Immunoprécipitation avec un gel d’affinité anti-épitope pour étudier les interactions protéine-protéine

Résumé

Les interactions protéine-protéine sont importantes pour élucider la fonction des protéines cibles, et la co-immunoprécipitation (co-IP) peut facilement confirmer les IPP. Nous avons transfecté transitoirement un plasmide codant pour une protéine marquée à un épitope dans des cellules HEK-293 et développé une méthode d’immunoprécipitation pour confirmer facilement la liaison de deux protéines cibles.

Résumé

Les interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central dans les phénomènes biologiques, tels que l’organisation cellulaire, la transduction du signal intracellulaire et la régulation transcriptionnelle. Par conséquent, la compréhension des IPP est un point de départ important pour une étude plus approfondie de la fonction de la protéine cible. Dans cette étude, nous proposons une méthode simple pour déterminer la liaison de deux protéines cibles en introduisant des vecteurs d’expression de mammifères dans les cellules HEK-293 à l’aide de la méthode de la polyéthylénimine, en lysant les cellules dans un tampon de lyse protéique fait maison et en tirant les protéines cibles sur un gel d’affinité de marquage d’épitope. De plus, l’IPP entre les différentes protéines fusionnées avec l’épitope peut être confirmée en utilisant des anticorps d’affinité contre chaque étiquette au lieu du gel d’affinité de l’épitope. Ce protocole pourrait également être utilisé pour vérifier divers IPP, y compris les extraits nucléaires, d’autres lignées cellulaires. Par conséquent, il peut être utilisé comme méthode de base dans une variété d’expériences IPP. Les protéines se dégradent en raison d’une longue période de temps et de cycles répétés de congélation-décongélation. Par conséquent, la lyse cellulaire, l’immunoprécipitation et l’immunotransfert doivent être effectués de manière aussi transparente que possible.

Introduction

Les protéines jouent un rôle majeur dans toutes les fonctions cellulaires, y compris le traitement de l’information, le métabolisme, le transport, la prise de décision et l’organisation structurelle. Les protéines médient leurs fonctions en interagissant physiquement avec d’autres molécules. Les interactions protéine-protéine (IPP) sont importantes pour la médiation des fonctions cellulaires, telles que la médiation de la transduction du signal, la détection de l’environnement, la conversion de l’énergie en mouvement physique, la régulation de l’activité des enzymes métaboliques et de signalisation et le maintien de l’organisation cellulaire¹. ....

Protocole

La figure 1 présente une vue d’ensemble du protocole.

1. Préparation des solutions et des tampons

1. Tampon de lyse des protéines : Préparer le tampon de lyse des protéines en suivant un rapport⁷ publié précédemment (tableau 1).
2. Tampon de lyse des protéines + inhibiteur de protéase (IP) : Ajouter l’inhibiteur de protéase (voir le tableau des matériaux) au tampon préparé ci-dessus (étape 1.1). Conserver à -20 °C.
3. Tampon d’échantillon : Mélangez 900 μL de 4 tampons d’échantillon Laemmli (voir tableau des ....

Discussion

Ce protocole est presque comme les protocoles^{5, 7, 14, 15} précédemment rapportés. Le point important de ce protocole est que nous n’arrêtons jamais l’expérience de l’étape de lyse cellulaire à l’étape d’immunoprécipitation. La dégradation des protéines entrave la détection des IPP. L’allongement du temps et les cycles répétés de gel-dégel dégradent les protéines. L.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH8.0)	Nippon gene	311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL	Biorad	4561034
10x Tris/Glycine/SDS	Biorad	1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep	GE Healthcare	NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey	GE Healthcare	NA934-1ML
Cell Scraper M	Sumitomo Bakelite	MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm	IWAKI	4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Invitrogen	10565042
D-PBS (-)	FUJIFILM Wako	045-29795
Glycerol	FUJIFILM Wako	072-00626
Glycine	FUJIFILM Wako	077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724	Cell Signaling	C29F4
Laemmli Sample buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Biorad	7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels	Biorad	1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma	F3165
NaCl	FUJIFILM Wako	191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16	This paper	N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1	This paper	N/A
pcDNA3.1-vector	This paper	N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride	PSI	24765
Penicillin-streptomycin solution	FUJIFILM Wako	168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	FUJIFILM Wako	168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako	167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs	Cytiva	17061801
Protein LoBind Tubes	eppendorf	30108442
ROTATOR RT-5	TAITEC	RT-5
skim milk	Morinaga	0652842
Stripping Solution	FUJIFILM Wako	193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack	Biorad	1704156B03
Trans-Blot Turbo System	Biorad	N/A
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30910.03
Veriblot	Abcam	ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970	Cell Signaling	4970S