Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعد تفاعلات البروتين والبروتين مهمة لتوضيح وظيفة البروتينات المستهدفة ، ويمكن أن يؤكد الترسيب المناعي المشترك (co-IP) بسهولة مثبطات مضخة البروتون. لقد نقلنا بشكل عابر بلازميد يشفر بروتينا موسوما بالحواتم إلى خلايا HEK-293 وطورنا طريقة ترسيب مناعي لتأكيد ارتباط اثنين من البروتينات المستهدفة بسهولة.

Abstract

تلعب تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) دورا محوريا في الظواهر البيولوجية ، مثل التنظيم الخلوي ، ونقل الإشارات داخل الخلايا ، وتنظيم النسخ. لذلك ، يعد فهم مثبطات مضخة البروتون نقطة انطلاق مهمة لمزيد من التحقيق في وظيفة البروتين المستهدف. في هذه الدراسة ، نقترح طريقة بسيطة لتحديد ارتباط اثنين من البروتينات المستهدفة عن طريق إدخال ناقلات تعبير الثدييات في خلايا HEK-293 باستخدام طريقة polyethylenimine ، وتحلل الخلايا في مخزن تحلل البروتين محلي الصنع ، وسحب البروتينات المستهدفة على هلام تقارب علامة epitope. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تأكيد PPI بين البروتينات المنصهرة المختلفة لعلامة epitope باستخدام الأجسام المضادة للتقارب ضد كل علامة بدلا من هلام تقارب علامة epitope. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للتحقق من مختلف PPIs ، بما في ذلك المستخلصات النووية ، من خطوط الخلايا الأخرى. لذلك ، يمكن استخدامه كطريقة أساسية في مجموعة متنوعة من تجارب PPI. تتحلل البروتينات عن طريق الدورة الزمنية الممتدة ودورات التجميد والذوبان المتكررة. لذلك ، يجب إجراء تحلل الخلايا ، والترسب المناعي ، والنشاف المناعي بسلاسة قدر الإمكان.

Introduction

تلعب البروتينات دورا رئيسيا في جميع الوظائف الخلوية ، بما في ذلك معالجة المعلومات ، والتمثيل الغذائي ، والنقل ، واتخاذ القرار ، والتنظيم الهيكلي. تتوسط البروتينات وظائفها من خلال التفاعل جسديا مع الجزيئات الأخرى. تعتبر تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) مهمة للتوسط في الوظائف الخلوية ، مثل التوسط في نقل الإشارات ، واستشعار البيئة ، وتحويل الطاقة إلى حركة فيزيائية ، وتنظيم نشاط الإنزيمات الأيضية والإشارات ، والحفاظ على التنظيم الخلوي1. وبالتالي ، يمكن استخدام PPIs لتوضيح الوظائف غير المعروفة2. يمكن تصنيف طرق الكشف عن مثبطات مضخة البروتون إلى ثلاثة أنواع: في المختبر ، في الجسم الحي ، وفي السيليكو. تم استخدام الترسيب المناعي المشترك (co-IP) ، وكروماتوغرافيا التقارب ، وتنقية التقارب الترادفي ، ومصفوفات البروتين ، وعرض العاثية ، وتكملة شظايا البروتين ، وعلم البلورات بالأشعة السينية ، والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للكشف عن PPI في المختبر 3. من بين هذه الطرق ، يتم استخدام co-IP على نطاق واسع بسبب بساطته.

تتكون علامة الانصهار FLAG من ثمانية أحماض أمينية (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK) ، بما في ذلك موقع انقسام إنتيريوكيناز ، وقد تم تصميمه خصيصا لكروماتوغرافيا التقارب المناعي4. يتم التعرف على البروتينات الموسومة ب DYKDDDDK والتقاطها باستخدام جسم مضاد مضاد ل DYKDDDDK. لذلك ، يتم سحبها بكفاءةباستخدام حبات الأغاروز 5 المرتبطة ب DYKDDDDK لتأكيد ارتباطها ببروتينات معينة بطريقة بسيطة. يمكن إجراء الترسيب المناعي في مجموعة متنوعة من الخلايا ، ويمكن تأكيد مجموعة واسعة من مثبطات مضخة البروتون باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتين محل الاهتمام. تم الإبلاغ سابقا عن الترسيب المناعي وشطف الببتيد مع حبات الأغاروز المضادة ل DYKDDDDK5.

هنا ، نقدم طريقة ترسيب مناعي بسيطة يتم فيها إدخال بلازميد يشفر بروتينا موسوما ب DYKDDDDK بشكل عابر في خلايا HEK-293 لتأكيد ارتباط بروتينين مهمين. يمكن أن ترتبط بعض الأجسام المضادة DYKDDDDK بكل من N-terminus و C-terminus لبروتينات الاندماج ولكن ليس غيرها6. لذلك ، لتجنب الالتباس ، يجب اختيار الجسم المضاد الذي يتعرف على العلامة المنصهرة في كل من N- و C-terminus. عند إدخال علامة حاتمة ، قد يكون من الممكن تجنب التغييرات التوافقية في البروتين عن طريق إدخال 3 إلى 12 زوجا أساسيا بين علامة الخاتم والبروتين المستهدف. ومع ذلك ، يجب أن يكون التسلسل المدرج زوجا أساسيا بمضاعفات 3 لتجنب إزاحة الإطار.

Protocol

يقدم الشكل 1 لمحة عامة عن البروتوكول.

1. إعداد الحلول والمخازن المؤقتة

  1. المخزن المؤقت لتحلل البروتين: قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل البروتين بعد تقرير منشور مسبقا7 (الجدول 1).
  2. محلول تحلل البروتين + مثبط الأنزيم البروتيني (PI): أضف مثبط الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد) إلى المخزن المؤقت المعد أعلاه (الخطوة 1.1). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  3. عينة عازلة: امزج 900 ميكرولتر من 4x Laemmli عينة عازلة (انظر جدول المواد) و 100 ميكرولتر من 2-mercaptoethanol. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  4. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع بولي أوكسي إيثيلين (20) أحادي سوربيتان (PBS-P): امزج 1.998 لتر من PBS و 2 مل من بولي أوكسي إيثيلين (20) أحادي سوربيتان (انظر جدول المواد). يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  5. 1x Tris / Glycine / SDS buffer: امزج 450 مل من DDW و 50 مل من 10x Tris / Glycine / SDS. تحضير في درجة حرارة الغرفة في يوم الاستخدام.

2. نقل البلازميد

  1. استزرع خلايا HEK-293 في طبق مغطى بالكولاجين 10 سم إلى التقاء فرعي (80٪ -95٪) باستخدام وسط النسر المعدل من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (10000 وحدة / مل بنسلين G و 10000 ميكروغرام / مل ستربتومايسين) (انظر جدول المواد).
  2. تحضير 1-10 ميكروغرام من البلازميد7 ليتم نقلها لكل طبق وجعل مزيج transfection. أضف 150 mM NaCl إلى الحجم النهائي 250 ميكرولتر لكل طبق. دوامة وتدور أسفل الخليط.
  3. أضف 60 ميكرولتر من 1 مجم / مل بولي إيثيلين إنيمين (PEI ، انظر جدول المواد) لكل طبق ، متبوعا ب 150 mM NaCl إلى الحجم النهائي 250 ميكرولتر من محلول PEI.
  4. أضف محلول PEI إلى مزيج النقل لعمل محلول مختلط. دوامة على الفور (بأقصى سرعة لمدة 3-5 ثوان ، قم بنفس الشيء بعد ذلك) وتدور لأسفل.
  5. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة. خلال هذا الوقت ، قم بتغيير وسيط خلايا HEK-293.
  6. يرش 500 ميكرولتر / طبق من محلول مختلط في جميع أنحاء طبق خلايا HEK-293 ويحتضن طوال الليل (13-14 ساعة).
  7. أداء تبادل المتوسطة في اليوم التالي.

3. تحلل الخلية وإعداد العينة

ملاحظة: لتجنب تدهور البروتين ، يجب تنفيذ الخطوات اللاحقة دون حفظ العينة أو تجميدها قدر الإمكان.

  1. بعد حوالي 48 ساعة من النقل ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد ، وأضف 500 ميكرولتر / طبق من محلول تحلل البروتين + PI ، واجمع الخلايا بواسطة مكشطة الخلايا وماصة في أنبوب به امتصاص منخفض للبروتين على الجليد.
  2. دوامة كل 5 دقائق واحتضان العينات على الجليد لمدة 10 دقائق.
  3. أجهزة الطرد المركزي عند 16400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل مع امتصاص منخفض للبروتين. يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية.
  4. حدد تركيز البروتين للعينات باستخدام مجموعة قياس تركيز البروتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  5. افصل 200-1000 ميكروغرام من نفس الكمية من البروتين في كل عينة ، ثم أضف محلول تحلل البروتين + PI لضبط الحجم الكلي إلى 500-1000 ميكرولتر.
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية على الجليد.

4. إعداد الطين

ملاحظة: قم بإعداد ملاط 1: 1 من هلام البروتين G وهلام تقارب علامة epitope في اليوم السابق أو في يوم الترسيب المناعي.

  1. إعداد هلام البروتين G
    1. باستخدام طرف مع قطع النهاية ، امزج جيدا ثم افصل البروتين G gel (انظر جدول المواد) بحيث يتم تحضير 20 ميكرولتر من الخرز لكل عينة.
    2. أجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 20 ثانية عند 4 درجات مئوية ووضع الخرز على الجليد لمدة 1 دقيقة للسماح للخرزات بالاستواء. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
    3. أضف 1 مل من محلول تحلل البروتين + PI إلى جل البروتين G المحضر في الخطوة 4.1.2 واخلطه عن طريق النقر والتقليب. أجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 20 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ضع الخرزات على الثلج لمدة 1 دقيقة للسماح للخرزات بالتسوية ، وتخلص من المادة الطافية.
    4. كرر الخطوة 4.1.3 ثلاث مرات.
    5. أضف حجما متساويا من محلول تحلل البروتين إلى هلام البروتين G لعمل ملاط جل G بروتين 1: 1. يمكن تخزين ملاط جل البروتين G عند 4 °C لمدة 1 يوم تقريبا.
  2. إعداد هلام تقارب علامة epitope
    1. باستخدام طرف مع قطع النهاية ، قم بتحريكه جيدا ثم افصل جل تقارب علامة الخلاصة (انظر جدول المواد) بحيث يتم تحضير 10-15 ميكرولتر من الخرز لكل عينة.
    2. أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية وانتظر لمدة 1 دقيقة على الجليد للسماح للخرز بالتسوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
    3. أضف 1 مل من محلول تحلل البروتين + PI إلى جل تقارب علامة epitope المحضر في الخطوة 4.2.2 واخلطه عن طريق النقر والتقليب. أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ضع الخرزات على الثلج لمدة 1 دقيقة للسماح للخرز بالتسوية ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
    4. كرر الخطوة 4.2.3 مرتين.
    5. أضف 500 ميكرولتر من 0.1 M جليكاين (درجة الحموضة 3.5) إلى جل تقارب علامة الختم المحضر في الخطوة 4.2.4 واخلطه عن طريق النقر والتقليب. يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة الأجسام المضادة لعلامة epitope المجانية. في غضون 20 دقيقة بعد إضافة الجلايسين ، أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ضع الخرزات على الثلج لمدة 1 دقيقة للسماح للخرزات بالتسوية ، وتخلص من المادة الطافية.
    6. أضف 500 ميكرولتر من محلول تحلل البروتين + PI إلى جل تقارب علامة epitope المحضر في الخطوة 4.2.5 واخلطه عن طريق النقر والتقليب. أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ضع الخرزات على الثلج لمدة 1 دقيقة للسماح للخرزات بالتسوية ، وتخلص من المادة الطافية.
    7. كرر الخطوة 4.2.6 ثلاث مرات.
    8. أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت لتحلل البروتين إلى جل تقارب علامة epitope لتحضير ملاط جل تقارب علامة epitope 1: 1. يمكن تخزين ملاط جل التقارب بعلامة epitope عند 4 °C لمدة 1 يوم تقريبا.

