Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents

Résumé

Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.

Résumé

La visualisation des protéines dans les cellules vivantes à l’aide de la GFP (Green Fluorescent Protein) et d’autres marqueurs fluorescents a considérablement amélioré la compréhension de la localisation, de la dynamique et de la fonction des protéines. Par rapport à l’immunofluorescence, l’imagerie en direct reflète plus précisément la localisation des protéines sans artefacts potentiels résultant de la fixation tissulaire. Il est important de noter que l’imagerie en direct permet une caractérisation quantitative et temporelle des niveaux et de la localisation des protéines, ce qui est crucial pour comprendre les processus biologiques dynamiques tels que le mouvement ou la division cellulaire. Cependant, une limitation majeure des approches de marquage fluorescent est la nécessité d’avoir des niveaux d’expression protéique suffisamment élevés pour obtenir une visualisation réussie. Par conséquent, de nombreuses protéines fluorescentes marquées de manière endogène avec des niveaux d’expression relativement faibles ne peuvent pas être détectées. D’autre part, l’expression ectopique à l’aide de promoteurs viraux peut parfois conduire à une mauvaise localisation des protéines ou à des altérations fonctionnelles dans des contextes physiologiques. Pour remédier à ces limitations, une approche est présentée qui utilise la détection de protéines médiées par des anticorps hautement sensibles dans des embryons vivants, effectuant essentiellement une immunofluorescence sans avoir besoin de fixation tissulaire. Comme preuve de principe, le récepteur Notch marqué à la GFP de manière endogène, qui est à peine détectable dans les embryons vivants, peut être visualisé avec succès après l’injection d’anticorps. De plus, cette approche a été adaptée pour visualiser les modifications post-traductionnelles (PTM) dans les embryons vivants, permettant de détecter les changements temporels dans les schémas de phosphorylation de la tyrosine au cours de l’embryogenèse précoce et révélant une nouvelle sous-population de phosphotyrosine (p-Tyr) sous les membranes apicales. Cette approche peut être modifiée pour s’adapter à d’autres anticorps spécifiques à une protéine, à un marqueur ou à un PTM et devrait être compatible avec d’autres organismes modèles ou lignées cellulaires susceptibles d’être injectés. Ce protocole ouvre de nouvelles possibilités pour l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou PTM qui étaient auparavant difficiles à détecter à l’aide des méthodes traditionnelles de marquage par fluorescence.

Introduction

L’immunofluorescence est une technique fondamentale de la biologie cellulaire moderne développée à l’origine par Albert Coons, qui permet de détecter des molécules dans leurs compartiments cellulaires natifs et de caractériser les compositions moléculaires d’organites ou de machineries subcellulaires¹. Couplée à des manipulations génétiques, l’immunofluorescence permet d’établir le concept désormais bien accepté selon lequel la localisation des protéines est essentielle à leur fonction². Outre les anticorps primaires spécifiques et les colorants fluorescents brillants, le succès de cette technique repose sur un processus préliminaire appelé fixation et perméabilisation, qui préserve les morphologies cellulaires, immobilise les antigènes et augmente l’accessibilité des anticorps dans les compartiments intracellulaires. Inévitablement, le processus de fixation et de perméabilisation tuerait les cellules et mettrait fin à tous les processus biologiques³. Par conséquent, l’immunofluorescence ne fournit que des instantanés du parcours de vie des protéines. Cependant, de nombreux processus biologiques tels que la migration et les divisions cellulaires sont de nature dynamique, ce qui nécessite l’étude des comportements des protéines d’une manière spatio-temporellement résolue ^4,5.

Pour étudier la dynamique des protéines dans les organismes vivants, des méthodes d’imagerie en direct basées sur des protéines fluorescentes génétiquement codées telles que la protéine fluorescente verte (GFP)⁶ et des microscopes confocaux à grande vitesse ont été développées. En bref, la protéine d’intérêt peut être manipulée génétiquement pour être fusionnée avec la GFP⁷, puis exprimée de manière ectopique à partir de promoteurs viraux ou de levure tels que le cytomégalovirus (CMV)⁸ ou la séquence d’activation en amont (UAS)⁹. Étant donné que la GFP est de nature autofluorescente, aucun anticorps couplé à des fluorophores n’est nécessaire pour révéler la localisation des protéines cibles, ce qui contourne la nécessité de processus préliminaires de fixation ou de perméabilisation. Au cours des deux dernières décennies, des marqueurs fluorescents couvrant l’ensemble du spectre des longueurs d’onde ont été^{développés10}, permettant l’imagerie en direct multicolore de plusieurs protéines cibles en même temps. Cependant, par rapport aux colorants fluorescents chimiquement modifiés tels que AlexaFluor ou ATTO, l’autofluorescence de ces protéines fluorescentes génétiquement codées est relativement faible et instable lorsqu’elle est exprimée à partir de promoteurs endogènes, en particulier lors de l’imagerie en direct sur des échelles de temps plus longues¹⁰. Bien que ce déficit puisse être atténué par une surexpression des protéines cibles marquées par fluorescence, beaucoup d’entre elles ayant des activités enzymatiques telles que les kinases et les phosphatases perturbent gravement les processus biologiques normaux si elles ne sont pas exprimées à des niveaux physiologiques.

Ce protocole présente une méthode qui permet l’illumination de la cible photostable à base d’anticorps dans une configuration d’image en direct, permettant essentiellement l’immunofluorescence sans processus de fixation ou de perméabilisation (Figure 1). Grâce à une simple réaction d’amine primaire basée sur le NHS¹¹, on peut conjuguer des colorants fluorescents tels que AlexaFluor 488 ou 594 avec essentiellement n’importe quel anticorps primaire ou GFP/HA/Myc nanobody¹². En tirant parti d’une caractéristique de développement selon laquelle toutes les cellules embryonnaires de la drosophile partagent un cytoplasme commun au stade¹³ du syncytium, il est possible d’obtenir une liaison à l’antigène et une illumination sur des embryons entiers après l’injection d’anticorps conjugués à un colorant. Avec l’expansion des bibliothèques de protéines marquées de manière endogène disponibles chez la drosophile et d’autres systèmes modèles¹⁴, cette méthode peut potentiellement élargir les applications de ces bibliothèques en révélant la dynamique des protéines marquées par fluorescence de faible abondance et d’autres protéines non marquées par fluorescence (marquées HA/Myc) dans les tissus vivants.

Protocole

Les expériences ont été menées conformément aux directives et à l’approbation de l’École des sciences de la vie de l’Université SUSTech. L’organisme utilisé est Drosophila melanogaster, et les génotypes sont Notch-Knockin-GFP (chromosome X) et Sqh-sqh-GFP (chromosome II), généreusement fournis par les laboratoires du Dr François Schweisguth (Institut Pasteur) et du Dr Jennifer Zallen (Institut Sloan Kettering), respectivement. Bien que ce protocole se concentre principalement sur les aspects du marquage des anticorps et de l’imagerie en direct, veuillez vous référer aux rapports publiés pour des descriptions plus détaillées de la collecte et de l’injection d’embryons de drosophile ^15,16.

1. Marquage fluorescent des anticorps

1. De préférence, utilisez des anticorps monoclonaux ou des nanocorps pour la protéine d’intérêt. Préparer la concentration mère d’anticorps à 1 mg/mL ou plus.
   NOTA : Dans cette étude, le nanocorps GFP (voir le tableau des matériaux) est utilisé à titre d’exemple. Le nanocorps GFP disponible dans le commerce est conditionné à une concentration de 1,0 mg/mL et à un volume de 250 μL. De plus, un kit de marquage d’anticorps disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) est utilisé, qui conjugue Alexa Fluor 594 aux amines primaires des protéines par une réaction d’ester de succinimidyle¹¹. Il est important de noter que ce processus de marquage ne modifie pas de manière significative la concentration d’anticorps.
2. Préparez une solution de bicarbonate de sodium de 1 M en remettant en suspension le composant B (fourni dans la trousse d’étiquetage des anticorps) dans 1 mL d’eau déminéralisée.
3. Ajustez la concentration d’anticorps à 1,0 mg/mL, puis ajoutez 1/10^ème volume (10 μL pour 100 μL de nanocorps GFP) de la solution de bicarbonate de sodium 1 M.
4. Ajouter 110 μL du mélange d’anticorps (à partir de l’étape 1.3) directement dans le tube contenant le colorant Alexa Fluor 594. Retourner pour mélanger (ne pas vortex) et incuber sur un rotateur pendant 1 h à température ambiante.
5. Assemblez la colonne de purification à partir du kit de conjugaison (voir Tableau des matériaux). Préparez un lit de résine de 1,5 mL (fourni dans la trousse d’étiquetage des anticorps) et centrifugez la colonne à 1100 x g pendant 3 min à température ambiante (RT) pour éliminer l’excès de liquide de la résine.
6. Ajouter le mélange réactionnel (à partir de l’étape 1.4) goutte à goutte vers le haut de la colonne de résine et centrifuger à 1100 x g pendant 5 min à 4 °C pour recueillir l’anticorps marqué. L’anticorps prélevé doit être de couleur rose et le volume doit être légèrement inférieur à 100 μL. Conserver dans des tubes enveloppés dans du papier d’aluminium ou de couleur foncée à 4 °C.

2. Préparation des embryons de drosophile

1. Placez 200 drosophiles adultes nouvellement écloses dans une cage en plastique en forme de cylindre (diamètre = 5 cm, hauteur = 8 cm) avec un rapport mâle/femelle de 1 : 10. Scellez un côté avec un treillis métallique poreux pour la ventilation et l’autre côté avec une plaque de gélose à base de jus de fruits/pâte de levure.
2. Changez la plaque toutes les 12 h pendant trois jours avant le prélèvement d’embryons. Cela permet de synchroniser la ponte des œufs de la drosophile et d’améliorer l’efficacité de la collecte.
3. Le jour de l’injection, remplacer la cage par une assiette de jus de fruits avec un minimum de pâte de levure et prélever les embryons à 25 °C pendant 1 h. Si le premier cycle de collecte ne donne pas suffisamment d’embryons (<50 embryons), jetez la première plaque et répétez cette étape pour un deuxième cycle de collecte jusqu’à ce que plus de 100 embryons soient pondus en 1 h.
4. Retirez la plaque de la cage pour arrêter la ponte et incubez à 25 °C pendant encore 2 h pour obtenir des embryons âgés de 2 à 3 h. Le bon stade des embryons est essentiel pour le succès de l’injection d’anticorps.
5. Pour enlever la coquille d’œuf des embryons, ajouter 2 mL d’eau de Javel à 50 % dans l’assiette de jus de fruits et déloger délicatement les embryons de l’assiette à l’aide d’un pinceau (figure 2A-4). Souvent, les embryons seront déposés directement sur la pâte de levure. Dans ce cas, il est acceptable de badigeonner la pâte de levure dans la solution d’eau de Javel pour recueillir tous les embryons.
6. Incubez les embryons flottants dans de l’eau de Javel à 50 % pendant 2 min et faites tourner l’assiette de jus de fruits toutes les 30 s pour améliorer l’efficacité de l’élimination de la coquille d’œuf.
7. Transférez le mélange embryon/eau de Javel en le versant dans une crépine en nylon de 70 μm (figure 2A-7). Lavez soigneusement les embryons à l’aide d’une bouteille d’eau pour éliminer tout résidu d’eau de Javel et de pâte de levure. Séchez complètement la crépine cellulaire avec des serviettes en papier, en veillant à ce que tout excès d’eau autour des embryons soit éliminé.

3. Alignement et dessiccation de l’embryon

1. Préparez un gel d’agarose à 4 % de 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (largeur, longueur, hauteur) (figure 2A-9) et laissez-le refroidir à température ambiante. Coupez un bloc d’agarose de 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (largeur, longueur, hauteur) à l’aide d’une lame de rasoir propre et placez-le sur une lame de verre (figure 2A-2). Examinez le bloc de gel sous la lunette de dissection pour vous assurer que les bords sont coupés droits et que la surface est plane et sèche.
2. Transférez les embryons de la passoire sur le bloc de gel à l’aide d’un pinceau. Répartissez les embryons uniformément le long de la ligne médiane du bloc en brossant doucement. Idéalement, les grappes d’embryons sont séparées en embryons simples ou en doublets sans se toucher.
3. Préparez une pince à épiler avec deux pattes collées l’une à l’autre pour créer une seule pointe fine (figure 2A-5). Sous une lunette de dissection, prélevez des embryons individuels à l’aide de la pince à épiler et placez-les le long du bord long du bloc de gel. Alignez 20 à 30 embryons en vous assurant que leur axe antéro-postérieur est parallèle au bord (figure 2C).
4. Pipeter 10 μL de colle heptane (voir Tableau des matériaux) au centre d’une lamelle de 24 mm x 50 mm (figure 2A-1) et étaler la colle dans une zone rectangulaire de 0,5 cm x 3 cm à l’aide d’une pointe de pipette. Attendez que la colle sèche complètement avant de l’utiliser.
5. Placez la lame de verre avec le bloc de gel sur le bord du bureau, avec les embryons tournés vers l’extérieur. Soulevez la lamelle avec de la colle à l’aide d’une pince à épiler plate (Figure 2A-6) et maintenez-la immobile sur les embryons, le côté de la colle étant orienté vers les embryons à un angle incliné d’environ 45 degrés.
   REMARQUE : Appuyez doucement la lamelle contre le bloc de gel afin que les embryons soient en contact avec la colle, puis relâchez rapidement la pression et soulevez la lamelle. La quantité de tension appliquée est essentielle pour que les embryons puissent être fixés de manière stable à la colle sans être pressés trop fort et éclater.
6. Pipeter 10 μL d’eau au centre d’une nouvelle lame de verre et placer la lamelle avec les embryons dessus, avec le côté de l’embryon vers le haut (Figure 2B). Assurez-vous d’utiliser de l’eau au lieu du vernis à ongles ou d’une autre colle adhésive pour fixer la lamelle à la lame de verre, car ce côté de la lamelle sera placé directement sur le dessus de la lentille confocale pour l’imagerie en direct.
7. Séchez les embryons dans une chambre de dessiccation (figure 2A-3) (voir tableau des matériaux) pendant 10 à 15 minutes jusqu’à ce que la membrane vitelline se froisse (figure 2E). Le temps requis peut varier en fonction de l’humidité de la pièce et doit être testé expérimentalement pour chaque condition de laboratoire.
8. Pipeter 40 μL d’huile halocarbonée (un mélange de type 27 et de type 700 dans un rapport de volume de 1 :1, voir le tableau des matériaux) à une extrémité de la bandelette embryonnaire. Inclinez la lame jusqu’à ce que l’huile halocarbonée recouvre toute la surface des embryons.

4. Injection d’anticorps et imagerie

1. Préparez quelques aiguilles de verre d’injection à l’aide d’un extracteur de micropipette (voir le tableau des matériaux pour les paramètres) et chargez chaque aiguille avec 5 μL de solution d’anticorps marquée à AlexaFluor (à partir de l’étape 1.6).
2. Placez une lamelle de 25 mm x 25 mm sur le dessus d’une lame de verre. Pipeter 40 μL d’huile halocarbonée et l’étaler le long du bord de la lamelle.
3. Sous l’endoscope d’injection, alignez la pointe de l’aiguille contre le bord de la lamelle sous l’huile. Ajustez la pression d’air d’injection de la picopompe (voir Tableau des matériaux) de manière à ce qu’une pompe génère une bulle remplie d’anticorps. Le diamètre de la bulle doit être limité à 20-50 μm (Figure 2F).
4. Remplacez la lame de verre vide par une lame contenant des embryons sous huile. Alignez la pointe de l’aiguille d’injection perpendiculairement à l’axe antéro-postérieur des embryons (Figure 2D,G).
5. Vérifier le stade des embryons pour s’assurer que la plupart ont commencé la cellularisation mais n’ont pas encore commencé la gastrulation (stade 4 et stade 5), restant sous forme de syncytium (Figure 2F,G).
   REMARQUE : La caractéristique de cette étape est l’absence de rainures ou de plis et la présence d’un sac vitellin de forme ovale de couleur foncée visible au centre de l’embryon. La caractérisation morphologique du stade embryonnaire sous huile est basée sur le chapitre du livre « Stages de l’embryogenèse de la drosophile » de Volker Hartenstein¹⁷.
6. Utilisez le manipulateur de stade X-Y pour déplacer les embryons vers l’aiguille jusqu’à ce que la pointe arrive au centre du jaune. Pompez deux à trois fois pour injecter des anticorps dans le jaune. La réussite de l’injection est indiquée par la disparition rapide de la ride de la membrane vitelline à mesure que les embryons gagnent en volume à partir de la solution d’anticorps (Figure 2G).
7. Utilisez le manipulateur de stade X-Y pour éloigner les embryons de l’aiguille après l’injection et les déplacer vers le bas jusqu’à l’embryon suivant. Répétez l’étape 6 jusqu’à ce que tous les embryons de la lame soient injectés.
8. Transférez la lame de verre contenant les embryons injectés dans une chambre humide (figure 2A-8). Incuber à 25 °C jusqu’à ce que le stade souhaité de développement embryonnaire soit atteint.
9. Soulevez la lamelle de 24 mm x 50 mm de la lame de verre et placez-la directement dans le porte-lames du microscope. L’équipe sans embryons sera confrontée aux objectifs. Localisez les embryons à l’aide d’une lentille à faible grossissement sous un éclairage à fond vif et passez à une lentille 40x ou 63x pour une imagerie fluorescente haute résolution en direct.

Résultats

Pour démontrer les avantages de la méthode d’injection d’anticorps par rapport à l’imagerie en direct ou à l’immunofluorescence à base de marqueurs fluorescents, deux études de cas sont fournies qui caractérisent la localisation dynamique d’un récepteur transmembranaire de faible abondance, Notch, et un type de modification post-traductionnelle appelée phosphorylation de la tyrosine dans des embryons vivants.

L’activité de signalisation de l’encoche joue un rôle majeur...

Discussion

Cette procédure présente la méthode spécialisée de marquage par fluorescence avec des anticorps personnalisés et l’injection subséquente dans des embryons de drosophile à un stade précoce. Cette technique facilite la visualisation en temps réel des protéines ou des modifications post-traductionnelles qui existent en faibles quantités et qui sont généralement difficiles à observer par les méthodes conventionnelles de marquage GFP/mCherry.

Il faut faire preuve de prude...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt