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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Les interactions protéine-protéine sont importantes pour élucider la fonction des protéines cibles, et la co-immunoprécipitation (co-IP) peut facilement confirmer les IPP. Nous avons transfecté transitoirement un plasmide codant pour une protéine marquée à un épitope dans des cellules HEK-293 et développé une méthode d’immunoprécipitation pour confirmer facilement la liaison de deux protéines cibles.

Résumé

Les interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central dans les phénomènes biologiques, tels que l’organisation cellulaire, la transduction du signal intracellulaire et la régulation transcriptionnelle. Par conséquent, la compréhension des IPP est un point de départ important pour une étude plus approfondie de la fonction de la protéine cible. Dans cette étude, nous proposons une méthode simple pour déterminer la liaison de deux protéines cibles en introduisant des vecteurs d’expression de mammifères dans les cellules HEK-293 à l’aide de la méthode de la polyéthylénimine, en lysant les cellules dans un tampon de lyse protéique fait maison et en tirant les protéines cibles sur un gel d’affinité de marquage d’épitope. De plus, l’IPP entre les différentes protéines fusionnées avec l’épitope peut être confirmée en utilisant des anticorps d’affinité contre chaque étiquette au lieu du gel d’affinité de l’épitope. Ce protocole pourrait également être utilisé pour vérifier divers IPP, y compris les extraits nucléaires, d’autres lignées cellulaires. Par conséquent, il peut être utilisé comme méthode de base dans une variété d’expériences IPP. Les protéines se dégradent en raison d’une longue période de temps et de cycles répétés de congélation-décongélation. Par conséquent, la lyse cellulaire, l’immunoprécipitation et l’immunotransfert doivent être effectués de manière aussi transparente que possible.

Introduction

Les protéines jouent un rôle majeur dans toutes les fonctions cellulaires, y compris le traitement de l’information, le métabolisme, le transport, la prise de décision et l’organisation structurelle. Les protéines médient leurs fonctions en interagissant physiquement avec d’autres molécules. Les interactions protéine-protéine (IPP) sont importantes pour la médiation des fonctions cellulaires, telles que la médiation de la transduction du signal, la détection de l’environnement, la conversion de l’énergie en mouvement physique, la régulation de l’activité des enzymes métaboliques et de signalisation et le maintien de l’organisation cellulaire1. Ainsi, les IPP peuvent être utilisés pour élucider des fonctions inconnues2. Les méthodes de détection des IPP peuvent être classées en trois types : in vitro, in vivo et in silico. La co-immunoprécipitation (co-IP), la chromatographie d’affinité, la purification d’affinité en tandem, les réseaux de protéines, l’affichage de phages, la complémentation de fragments de protéines, la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire ont été utilisés pour la détection in vitro des IPP3. Parmi ces méthodes, la co-IP est largement utilisée en raison de sa simplicité.

L’étiquette de fusion FLAG se compose de huit acides aminés (AspTyrLysAspAspAspAspAspLys : DYKDDDDK), y compris un site de clivage de l’entérokinase, et a été spécialement conçue pour la chromatographie d’immunoaffinité4. Les protéines marquées DYKDDDDK sont reconnues et capturées à l’aide d’un anticorps anti-DYKDDDDK. Par conséquent, ils sont efficacement tirés vers le bas à l’aide de billes d’agarose de liaison DYKDDDDK5 pour confirmer leur liaison à des protéines spécifiques de manière simple. L’immunoprécipitation peut être réalisée dans une variété de cellules, et une large gamme d’IPP peut être confirmée à l’aide d’anticorps contre la protéine d’intérêt. L’immunoprécipitation et l’élution peptidique avec des billes d’agarose anti-DYKDDDDK ont déjà été signalées5.

Ici, nous proposons une méthode d’immunoprécipitation simple dans laquelle un plasmide codant pour une protéine marquée DYKDDDDK est introduit transitoirement dans les cellules HEK-293 pour confirmer l’association de deux protéines d’intérêt. Certains anticorps DYKDDDDK peuvent se lier à la fois à l’extrémité N-terminale et à l’extrémité C-terminale des protéines de fusion, mais pas à d’autres6. Par conséquent, pour éviter toute confusion, il faut choisir l’anticorps qui reconnaît l’étiquette fusionnée à l’extrémité N-terminale et à l’extrémité C-terminale. Lors de l’insertion d’un marqueur d’épitope, il peut être possible d’éviter les changements conformationnels dans la protéine en insérant 3 à 12 paires de bases entre l’étiquette d’épitope et la protéine cible. Cependant, la séquence insérée doit être une paire de base en multiples de 3 pour éviter le décalage d’image.

Protocole

La figure 1 présente une vue d’ensemble du protocole.

1. Préparation des solutions et des tampons

  1. Tampon de lyse des protéines : Préparer le tampon de lyse des protéines en suivant un rapport7 publié précédemment (tableau 1).
  2. Tampon de lyse des protéines + inhibiteur de protéase (IP) : Ajouter l’inhibiteur de protéase (voir le tableau des matériaux) au tampon préparé ci-dessus (étape 1.1). Conserver à -20 °C.
  3. Tampon d’échantillon : Mélangez 900 μL de 4 tampons d’échantillon Laemmli (voir tableau des matériaux) et 100 μL de 2-mercaptoéthanol. Conserver à -20 °C.
  4. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec monolaurate de polyoxyéthylène (20) sorbitan (PBS-P) : Mélanger 1,998 L de PBS et 2 mL de monolaurate de polyoxyéthylène (20) sorbitan (voir le tableau des matériaux). Conserver à température ambiante.
  5. 1x tampon Tris/Glycine/SDS : Mélanger 450 mL de DDW et 50 mL de 10x Tris/Glycine/SDS. Préparer à température ambiante le jour de l’utilisation.

2. Transfection plasmidique

  1. Cultiver des cellules HEK-293 dans une boîte de 10 cm enrobée de collagène jusqu’à la sous-confluence (80 % à 95 %) à l’aide d’un milieu d’aigle modifié de Dulbecco contenant 10 % de sérum de bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine (10 000 unités/ml de pénicilline G et 10 000 μg/ml de streptomycine) (voir le tableau des matériaux).
  2. Préparez 1 à 10 μg de plasmide7 à transfecter par plat et faites un mélange de transfection. Ajouter 150 mM de NaCl à un volume final de 250 μL par plat. Vortex et faites tourner le mélange.
  3. Ajouter 60 μL de polyéthylénimine 1 mg/mL (PEI, voir le tableau des matières) par boîte, puis 150 mM de NaCl jusqu’à un volume final de 250 μL de solution PEI.
  4. Ajouter la solution PEI au mélange de transfection pour obtenir une solution mixte. Tourbillonnez immédiatement (à vitesse maximale pendant 3 à 5 s, effectuez la même chose par la suite) et tournez vers le bas.
  5. Incuber à température ambiante pendant 15 à 30 min. Pendant ce temps, changez le milieu des cellules HEK-293.
  6. Saupoudrer 500 μL/boîte de solution mixte sur toute la boîte de cellules HEK-293 et incuber pendant une nuit (13-14 h).
  7. Effectuez le remplacement du fluide le lendemain.

3. Lyse cellulaire et préparation des échantillons

REMARQUE : Pour éviter la dégradation des protéines, les étapes suivantes doivent être effectuées sans conservation ni congélation-décongélation de l’échantillon autant que possible.

  1. Environ 48 h après la transfection, laver les cellules trois fois avec du PBS glacé, ajouter 500 μL/boîte de tampon de lyse des protéines + PI, et prélever les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et d’une pipette dans un tube à faible adsorption des protéines sur glace.
  2. Vortex toutes les 5 min et incuber les échantillons sur glace pendant 10 min.
  3. Centrifugeuse à 16 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Prélever le surnageant et le transférer dans un tube frais de 1,5 mL à faible adsorption protéique. Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C.
  4. Déterminer la concentration en protéines des échantillons à l’aide d’un kit de mesure de la concentration en protéines selon le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  5. Séparez 200 à 1000 μg de la même quantité de protéines dans chaque échantillon, puis ajoutez un tampon de lyse des protéines + PI pour ajuster le volume total à 500-1000 μL.
    REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées sur de la glace.

4. Préparation du lisier

REMARQUE : Préparez une suspension 1:1 de gel de protéine G et de gel d’affinité d’épitope la veille ou le jour de l’immunoprécipitation.

  1. Préparation d’un gel de protéine G
    1. À l’aide d’une pointe dont l’extrémité est coupée, bien mélanger puis séparer le gel de protéine G (voir tableau des matériaux) de manière à préparer 20 μL de billes par échantillon.
    2. Centrifuger à 12 000 x g pendant 20 s à 4 °C et placer les billes sur de la glace pendant 1 min pour permettre aux billes de se stabiliser. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
    3. Ajouter 1 mL de tampon de lyse protéique + PI au gel de protéine G préparé à l’étape 4.1.2 et mélanger en tapotant et en inversant. Centrifuger à 12 000 x g pendant 20 s à 4 °C, placer les billes sur de la glace pendant 1 min pour permettre aux billes de se stabiliser, puis jeter le surnageant.
    4. Répétez l’étape 4.1.3 trois fois.
    5. Ajoutez un volume égal de tampon de lyse protéique au gel de protéine G pour obtenir une suspension de gel de protéine G 1:1. Le gel de protéine G peut être stocké à 4 °C pendant environ 1 jour.
  2. Préparation d’un gel d’affinité d’épitope
    1. À l’aide d’une pointe dont l’extrémité est coupée, agitez bien, puis séparez le gel d’affinité de l’épitope (voir le tableau des matériaux) de manière à ce que 10 à 15 μL de billes par échantillon soient préparés.
    2. Centrifuger à 5 000 x g pendant 30 s à 4 °C et attendre 1 min sur de la glace pour permettre aux billes de se stabiliser. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
    3. Ajouter 1 mL de tampon de lyse protéique + PI au gel d’affinité de marquage d’épitope préparé à l’étape 4.2.2 et mélanger en tapotant et en inversant. Centrifuger à 5 000 x g pendant 30 s à 4 °C, placer les billes sur de la glace pendant 1 min pour permettre aux billes de se stabiliser, puis jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
    4. Répétez l’étape 4.2.3 deux fois.
    5. Ajouter 500 μL de glycine 0,1 M (pH 3,5) au gel d’affinité d’épitope préparé à l’étape 4.2.4 et mélanger en tapotant et en inversant. Cette étape est effectuée pour éliminer les anticorps libres de l’épitope. Dans les 20 minutes qui suivent l’ajout de glycine, centrifuger à 5 000 x g pendant 30 s à 4 °C, placer les billes sur de la glace pendant 1 minute pour permettre aux billes de se stabiliser, puis jeter le surnageant.
    6. Ajouter 500 μL de tampon de lyse protéique + PI au gel d’affinité de marquage d’épitope préparé à l’étape 4.2.5 et mélanger en tapotant et en inversant. Centrifuger à 5 000 x g pendant 30 s à 4 °C, placer les billes sur de la glace pendant 1 min pour permettre aux billes de se stabiliser, puis jeter le surnageant.
    7. Répétez l’étape 4.2.6 trois fois.
    8. Ajoutez un volume égal de tampon de lyse protéique au gel d’affinité d’épitope pour préparer une suspension de gel d’affinité d’épitope d’épitope 1:1. La suspension de gel d’affinité d’épitope peut être stockée à 4 °C pendant environ 1 jour.

5. Pré-élimination avec le gel de protéine G et capture des complexes protéiques avec le gel d’affinité de marqueur d’épitope

  1. Mélanger la suspension de protéine G 1:1 (préparée à l’étape 4) à l’aide d’une pipette munie d’une pointe coupée et ajouter 40 μL à la fois à l’échantillon.
  2. Tourner l’échantillon pendant 1 h sur un rotateur (voir tableau des matériaux) en environ 30 s par cycle dans une chambre réfrigérée (4 °C).
  3. Centrifuger à 12 000 x g pendant 20 s à 4 °C et placer les billes sur de la glace pendant 1 min pour permettre aux billes de se stabiliser.
  4. Prélever le surnageant et le transférer dans un nouveau tube de 1,5 mL à faible adsorption protéique.
  5. Séparez l’échantillon de l’échantillon à l’étape 5.4 et transférez-le dans un nouveau tube de 1,5 ml.
  6. Ajouter 20 à 30 μL de boue de gel d’épitope 1:1 à l’échantillon.
  7. Tourner sur un rotateur pendant environ 30 s par cycle dans une chambre réfrigérée (4 °C) pendant 2 h.
  8. Ajouter le tampon d’échantillon à l’entrée préparée à l’étape 5.5 pour le diluer à 4x, et chauffer à 98 °C pendant 10 min. L’entrée peut être stockée à -80 °C.
    REMARQUE : En raison de la possibilité de dégradation des protéines due à la congélation et à la décongélation, les étapes ultérieures doivent être effectuées sans préserver la protéine autant que possible.

6. Lavage et élution des protéines précipitées

  1. Réglez la température du bloc chauffant sur 98 °C.
  2. Centrifuger à 5 000 x g pendant 30 s à 4 °C et attendre 1 min sur de la glace pour permettre aux billes de se stabiliser. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
  3. Ajouter 1 mL de tampon de lyse des protéines + PI et mélanger en tapotant et en inversant. Tourner sur un rotateur pendant environ 30 s par cycle dans une chambre réfrigérée (4 °C) pendant 5 min. Centrifuger à 5 000 x g pendant 30 s à 4 °C, attendre 1 min sur de la glace pour permettre aux billes de se stabiliser et jeter le surnageant.
  4. Répétez l’étape 6.3 5 à 10 fois.
  5. Ajouter 10 μL de tampon d’échantillon à l’échantillon préparé à l’étape 6.4. Faire bouillir à 98 °C pendant 10 min.
  6. Centrifugeuse à 5 000 x g à 4 °C pendant 30 s.
  7. Placez une colonne dans un nouveau tube à faible adsorption des protéines et transférez le gel dans la colonne à l’aide d’une pipette avec une pointe coupée. Une colonne est utilisée pour éviter la contamination du gel.
  8. Centrifugeuse à 9 730 x g pendant 1 min à 4 °C. Collectez le flux de continuation. L’échantillon peut être stocké à -80 °C.
    REMARQUE : Si la dégradation de l’échantillon est préoccupante, l’immunotransfert suivant doit être effectué sans congélation.

7. Immunobuvardage

REMARQUE : Les procédures d’immunobuvardage sont basées sur les rapports précédents 7,8.

  1. Chargez des échantillons entiers sur un gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE, voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Si nécessaire, utilisez des gels à grand puits afin que l’échantillon entier puisse être transféré. Des gels avec des puits de 50 μL ont été utilisés ici.
  2. Placez les gels dans la chambre d’électrophorèse et ajoutez 1x tampon Tris/Glycine/SDS (voir le tableau des matériaux) jusqu’au volume approprié autour des gels.
  3. Gels d’électrophorèse à 100 V et 400 mA.
  4. Transfert sur des membranes en polyfluorure de vinylidène (PVDF, voir Tableau des matériaux).
  5. Bloquez les taches de membrane PVDF avec du lait écrémé à 5 % dans du PBS-P pendant 1 h à température ambiante.
  6. Lavez la membrane trois fois avec du PBS-P sur un agitateur à vitesse maximale pendant 5 min. Effectuez la même procédure par la suite lors du lavage.
  7. Incuber toute la nuit sur un agitateur avec l’anticorps primaire (voir tableau des matériaux) à 4 °C.
  8. Lavez la membrane trois fois avec du PBS-P le lendemain.
  9. Incuber pendant 1 h avec l’anticorps secondaire sur un agitateur à température ambiante.
    REMARQUE : Si le poids moléculaire de la protéine cible est proche de la chaîne lourde IgG, qui a un poids moléculaire d’environ 50 kDa, un anticorps secondaire spécifique à la chaîne légère peut être utilisé pour éviter le chevauchement de la bande cible avec la chaîne lourde IgG. Cette étude a utilisé des anticorps spécifiques des chaînes légères7 ou Veriblot comme réactif de détection IP (voir le tableau des matériaux).
  10. Identifier les bandes de protéines avec des substrats luminescents de peroxydase. La membrane peut être conservée dans PBS après l’avoir lavée deux fois avec PBS-P.
  11. Décaper pendant 10 min avec une solution de décapage (voir tableau des matériaux).
  12. Laver trois fois et bloquer avec du lait écrémé à 5 % dans du PBS-P. Le protocole suivant est le même qu’à l’étape 7.6 et suivantes.

Résultats

Les adipocytes thermogéniques, également connus sous le nom d’adipocytes bruns et beiges, ont des effets anti-obésité et anti-intolérance au glucose. Le domaine 16 (PRDM16) contenant le domaine PRD1 (PRDM16) est un cofacteur de transcription qui joue un rôle important dans la détermination de l’identité adipocytaire thermogénique 9,10.

EHMT1 (histone-lysine N-méthyltransférase 1 euchromatique), également connue sous le ...

Discussion

Ce protocole est presque comme les protocoles5, 7, 14, 15 précédemment rapportés. Le point important de ce protocole est que nous n’arrêtons jamais l’expérience de l’étape de lyse cellulaire à l’étape d’immunoprécipitation. La dégradation des protéines entrave la détection des IPP. L’allongement du temps et les cycles répétés de gel-dégel dégradent les protéines. L...

Déclarations de divulgation

Nous déclarons qu’aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts lié à cette étude.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) numéro de subvention KAKENHI 19K18008 (G.N.), la subvention JSPS Kakenhi numéro 22K16415 (G.N.), la subvention JSPS Kakenhi numéro 22K08672 (H.O.), la subvention de recherche de la Société japonaise du diabète pour les jeunes chercheurs (G.N.) et la subvention de recherche de la Fondation MSD pour les sciences de la vie pour les jeunes chercheurs (G.N.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA (pH8.0)Nippon gene311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µLBiorad4561034
10x Tris/Glycine/SDSBiorad1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab SheepGE HealthcareNA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab DonkeyGE HealthcareNA934-1ML
Cell Scraper MSumitomo BakeliteMS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mmIWAKI4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementInvitrogen10565042
D-PBS (-)FUJIFILM Wako045-29795
GlycerolFUJIFILM Wako072-00626
GlycineFUJIFILM Wako077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724Cell SignalingC29F4
Laemmli Sample bufferBio-Rad Laboratories161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography ColumnsBiorad7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast GelsBiorad1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouseSigmaF3165
NaClFUJIFILM Wako191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16This paperN/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1This paperN/A
pcDNA3.1-vectorThis paperN/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine HydrochloridePSI24765
Penicillin-streptomycin solutionFUJIFILM Wako168-23191
Pierce BCA Protein Assay KitThermo scientific23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl EtherFUJIFILM Wako168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan MonolaurateFUJIFILM Wako167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab PacksCytiva17061801
Protein LoBind Tubeseppendorf30108442
ROTATOR RT-5TAITECRT-5
skim milkMorinaga0652842 
Stripping SolutionFUJIFILM Wako193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer PackBiorad1704156B03
Trans-Blot Turbo SystemBioradN/A
Trizma baseSigmaT1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30910.03
VeriblotAbcamab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970Cell Signaling4970S

Références

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