5. المقاصة المسبقة باستخدام جل البروتين G والتقاط مجمعات البروتين باستخدام جل تقارب علامة الخاتمة

  1. امزج 1: 1 بروتين G ملاط (محضر في الخطوة 4) مع ماصة مزودة بطرف مقطوع وأضف 40 ميكرولتر في المرة الواحدة إلى العينة.
  2. قم بتدوير العينة لمدة 1 ساعة على دوار (انظر جدول المواد) في حوالي 30 ثانية لكل دورة في غرفة مبردة (4 درجات مئوية).
  3. أجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 20 ثانية عند 4 درجات مئوية ووضع الخرز على الجليد لمدة 1 دقيقة للسماح للخرزات بالاستواء.
  4. اجمع المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل مع امتصاص منخفض البروتين.
  5. افصل العينة لإدخالها عن العينة في الخطوة 5.4 وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL.
  6. أضف 20-30 ميكرولتر من ملاط جل علامة 1: 1 إلى العينة.
  7. قم بالتدوير على الدوار لمدة 30 ثانية تقريبا لكل دورة في غرفة مبردة (4 درجات مئوية) لمدة 2 ساعة.
  8. أضف عينة عازلة إلى المدخلات المعدة في الخطوة 5.5 لتخفيفها إلى 4x ، وقم بتسخينها عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. يمكن تخزين المدخلات عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: نظرا لاحتمال تدهور البروتين بسبب التجميد والذوبان ، يجب تنفيذ الخطوات اللاحقة دون الحفاظ على البروتين قدر الإمكان.

6. غسل واستخلاص البروتينات المترسبة

  1. اضبط درجة حرارة كتلة الحرارة على 98 درجة مئوية.
  2. أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية وانتظر لمدة 1 دقيقة على الجليد للسماح للخرز بالتسوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
  3. أضف 1 مل من محلول تحلل البروتين + PI واخلطه عن طريق النقر والتقليب. قم بالتدوير على الدوار لمدة 30 ثانية تقريبا لكل دورة في غرفة مبردة (4 درجات مئوية) لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 °C ، انتظر لمدة 1 دقيقة على الجليد للسماح للخرز بالتسوية ، وتجاهل المادة الطافية.
  4. كرر الخطوة 6.3 5-10 مرات.
  5. أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة إلى العينة المعدة في الخطوة 6.4. تغلي على حرارة 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. أجهزة طرد مركزي عند 5000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية.
  7. ضع عمودا في أنبوب جديد مع امتصاص منخفض للبروتين وانقل الجل إلى العمود باستخدام ماصة ذات طرف مقطوع. يستخدم عمود لتجنب تلوث الجل.
  8. أجهزة الطرد المركزي عند 9730 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع التدفق من خلال. يمكن تخزين العينة عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا كان تدهور العينة مصدر قلق ، فيجب إجراء النشاف المناعي التالي دون تجميد.

7. النشاف المناعي

ملاحظة: تستند إجراءات النشاف المناعي إلى التقارير السابقة 7,8.

  1. قم بتحميل عينات كاملة على هلام بولي أكريلاميد دوديسيل سلفات الصوديوم (SDS-PAGE ، انظر جدول المواد).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، استخدم المواد الهلامية ذات الآبار الكبيرة بحيث يمكن نقل العينة بأكملها. تم استخدام المواد الهلامية مع آبار 50 ميكرولتر هنا.
  2. اضبط المواد الهلامية في غرفة الرحلان الكهربائي وأضف 1x Tris / Glycine / SDS buffer (انظر جدول المواد) حتى الحجم المناسب حول المواد الهلامية.
  3. المواد الهلامية الكهربائي في 100 فولت و 400 مللي أمبير.
  4. نقل إلى أغشية فلوريد البولي فينيليدين (PVDF ، انظر جدول المواد).
  5. سد بقع غشاء PVDF مع 5٪ حليب خالي الدسم في PBS-P لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBS-P على شاكر بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق. نفذ نفس الإجراء بعد ذلك عند الغسيل.
  7. احتضان طوال الليل على شاكر مع الجسم المضاد الأساسي (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية.
  8. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBS-P في اليوم التالي.
  9. احتضان لمدة 1 ساعة مع الجسم المضاد الثانوي على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: إذا كان الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف قريبا من سلسلة IgG الثقيلة ، والتي يبلغ وزنها الجزيئي حوالي 50 كيلو دالتون ، فيمكن استخدام جسم مضاد ثانوي خاص بالسلسلة الخفيفة لتجنب تداخل النطاق المستهدف مع سلسلة IgG الثقيلة. استخدمت هذه الدراسة الأجسام المضادة الخاصة بالسلسلة الخفيفة7 أو Veriblot ككاشف للكشف عن IP (انظر جدول المواد).
  10. تحديد نطاقات البروتينات مع ركائز الانارة البيروكسيديز. يمكن حفظ الغشاء في PBS بعد غسله مرتين باستخدام PBS-P.
  11. قم بتجريده لمدة 10 دقائق بمحلول تجريد (انظر جدول المواد).
  12. اغسليها ثلاث مرات واحجبيها بالحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ في PBS-P. والبروتوكول بعد ذلك هو نفسه كما في الخطوة 7-6 وما بعدها.

النتائج

الخلايا الشحمية الحرارية ، والمعروفة أيضا باسم الخلايا الشحمية البنية والبيج ، لها تأثيرات محتملة مضادة للسمنة ومضادة لعدم تحمل الجلوكوز. PR (PRD1-BF1-RIZ1 homologous) المجال الذي يحتوي على 16 (PRDM16) هو عامل مساعد للنسخ يلعب دورا مهما في تحديد هوية الخلايا الدهنية الحرارية 9,10

Discussion

يشبه هذا البروتوكول تقريبا البروتوكولات التي تم الإبلاغ عنهاسابقا 5،7،14،15. النقطة المهمة في هذا البروتوكول هي أننا لا نوقف التجربة أبدا من خطوة تحلل الخلية إلى خطوة الترسيب المناعي. تدهور البروتين يعيق اكتشاف PPI. تؤدي ا...

Disclosures

نعلن أنه ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح يتعلق بهذه الدراسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) KAKENHI رقم المنحة 19K18008 (GN) ، JSPS KAKENHI رقم المنحة 22K16415 (GN) ، رقم منحة JSPS KAKENHI 22K08672 (H.O.) ، منحة أبحاث جمعية السكري اليابانية للباحثين الشباب (GN) ، ومنحة أبحاث مؤسسة MSD Life Science Foundation للمحققين الشباب (G.N.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA (pH8.0)Nippon gene311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µLBiorad4561034
10x Tris/Glycine/SDSBiorad1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab SheepGE HealthcareNA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab DonkeyGE HealthcareNA934-1ML
Cell Scraper MSumitomo BakeliteMS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mmIWAKI4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementInvitrogen10565042
D-PBS (-)FUJIFILM Wako045-29795
GlycerolFUJIFILM Wako072-00626
GlycineFUJIFILM Wako077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724Cell SignalingC29F4
Laemmli Sample bufferBio-Rad Laboratories161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography ColumnsBiorad7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast GelsBiorad1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouseSigmaF3165
NaClFUJIFILM Wako191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16This paperN/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1This paperN/A
pcDNA3.1-vectorThis paperN/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine HydrochloridePSI24765
Penicillin-streptomycin solutionFUJIFILM Wako168-23191
Pierce BCA Protein Assay KitThermo scientific23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl EtherFUJIFILM Wako168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan MonolaurateFUJIFILM Wako167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab PacksCytiva17061801
Protein LoBind Tubeseppendorf30108442
ROTATOR RT-5TAITECRT-5
skim milkMorinaga0652842 
Stripping SolutionFUJIFILM Wako193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer PackBiorad1704156B03
Trans-Blot Turbo SystemBioradN/A
Trizma baseSigmaT1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30910.03
VeriblotAbcamab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970Cell Signaling4970S

References

  1. Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
  2. Yanagida, M. Functional proteomics; current achievements. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).
  3. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
  4. Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  5. Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
  6. Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
  7. Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143 (2023).
  8. Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584 (2015).
  9. Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
  10. Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
  11. Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
  12. Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674 (2023).
  13. Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
  14. Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569 (2022).
  15. Cristea, I. M., Chait, B. T. Affinity purification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  16. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  17. Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243 (2009).
  18. Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
  19. Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved