Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents

Résumé

Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.

Résumé

La visualisation des protéines dans les cellules vivantes à l’aide de la GFP (Green Fluorescent Protein) et d’autres marqueurs fluorescents a considérablement amélioré la compréhension de la localisation, de la dynamique et de la fonction des protéines. Par rapport à l’immunofluorescence, l’imagerie en direct reflète plus précisément la localisation des protéines sans artefacts potentiels résultant de la fixation tissulaire. Il est important de noter que l’imagerie en direct permet une caractérisation quantitative et temporelle des niveaux et de la localisation des protéines, ce qui est crucial pour comprendre les processus biologiques dynamiques tels que le mouvement ou la division cellulaire. Cependant, une limitation majeure des approches de marquage fluorescent est la nécessité d’avoir des niveaux d’expression protéique suffisamment élevés pour obtenir une visualisation réussie. Par conséquent, de nombreuses protéines fluorescentes marquées de manière endogène avec des niveaux d’expression relativement faibles ne peuvent pas être détectées. D’autre part, l’expression ectopique à l’aide de promoteurs viraux peut parfois conduire à une mauvaise localisation des protéines ou à des altérations fonctionnelles dans des contextes physiologiques. Pour remédier à ces limitations, une approche est présentée qui utilise la détection de protéines médiées par des anticorps hautement sensibles dans des embryons vivants, effectuant essentiellement une immunofluorescence sans avoir besoin de fixation tissulaire. Comme preuve de principe, le récepteur Notch marqué à la GFP de manière endogène, qui est à peine détectable dans les embryons vivants, peut être visualisé avec succès après l’injection d’anticorps. De plus, cette approche a été adaptée pour visualiser les modifications post-traductionnelles (PTM) dans les embryons vivants, permettant de détecter les changements temporels dans les schémas de phosphorylation de la tyrosine au cours de l’embryogenèse précoce et révélant une nouvelle sous-population de phosphotyrosine (p-Tyr) sous les membranes apicales. Cette approche peut être modifiée pour s’adapter à d’autres anticorps spécifiques à une protéine, à un marqueur ou à un PTM et devrait être compatible avec d’autres organismes modèles ou lignées cellulaires susceptibles d’être injectés. Ce protocole ouvre de nouvelles possibilités pour l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou PTM qui étaient auparavant difficiles à détecter à l’aide des méthodes traditionnelles de marquage par fluorescence.

Introduction

L’immunofluorescence est une technique fondamentale de la biologie cellulaire moderne développée à l’origine par Albert Coons, qui permet de détecter des molécules dans leurs compartiments cellulaires natifs et de caractériser les compositions moléculaires d’organites ou de machineries subcellulaires¹. Couplée à des manipulations génétiques, l’immunofluorescence permet d’établir le concept désormais bien accepté selon lequel la localisation des protéines est essentielle à leur fonction². Outre les anticorps primaires spécifiques et les colorants fluorescents brillants, le succès de cette technique repose sur un processus....

Protocole

Les expériences ont été menées conformément aux directives et à l’approbation de l’École des sciences de la vie de l’Université SUSTech. L’organisme utilisé est Drosophila melanogaster, et les génotypes sont Notch-Knockin-GFP (chromosome X) et Sqh-sqh-GFP (chromosome II), généreusement fournis par les laboratoires du Dr François Schweisguth (Institut Pasteur) et du Dr Jennifer Zallen (Institut Sloan Kettering), respectivement. Bien que ce protocole se concentre principalement sur les aspects du marquage des anticorps et de l’imagerie en direct, veuillez vous référer aux rapports publiés pour des descriptions plus détaillées de la collecte et de l’injection d’....

Discussion

Cette procédure présente la méthode spécialisée de marquage par fluorescence avec des anticorps personnalisés et l’injection subséquente dans des embryons de drosophile à un stade précoce. Cette technique facilite la visualisation en temps réel des protéines ou des modifications post-traductionnelles qui existent en faibles quantités et qui sont généralement difficiles à observer par les méthodes conventionnelles de marquage GFP/mCherry.

Il faut faire preuve de prude.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt