АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Белок-белковые взаимодействия важны для выяснения функции белков-мишеней, а ко-иммунопреципитация (co-IP) может легко подтвердить ИПП. Мы временно трансфицировали плазмиду, кодирующую белок, помеченный эпитопом, в клетки HEK-293 и разработали метод иммунопреципитации, чтобы легко подтвердить связывание двух белков-мишеней.

Аннотация

Белок-белковые взаимодействия (ИПП) играют ключевую роль в биологических явлениях, таких как клеточная организация, внутриклеточная передача сигналов и регуляция транскрипции. Таким образом, понимание ИПП является важной отправной точкой для дальнейшего исследования функции белка-мишени. В этом исследовании мы предлагаем простой метод определения связывания двух белков-мишеней путем введения экспрессирующих векторов млекопитающих в клетки HEK-293 с помощью метода полиэтиленимина, лизирования клеток в самодельном буфере для лизиса белка и извлечения целевых белков на гель аффинности эпитопной метки. Кроме того, ИПП между различными белками, слитыми с эпитопными метками, может быть подтвержден путем использования аффинных антител против каждой метки вместо аффинного геля эпитопной метки. Этот протокол также может быть использован для проверки различных ИПП, включая ядерные экстракты, из других клеточных линий. Поэтому его можно использовать в качестве основного метода в различных экспериментах с ИПП. Белки разрушаются при длительном протекании времени и повторяющихся циклах замораживания-оттаивания. Поэтому лизис клеток, иммунопреципитация и иммуноблоттинг должны выполняться как можно более плавно.

Введение

Белки играют важную роль во всех клеточных функциях, включая обработку информации, метаболизм, транспорт, принятие решений и структурную организацию. Белки опосредуют свои функции, физически взаимодействуя с другими молекулами. Белок-белковые взаимодействия (ИПП) важны для опосредования клеточных функций, таких как опосредование передачи сигналов, восприятие окружающей среды, преобразование энергии в физическое движение, регулирование активности метаболических и сигнальных ферментов и поддержание клеточнойорганизации. Таким образом, ИЦП могут быть использованы для выяснения неизвестных функций2. Методы выявления ИПП можно разделить на три типа: in vitro, in vivo и in silico. Для обнаружения ИПП in vitro использовали ко-иммунопреципитацию (co-IP), аффинную хроматографию, тандемную аффинную очистку, белковые матрицы, фаговый дисплей, комплементацию белковых фрагментов, рентгеновскую кристаллографию и спектроскопию ядерного магнитного резонанса3. Среди этих методов со-ИС широко используется из-за своей простоты.

Фьюжн-метка FLAG состоит из восьми аминокислот (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), включая сайт расщепления энтерокиназы, и была специально разработана для иммуноаффинной хроматографии4. Белки, меченные DYKDDDDK, распознаются и захватываются с помощью антитела против DYKDDDDK. Поэтому они эффективно удаляются с помощью связывающих шариков агарозы5 DYKDDDDK для простого подтверждения их связывания с определенными белками. Иммунопреципитация может быть выполнена в различных клетках, и широкий спектр ИПП может быть подтвержден с помощью антител против интересующего белка. Ранее сообщалось об иммунопреципитации и элюировании пептидов с помощью анти-DYKDDK агарозных гранул5.

Здесь мы предлагаем простой метод иммунопреципитации, в котором плазмида, кодирующая белок, меченный DYKDDDDK, временно вводится в клетки HEK-293 для подтверждения ассоциации двух представляющих интерес белков. Некоторые антитела DYKDDDDK могут связываться как с N-концом, так и с C-концом гибридных белков, ноне с другими 6. Поэтому, чтобы избежать путаницы, следует выбирать антитело, которое распознает метку, слитую как с N-, так и с C-концом. При вставке эпитопной метки можно избежать конформационных изменений в белке, вставив от 3 до 12 пар оснований между эпитопной меткой и белком-мишенью. Однако вставленная последовательность должна быть парой оснований, кратной 3, чтобы избежать сдвига кадра.

протокол

На рисунке 1 представлен обзор протокола.

1. Приготовление растворов и буферов

  1. Буфер для лизиса белка: Подготовьте буфер для лизиса белка в соответствии с ранее опубликованным отчетом7 (Таблица 1).
  2. Буфер для лизиса белка + ингибитор протеазы (PI): Добавьте ингибитор протеазы (см. Таблицу материалов) в вышеприготовленный буфер (шаг 1.1). Хранить при температуре -20 °C.
  3. Буфер для образцов: Смешайте 900 μл 4-кратного буфера для образцов Laemmli (см. Таблицу материалов) и 100 μл 2-меркаптоэтанола. Хранить при температуре -20 °C.
  4. Фосфатно-солевой буфер (PBS) с полиоксиэтиленом (20) монолауратом сорбитана (PBS-P): Смешайте 1,998 л PBS и 2 мл полиоксиэтилена (20) монолаурата сорбитана (см. Таблицу материалов). Хранить при комнатной температуре.
  5. 1x Трис/Глицин/SDS буфер: Смешайте 450 мл DDW и 50 мл 10x Трис/Глицин/SDS. Готовьте при комнатной температуре в день использования.

2. Плазмидная трансфекция

  1. Культивирование клеток HEK-293 в 10-сантиметровой чашке, покрытой коллагеном, до субконфлюенции (80%-95%) с использованием модифицированной среды Dulbecco, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина (10 000 ЕД/мл пенициллина G и 10 000 мкг/мл стрептомицина) (см. Таблицу материалов).
  2. Приготовьте 1-10 г плазмиды7 для трансфекции на чашку и сделайте трансфекционную смесь. Добавьте 150 мМ NaCl в конечный объем 250 μл на чашку. Закрутите и раскрутите смесь.
  3. Добавьте 60 мкл 1 мг/мл полиэтиленимина (ПЭИ, см. Таблицу материалов) на чашку, а затем 150 мМ NaCl до конечного объема 250 мкл раствора ПЭИ.
  4. Добавьте раствор PEI в смесь для трансфекции, чтобы получить смешанный раствор. Немедленно сделайте вихрь (на максимальной скорости в течение 3-5 с, затем выполните то же самое) и раскрутите вниз.
  5. Выдерживать при комнатной температуре 15-30 мин. За это время смените среду ячеек HEK-293.
  6. Рассыпьте 500 мкл смешанного раствора по всей чашке с ячейками HEK-293 и инкубируйте в течение ночи (13-14 ч).
  7. Выполните средний обмен на следующий день.

3. Лизис клеток и пробоподготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание деградации белка последующие этапы должны выполняться без консервации или замораживания-размораживания образца, насколько это возможно.

  1. Примерно через 48 ч после трансфекции трижды промыть клетки ледяным PBS, добавить 500 мкл/чашку буфера для лизиса белка + PI, и собрать клетки скребком для клеток и пипеткой в пробирку с низкой адсорбцией белка на льду.
  2. Делайте вихрь каждые 5 минут и инкубируйте образцы на льду в течение 10 минут.
  3. Центрифуга при 16 400 x g в течение 10 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и перенесите ее в свежую пробирку объемом 1,5 мл с низкой адсорбцией белка. Образцы можно хранить при температуре -80 °C.
  4. Определить концентрацию белка в образцах с помощью набора для измерения концентрации белка в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
  5. Отделите 200-1000 μг одинакового количества белка в каждом образце, затем добавьте буфер для лизиса белка + PI, чтобы довести общий объем до 500-1000 μл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются на льду.

4. Приготовление навозной жижи

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте суспензию из геля протеина G и геля сродства эпитопной метки 1:1 за день до или в день иммунопреципитации.

  1. Приготовление геля с протеином G
    1. С помощью наконечника с отрезанным концом хорошо перемешайте, а затем отделите гель Protein G (см. Таблицу материалов) так, чтобы получить 20 мкл гранул на образец.
    2. Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 20 с при 4 °C и поместите шарики на лед на 1 минуту, чтобы шарики выровнялись. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
    3. Добавьте 1 мл буфера для лизиса белка + PI в гель Protein G, приготовленный на шаге 4.1.2, и перемешайте, постукивая и переворачивая. Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 20 с при 4 °C, поместите шарики на лед на 1 минуту, чтобы шарики выровнялись, и выбросьте надосадочную жидкость.
    4. Повторите шаг 4.1.3 трижды.
    5. Добавьте равный объем буфера для лизиса белка к гелю с протеином G, чтобы получить суспензию для геля с протеином G в соотношении 1:1. Гелевую суспензию протеина G можно хранить при температуре 4 °C в течение примерно 1 дня.
  2. Приготовление аффинного геля эпитопной метки
    1. С помощью наконечника с отрезанным концом хорошо перемешать, а затем отделить гель сродства эпитопной метки (см. Таблицу материалов) таким образом, чтобы получить 10-15 мкл гранул на образец.
    2. Центрифугируйте при 5 000 x g в течение 30 с при 4 °C и подождите 1 мин на льду, чтобы гранулы выровнялись. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
    3. Добавьте 1 мл буфера для лизиса белка + PI в гель сродства эпитопной метки, приготовленный на шаге 4.2.2, и перемешайте, постукивая и переворачивая. Центрифугируйте при 5 000 x g в течение 30 с при 4 °C, поместите шарики на лед на 1 минуту, чтобы шарики выровнялись, и выбросьте надосадочную жидкость пипеткой.
    4. Повторите шаг 4.2.3 дважды.
    5. Добавьте 500 μл 0,1 М глицина (pH 3,5) в аффинный гель эпитопной метки, приготовленный на шаге 4.2.4, и перемешайте, постукивая и переворачивая. Этот шаг выполняется для удаления свободных антител эпитопной метки. В течение 20 мин после добавления глицина центрифугировать при 5 000 х г в течение 30 с при 4 °С, поместить шарики на лед на 1 мин, чтобы гранулы выровнялись, и выбросить надосадочную жидкость.
    6. Добавьте 500 μл буфера для лизиса белка + PI в гель сродства эпитопной метки, приготовленный на шаге 4.2.5, и перемешайте, постукивая и инвертируя. Центрифугируйте при 5 000 x g в течение 30 с при 4 °C, поместите шарики на лед на 1 минуту, чтобы шарики выровнялись, и выбросьте надосадочную жидкость.
    7. Повторите шаг 4.2.6 трижды.
    8. Добавьте равный объем буфера для лизиса белка к гелю сродства эпитопов, чтобы приготовить суспензию геля-сродства эпитопов 1:1. Гелевая суспензия epitope tag affinity может храниться при температуре 4 °C в течение примерно 1 дня.

5. Предварительное очищение гелем с протеином G и захват белковых комплексов с помощью геля с аффинностью эпитопной метки

  1. Смешайте суспензию с содержанием белка G 1:1 (приготовленную на шаге 4) с помощью пипетки с отрезанным наконечником и добавьте в образец по 40 μл.
  2. Вращайте образец в течение 1 ч на ротаторе (см. таблицу материалов) примерно за 30 с за цикл в холодильной камере (4 °C).
  3. Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 20 с при 4 °C и поместите шарики на лед на 1 минуту, чтобы шарики выровнялись.
  4. Соберите надосадочную жидкость и перенесите ее в новую пробирку объемом 1,5 мл с низкой адсорбцией белка.
  5. Отделите образец для ввода от образца на шаге 5.4 и перенесите его в новую пробирку объемом 1,5 мл.
  6. Добавьте в образец 20-30 μл гелевой суспензии эпитопной метки 1:1.
  7. Вращаться на ротаторе в течение примерно 30 с за цикл в холодильной камере (4°С) в течение 2 ч.
  8. Добавьте буфер для образца на вход, приготовленный на шаге 5.5, чтобы разбавить его до 4x, и нагревайте при 98 °C в течение 10 минут. Вход может храниться при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за возможности деградации белка из-за замораживания и размораживания последующие шаги следует выполнять без максимального сохранения белка.

6. Промывка и элюирование осажденных белков

  1. Установите температуру теплоблока на 98 °C.
  2. Центрифугируйте при 5 000 x g в течение 30 с при 4 °C и подождите 1 мин на льду, чтобы гранулы выровнялись. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
  3. Добавьте 1 мл буфера для лизиса белка + PI и перемешайте, постукивая и инвертируя. Вращайте вращатель в течение примерно 30 с за цикл в холодильной камере (4 °C) в течение 5 минут. Центрифугируйте при 5 000 x g в течение 30 с при 4 °C, подождите 1 мин на льду, чтобы гранулы выровнялись, и выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Повторите шаг 6.3 5-10 раз.
  5. Добавьте 10 мкл буфера для образца к образцу, подготовленному на шаге 6.4. Варить при температуре 98 °C 10 мин.
  6. Центрифуга при 5 000 x g при 4°C в течение 30 с.
  7. Поместите колонку в новую пробирку с низкой адсорбцией белка и перенесите гель в колонку с помощью пипетки с отрезанным наконечником. Во избежание загрязнения геля используется колонка.
  8. Центрифуга при 9 730 x g в течение 1 мин при 4 °C. Соберите протекание. Образец можно хранить при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть опасения по поводу деградации образца, следующий иммуноблоттинг следует проводить без замораживания.

7. Иммуноблоттинг

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры иммуноблоттинга основаны на предыдущих отчетах 7,8.

  1. Загрузите целые образцы на полиакриламидный гель додецилсульфата натрия (SDS-PAGE, см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте гели с большими лунками, чтобы можно было перенести весь образец. Здесь использовались гели с лунками объемом 50 мкл.
  2. Поместите гели в камеру электрофореза и добавьте 1x буфер Tris/Glycine/SDS (см. Таблицу материалов) до соответствующего объема вокруг гелей.
  3. Электрофорезные гели при 100 В и 400 мА.
  4. Перенос на поливинилиденфторидные (PVDF, см . Таблицу материалов) мембраны.
  5. Блокируйте мембранные блотки PVDF 5% обезжиренным молоком в PBS-P на 1 ч при комнатной температуре.
  6. Трижды промыть мембрану PBS-P в шейкере на максимальной скорости в течение 5 минут. После этого выполните ту же процедуру при стирке.
  7. Инкубировать в течение ночи в шейкере с первичным антителом (см. Таблицу материалов) при 4 °C.
  8. На следующий день трижды промыть мембрану PBS-P.
  9. Инкубировать в течение 1 ч с вторичным антителом в шейкере при комнатной температуре.
    Если молекулярная масса белка-мишени близка к тяжелой цепи IgG, которая имеет молекулярную массу около 50 кДа, можно использовать вторичное антитело, специфичное для легкой цепи, чтобы избежать перекрытия полосы-мишени с тяжелой цепью IgG. В этом исследовании в качестве реагента для обнаружения ВП использовались антитела, специфичные к легкой цепи7 или Veriblot (см. Таблицу материалов).
  10. Идентификация полос белков с люминесцентными субстратами пероксидазы. Мембрану можно сохранить в PBS после двойной промывки PBS-P.
  11. Зачистите в течение 10 мин раствором для снятия изоляции (см. Таблицу материалов).
  12. Вымойте трижды и залейте 5% обезжиренным молоком в PBS-P. После этого протокол такой же, как и на шаге 7.6 и далее.

Результаты

Термогенные адипоциты, также известные как коричневые и бежевые адипоциты, обладают потенциальными эффектами против ожирения и непереносимости глюкозы. PR (PRD1-BF1-RIZ1 гомологичный) домен, содержащий 16 (PRDM16), является кофактором транскрипции, который играет важную роль в определении термог...

Обсуждение

Этот протокол почти похож на ранее опубликованные протоколы 5,7,14,15. Важным моментом этого протокола является то, что мы никогда не останавливаем эксперимент от этапа лизиса клетки до этапа иммунопреципитации. Деград?...

Раскрытие информации

Мы заявляем, что ни у одного из авторов нет конфликта интересов, связанного с этим исследованием.

Благодарности

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке (JSPS) Грант KAKENHI No 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant No 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant No 22K08672 (H.O.), исследовательский грант Японского диабетического общества для молодых исследователей (G.N.) и исследовательский грант MSD Life Science Foundation для молодых исследователей (G.N.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA (pH8.0)Nippon gene311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µLBiorad4561034
10x Tris/Glycine/SDSBiorad1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab SheepGE HealthcareNA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab DonkeyGE HealthcareNA934-1ML
Cell Scraper MSumitomo BakeliteMS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mmIWAKI4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementInvitrogen10565042
D-PBS (-)FUJIFILM Wako045-29795
GlycerolFUJIFILM Wako072-00626
GlycineFUJIFILM Wako077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724Cell SignalingC29F4
Laemmli Sample bufferBio-Rad Laboratories161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography ColumnsBiorad7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast GelsBiorad1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouseSigmaF3165
NaClFUJIFILM Wako191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16This paperN/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1This paperN/A
pcDNA3.1-vectorThis paperN/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine HydrochloridePSI24765
Penicillin-streptomycin solutionFUJIFILM Wako168-23191
Pierce BCA Protein Assay KitThermo scientific23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl EtherFUJIFILM Wako168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan MonolaurateFUJIFILM Wako167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab PacksCytiva17061801
Protein LoBind Tubeseppendorf30108442
ROTATOR RT-5TAITECRT-5
skim milkMorinaga0652842 
Stripping SolutionFUJIFILM Wako193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer PackBiorad1704156B03
Trans-Blot Turbo SystemBioradN/A
Trizma baseSigmaT1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30910.03
VeriblotAbcamab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970Cell Signaling4970S

Ссылки

  1. Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
  2. Yanagida, M. Functional proteomics; current achievements. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).
  3. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
  4. Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  5. Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
  6. Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
  7. Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143 (2023).
  8. Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584 (2015).
  9. Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
  10. Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
  11. Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
  12. Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674 (2023).
  13. Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
  14. Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569 (2022).
  15. Cristea, I. M., Chait, B. T. Affinity purification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  16. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  17. Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243 (2009).
  18. Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
  19. Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены