine wesentliche Einschränkung von Fluoreszenz-Markierungsansätzen ist jedoch die Notwendigkeit einer ausreichend hohen Proteinexpression, um eine erfolgreiche Visualisierung zu erreichen. Folglich können viele endogen markierte fluoreszierende Proteine mit relativ geringer Expression nicht nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite kann die ektopische Expression mit viralen Promotoren manchmal zu Proteinfehllokalisationen oder funktionellen Veränderungen in physiologischen Kontexten führen. Um diese Einschränkungen zu adressieren, wird ein Ansatz vorgestellt, der einen hochempfindlichen Antikörper-vermittelten Proteinnachweis in lebenden Embryonen verwendet, der im Wesentlichen Immunfluoreszenz ohne Gewebefixierung durchführt. Als Proof of Principle kann ein endogen GFP-markierter Notch-Rezeptor, der in lebenden Embryonen kaum nachweisbar ist, nach Antikörperinjektion erfolgreich sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus wurde dieser Ansatz angepasst, um posttranslationale Modifikationen (PTMs) in lebenden Embryonen sichtbar zu machen, was die Detektion zeitlicher Veränderungen der Tyrosinphosphorylierungsmuster während der frühen Embryogenese ermöglicht und eine neue Subpopulation von Phosphotyrosin (p-Tyr) unter apikalen Membranen aufdeckt. Dieser Ansatz kann modifiziert werden, um andere proteinspezifische, tagspezifische oder PTM-spezifische Antikörper aufzunehmen, und sollte mit anderen injektionsfähigen Modellorganismen oder Zelllinien kompatibel sein. Dieses Protokoll eröffnet neue Möglichkeiten für die Live-Bildgebung von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder PTMs, die bisher mit herkömmlichen Fluoreszenz-Markierungsmethoden nur schwer zu erkennen waren.

Einleitung

Die Immunfluoreszenz ist eine Grundtechnik der modernen Zellbiologie, die ursprünglich von Albert Coons entwickelt wurde und die Detektion von Molekülen in ihren nativen zellulären Kompartimenten und die Charakterisierung der molekularen Zusammensetzung von subzellulären Organellen oder Maschinen ermöglicht¹. In Verbindung mit genetischen Manipulationen trägt die Immunfluoreszenz dazu bei, das heute allgemein akzeptierte Konzept zu etablieren, dass die Lokalisierung von Proteinen für ihre Funktion unerlässlich ist². Abgesehen von spezifischen Primärantikörpern und hellen Fluoreszenzfarbstoffen beruht der Erfolg dieser Technik auf einem vorläufigen Prozess namens Fixierung und Permeabilisierung, der zelluläre Morphologien bewahrt, Antigene immobilisiert und die Zugänglichkeit von Antikörpern in intrazelluläre Kompartimente erhöht. Der Fixierungs- und Permeabilisierungsprozess würde unweigerlich Zellen abtöten und alle biologischen Prozesse beenden³. Daher liefert die Immunfluoreszenz nur Momentaufnahmen des Lebenswegs von Proteinen. Viele biologische Prozesse, wie z.B. Zellmigration und Zellteilungen, sind jedoch dynamischer Natur und erfordern eine räumlich-zeitlich aufgelöste Untersuchung des Verhaltens von Proteinen ^4,5.

Um die Proteindynamik in lebenden Organismen zu untersuchen, wurden Live-Imaging-Methoden entwickelt, die auf genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen wie dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)⁶ basieren, und konfokale Hochgeschwindigkeitsmikroskope. Kurz gesagt, das interessierende Protein kann genetisch so manipuliert werden, dass es mit GFP⁷ fusioniert wird, und dann ektopisch aus viralen oder Hefepromotoren wie dem Cytomegalievirus (CMV)⁸ oder der Upstream-Aktivierungssequenz (UAS)⁹ exprimiert werden. Da GFP von Natur aus autofluoreszierend ist, sind keine Fluorophor-gekoppelten Antikörper erforderlich, um die Lokalisierung von Zielproteinen aufzudecken, wodurch die Notwendigkeit vorbereitender Prozesse der Fixierung oder Permeabilisierung umgangen wird. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden fluoreszierende Markierungen entwickelt, die das gesamte Wellenlängenspektrum abdecken¹⁰ und eine mehrfarbige Live-Bildgebung mehrerer Zielproteine gleichzeitig ermöglichen. Im Vergleich zu chemisch hergestellten Fluoreszenzfarbstoffen wie AlexaFluor oder ATTO ist die Autofluoreszenz dieser genetisch kodierten fluoreszierenden Proteine jedoch relativ schwach und instabil, wenn sie von endogenen Promotoren exprimiert werden, insbesondere während der Live-Bildgebung über längere Zeitskalen¹⁰. Während dieses Defizit durch die Überexpression fluoreszenzmarkierter Zielproteine gemildert werden kann, stören viele mit enzymatischen Aktivitäten wie Kinasen und Phosphatasen normale biologische Prozesse erheblich, wenn sie nicht auf physiologischem Niveau exprimiert werden.

Dieses Protokoll stellt eine Methode dar, die eine photostabile antikörperbasierte Zielbeleuchtung in einem Live-Bildaufbau ermöglicht, die im Wesentlichen Immunfluoreszenz ohne den Prozess der Fixierung oder Permeabilisierung ermöglicht (Abbildung 1). Durch eine einfache NHS-basierte primäre Aminreaktion¹¹ kann man Fluoreszenzfarbstoffe wie AlexaFluor 488 oder 594 mit im Wesentlichen jedem primären Antikörper oder GFP/HA/Myc-Nanobody¹² konjugieren. Unter Ausnutzung eines Entwicklungsmerkmals, dass alle embryonalen Zellen von Drosophila während des Synzytiumstadiums¹³ ein gemeinsames Zytoplasma teilen, kann man nach der Injektion von farbstoffkonjugierten Antikörpern eine Antigenbindung und Beleuchtung über ganze Embryonen erreichen. Mit der Erweiterung von Bibliotheken endogen markierter Proteine, die in Drosophila und anderen Modellsystemen verfügbar sind¹⁴, kann diese Methode die Anwendungen dieser Bibliotheken möglicherweise erweitern, indem sie die Dynamik von fluoreszenzmarkierten Proteinen mit geringer Häufigkeit und anderen nicht-fluoreszenzmarkierten Proteinen (HA/Myc-markierten) Proteinen in lebenden Geweben aufdeckt.

Protokoll

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Genehmigungen der School of Life Sciences der SUSTech University durchgeführt. Der verwendete Organismus ist Drosophila melanogaster, und die Genotypen sind Notch-Knockin-GFP (Chromosom X) und Sqh-sqh-GFP (Chromosom II), die großzügigerweise von den Labors von Dr. François Schweisguth (Institut Pasteur) bzw. Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute) zur Verfügung gestellt wurden. Während sich dieses Protokoll hauptsächlich auf Aspekte der Antikörpermarkierung und der Lebendbildgebung konzentriert, finden Sie in den veröffentlichten Berichten detailliertere Beschreibungen der Entnahme und Injektion von Drosophila-Embryonen ^15,16.

1. Fluoreszenzmarkierung von Antikörpern

1. Vorzugsweise verwenden Sie monoklonale Antikörper oder Nanobodies für das interessierende Protein. Bereiten Sie die Stammkonzentration der Antikörper auf 1 mg/ml oder höher vor.
   ANMERKUNG: In dieser Studie wird GFP-Nanobody (siehe Materialtabelle) als Beispiel verwendet. Der kommerziell erhältliche GFP-Nanobody ist in einer Konzentration von 1,0 mg/ml und einem Volumen von 250 μl verpackt. Zusätzlich wird ein kommerziell erhältliches Antikörper-Markierungskit (siehe Materialtabelle) verwendet, das Alexa Fluor 594 durch eine Succinimidylester-Reaktion¹¹ an primäre Amine von Proteinen konjugiert. Wichtig ist, dass dieser Markierungsprozess die Antikörperkonzentration nicht signifikant verändert.
2. Bereiten Sie eine 1 M Natriumbicarbonatlösung vor, indem Sie Komponente B (im Antikörpermarkierungskit enthalten) in 1 ml deionisiertem Wasser resuspendieren.
3. Stellen Sie die Antikörperkonzentration auf 1,0 mg/ml ein und fügen Sie dann 1/10^des Volumens (10 μl für 100 μl GFP-Nanobody) der 1 M Natriumbicarbonatlösung hinzu.
4. Geben Sie 110 μl der Antikörpermischung (aus Schritt 1.3) direkt in das Röhrchen mit dem Farbstoff Alexa Fluor 594. Zum Mischen umkehren (nicht wirbeln) und 1 h bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubieren.
5. Stellen Sie die Reinigungssäule aus dem Konjugationskit zusammen (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie ein 1,5-ml-Harzbett vor (im Antikörpermarkierungskit enthalten) und zentrifugieren Sie die Säule bei 1100 x g 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT), um überschüssige Flüssigkeit aus dem Harz zu entfernen.
6. Die Reaktionsmischung (aus Schritt 1.4) wird tropfenweise auf die Oberseite der Harzsäule gegeben und bei 1100 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert, um den markierten Antikörper zu sammeln. Der gesammelte Antikörper sollte rosa erscheinen und das Volumen sollte etwas weniger als 100 μl betragen. In Folie eingewickelten oder dunklen Röhrchen bei 4 °C lagern.

2. Vorbereitung von Drosophila-Embryonen

1. Setzen Sie 200 frisch geschlüpfte erwachsene Drosophila in einen zylinderförmigen Kunststoffkäfig (Durchmesser = 5 cm, Höhe = 8 cm) mit einem Männchen-Weibchen-Verhältnis von 1:10. Versiegeln Sie eine Seite mit einem porösen Metallgitter zur Belüftung und die andere Seite mit einer Fruchtsaft-/Hefepasten-Agarplatte.
2. Wechseln Sie die Platte alle 12 Stunden für drei Tage vor der Embryonenentnahme. Dies ermöglicht die Synchronisierung der Drosophila-Eiablage und verbessert die Entnahmeeffizienz.
3. Am Tag der Injektion wird der Käfig gegen eine Fruchtsaftplatte mit minimaler Hefepaste ausgetauscht und die Embryonen werden 1 h lang bei 25 °C gesammelt. Wenn die erste Entnahmerunde nicht genügend Embryonen (<50 Embryonen) ergibt, verwerfen Sie die erste Platte und wiederholen Sie diesen Schritt für eine zweite Entnahmerunde, bis innerhalb von 1 Stunde mehr als 100 Embryonen gelegt sind.
4. Nehmen Sie die Platte aus dem Käfig, um die Eiablage zu stoppen, und inkubieren Sie weitere 2 Stunden bei 25 °C, um Embryonen zu erhalten, die 2-3 Stunden alt sind. Das richtige Stadium der Embryonen ist entscheidend für den Erfolg der Antikörperinjektion.
5. Um die Eierschale der Embryonen zu entfernen, geben Sie 2 ml 50%iges Bleichmittel auf die Fruchtsaftplatte und lösen Sie die Embryonen vorsichtig mit einem Pinsel von der Platte (Abbildung 2A-4). Oft werden die Embryonen direkt auf die Hefepaste gelegt. In diesem Fall ist es akzeptabel, die Hefepaste in die Bleichlösung zu streichen, um alle Embryonen zu sammeln.
6. Die schwimmenden Embryonen werden 2 Minuten lang in 50%igem Bleichmittel inkubiert und die Fruchtsaftplatte alle 30 Sekunden geschwenkt, um die Effizienz der Eierschalenentfernung zu verbessern.
7. Übertragen Sie die Mischung aus Embryo und Bleichmittel, indem Sie sie in ein 70-μm-Nylonzellsieb gießen (Abbildung 2A-7). Waschen Sie die Embryonen gründlich mit einer Wasserflasche, um alle Rückstände von Bleichmittel und Hefepaste zu entfernen. Trocknen Sie das Zellsieb vollständig mit Papiertüchern ab und stellen Sie sicher, dass überschüssiges Wasser um die Embryonen herum entfernt wird.

3. Ausrichtung und Austrocknung des Embryos

1. Bereiten Sie ein 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (Breite, Länge, Höhe) 4%iges Agarose-Gel vor (Abbildung 2A-9) und lassen Sie das Gel auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie einen 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (Breite, Länge, Höhe) Agaroseblock mit einer sauberen Rasierklinge aus und legen Sie den Block auf einen Objektträger (Abbildung 2A-2). Untersuchen Sie den Gelblock unter dem Präpariergerät, um sicherzustellen, dass die Kanten gerade geschnitten sind und die Oberfläche flach und trocken ist.
2. Übertragen Sie die Embryonen mit einem Pinsel aus dem Sieb auf den Gelblock. Verteilen Sie die Embryonen gleichmäßig entlang der Mittellinie des Blocks, indem Sie sie vorsichtig bürsten. Im Idealfall werden Embryonengruppen in einzelne Embryonen oder Dubletten getrennt, ohne sich zu berühren.
3. Bereiten Sie eine Pinzette mit zwei Beinen vor, die fest zusammengeklebt sind, um eine einzige feine Spitze zu erhalten (Abbildung 2A-5). Nehmen Sie unter einem Sezierfernrohr einzelne Embryonen mit der Pinzette auf und legen Sie sie entlang der langen Kante des Gelblocks. Richten Sie 20-30 Embryonen aus und achten Sie darauf, dass ihre vordere und hintere Achse parallel zum Rand verläuft (Abbildung 2C).
4. Pipettieren Sie 10 μl Heptankleber (siehe Materialtabelle) in die Mitte eines Deckglases von 24 mm x 50 mm (Abbildung 2A-1) und verteilen Sie den Klebstoff mit einer Pipettenspitze in einer rechteckigen Fläche von 0,5 cm x 3 cm. Warten Sie, bis der Kleber vollständig getrocknet ist, bevor Sie ihn verwenden.
5. Platzieren Sie den Objektträger mit dem Gelblock an der Kante des Schreibtisches, so dass die Embryonen nach außen zeigen. Heben Sie das Deckglas mit Klebstoff mit einer Pinzette mit flacher Spitze (Abbildung 2A-6) an und halten Sie es ruhig auf den Embryonen, wobei die Klebstoffseite in einem geneigten Winkel von etwa 45 Grad zu den Embryonen zeigt.
   HINWEIS: Drücken Sie das Deckglas vorsichtig gegen den Gelblock, so dass die Embryonen mit dem Kleber in Berührung kommen, und lassen Sie dann schnell den Druck los und heben Sie das Deckglas an. Die Höhe der Spannung ist entscheidend, damit die Embryonen stabil mit dem Klebstoff verbunden werden können, ohne zu stark gedrückt zu werden und zu platzen.
6. Pipettieren Sie 10 μl Wasser in die Mitte eines neuen Objektträgers und legen Sie das Deckglas mit den Embryonen darauf, wobei die Seite des Embryos nach oben zeigt (Abbildung 2B). Stellen Sie sicher, dass Sie Wasser anstelle von Nagellack oder anderem Klebstoff verwenden, um das Deckglas auf dem Objektträger zu befestigen, da diese Seite des Deckglases für Live-Aufnahmen direkt auf die konfokale Linse gelegt wird.
7. Trocknen Sie die Embryonen in einer Austrocknungskammer (Abbildung 2A-3) (siehe Materialtabelle) für 10-15 Minuten, bis sich die Vitellinmembran faltet (Abbildung 2E). Die erforderliche Zeit kann mit der Luftfeuchtigkeit des Raumes variieren und sollte für jede Laborbedingung experimentell getestet werden.
8. Pipettieren Sie 40 μl Halogenkohlenstofföl (eine Mischung aus Typ 27 und Typ 700 in einem Volumenverhältnis von 1:1, siehe Materialtabelle) an einem Ende des Embryostreifens. Kippen Sie den Objektträger, bis das Halogenkohlenstofföl die gesamte Oberfläche der Embryonen bedeckt.

4. Antikörper-Injektion und Bildgebung

1. Bereiten Sie einige Injektionsglasnadeln mit einem Mikropipettenzieher vor (siehe Materialtabelle für Parametereinstellungen) und beladen Sie jede Nadel mit 5 μl AlexaFluor-markierter Antikörperlösung (aus Schritt 1.6).
2. Legen Sie ein Deckglas von 25 mm x 25 mm auf einen Objektträger. Pipettieren Sie 40 μl Halogenkohlenstofföl und verteilen Sie es entlang des Randes des Deckglases.
3. Richten Sie unter dem Injektionsfernrohr die Spitze der Nadel an der Kante des Deckglases unter Öl aus. Stellen Sie den Einspritzluftdruck der Picopumpe ein (siehe Materialtabelle), so dass eine Pumpe eine mit Antikörpern gefüllte Blase erzeugt. Der Blasendurchmesser sollte auf 20-50 μm begrenzt werden (Abbildung 2F).
4. Ersetzen Sie den leeren Objektträger durch einen Objektträger mit Embryonen unter Öl. Richten Sie die Spitze der Injektionsnadel senkrecht zur vorderen und hinteren Achse der Embryonen aus (Abbildung 2D,G).
5. Überprüfen Sie das Stadium der Embryonen, um sicherzustellen, dass die meisten Embryonen mit der Zellularisierung begonnen haben, aber noch nicht mit der Gastrulation begonnen haben (Stadium 4 und Stadium 5) und als Synzytium verbleiben (Abbildung 2F,G).
   HINWEIS: Das Kennzeichen dieses Stadiums ist das Fehlen von Rillen oder Falten und das Vorhandensein eines ovalen, dunkel gefärbten Dottersacks, der in der Mitte des Embryos sichtbar ist. Die morphologische Charakterisierung des Embryostadiums unter Öl basiert auf dem Buchkapitel "Stadien der Embryogenese von Drosophila" von Volker Hartenstein¹⁷.
6. Verwenden Sie den X-Y-Stufe-Manipulator, um die Embryonen in Richtung der Nadel zu bewegen, bis die Spitze in der Mitte des Dotters ankommt. Pumpen Sie zwei- bis dreimal, um Antikörper in das Eigelb zu injizieren. Eine erfolgreiche Injektion wird durch das schnelle Verschwinden der Vitellinmembranfalte angezeigt, da die Embryonen durch die Antikörperlösung an Volumen gewinnen (Abbildung 2G).
7. Verwenden Sie den Manipulator der X-Y-Stufe, um die Embryonen nach der Injektion von der Nadel wegzubewegen und nach unten zum nächsten Embryo zu bewegen. Wiederholen Sie Schritt 6, bis alle Embryonen auf dem Objektträger injiziert sind.
8. Übertragen Sie den Objektträger mit den injizierten Embryonen in eine Feuchtigkeitskammer (Abbildung 2A-8). Bei 25 °C inkubieren, bis das gewünschte Stadium der Embryonalentwicklung erreicht ist.
9. Heben Sie das 24 mm x 50 mm große Deckglas vom Objektträger ab und legen Sie es direkt in den Objektträgerhalter des Mikroskops. Die Seite ohne Embryonen wird sich den Zielen stellen. Lokalisieren Sie die Embryonen mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung unter Hellfeldbeleuchtung und wechseln Sie zu einem 40-fachen oder 63-fachen Objektiv für hochauflösende fluoreszierende Live-Aufnahmen.

Ergebnisse

Um die Vorteile der Antikörper-Injektionsmethode gegenüber der Fluoreszenz-Tag-basierten Live-Bildgebung oder Immunfluoreszenz zu demonstrieren, werden zwei Fallstudien vorgestellt, die die dynamische Lokalisierung eines Transmembranrezeptors mit geringer Häufigkeit, Notch, und eine Art posttranslationaler Modifikation, die als Tyrosinphosphorylierung bezeichnet wird, in lebenden Embryonen charakterisieren.

Die Notch-Signalaktivität spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung des Zellsch...

Diskussion

Dieses vorgestellte Verfahren beschreibt die spezielle Methode der Fluoreszenzmarkierung mit maßgeschneiderten Antikörpern und der anschließenden Injektion in Drosophila-Embryonen im Frühstadium. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung von Proteinen oder posttranslationalen Modifikationen, die in geringen Mengen vorliegen und mit herkömmlichen GFP/mCherry-Markierungsmethoden typischerweise nur schwer zu beobachten sind.

Vorsicht ist geboten, wenn diese Methode erwei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt