משקעים חיסוניים עם ג'ל זיקה נגד תג אפיטופ לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Summary

אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות להבהרת תפקודם של חלבוני המטרה, וקו-אימונומשקעים (co-IP) יכולים לאשר בקלות PPIs. הדבקנו באופן זמני פלסמיד המקודד חלבון מתויג אפיטופ לתאי HEK-293 ופיתחנו שיטת משקעים חיסוניים כדי לאשר בקלות את הקישור של שני חלבוני מטרה.

Abstract

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) ממלאות תפקיד מרכזי בתופעות ביולוגיות, כגון ארגון תאי, העברת אותות תוך תאיים וויסות שעתוק. לכן, הבנת PPIs היא נקודת התחלה חשובה לחקירה נוספת של תפקוד חלבון המטרה. במחקר זה, אנו מציעים שיטה פשוטה לקבוע את הקישור של שני חלבוני מטרה על ידי החדרת וקטורי ביטוי יונקים לתאי HEK-293 בשיטת פוליאתילנימין, הנחת התאים במאגר ליזה חלבוני תוצרת בית, ומשיכת חלבוני המטרה על ג'ל זיקה תג אפיטופ. בנוסף, ניתן לאשר את ה-PPI בין החלבונים השונים המאוחים של תג אפיטופ על ידי שימוש בנוגדני זיקה כנגד כל תג במקום בג'ל הזיקה של תג האפיטופ. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לאימות PPIs שונים, כולל תמציות גרעיניות, מקווי תאים אחרים. לכן, זה יכול לשמש כשיטה בסיסית במגוון רחב של ניסויי PPI. חלבונים מתפרקים על ידי מהלך זמן ממושך ומחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. לכן, ליזה תאים, immunoprecipitation, ו immunoblotting צריך להתבצע בצורה חלקה ככל האפשר.

Introduction

חלבונים ממלאים תפקיד מרכזי בכל תפקודי התא, כולל עיבוד מידע, חילוף חומרים, תחבורה, קבלת החלטות וארגון מבני. חלבונים מתווכים את תפקידיהם על ידי אינטראקציה פיזית עם מולקולות אחרות. אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) חשובות לתיווך תפקודים תאיים, כגון תיווך העברת אותות, חישת הסביבה, המרת אנרגיה לתנועה פיזית, ויסות הפעילות של אנזימי חילוף חומרים ואיתות ושמירה על ארגון תאי¹. לפיכך, ניתן להשתמש ב- PPIs כדי להבהיר פונקציות לא ידועות². ניתן לסווג שיטות לזיהוי PPIs לשלושה סוגים: in vitro, in vivo ו - in silico. Co-immunoprecipitation (co-IP), כרומטוגרפיית זיקה, טיהור זיקה טנדם, מערכי חלבונים, תצוגת פאגים, השל....

Protocol

איור 1 מציג סקירה כללית של הפרוטוקול.

1. הכנת פתרונות ומאגרים

1. מאגר ליזה חלבונית: הכן את מאגר ליזה החלבון בעקבות דוח⁷ שפורסם בעבר (טבלה 1).
2. Protein lysis buffer + protease inhibitor (PI): הוסף מעכב פרוטאז (ראה טבלת חומרים) למאגר שהוכן לעיל (שלב 1.1). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
3. מאגר דגימה: ערבבו 900 μL של 4x מאגר דגימה Laemmli (ראו טבלת חומרים) ו-100 μL של 2-מרקפטואתנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
4. מלח חוצץ פוספט (PBS) עם פוליאוקסאתילן (20) סורביטן מונולאורט (PBS-P): מערבבים 1.998....

תוצאות

לאדיפוציטים תרמוגניים, הידועים גם בשם אדיפוציטים חומים ובז ', יש השפעות פוטנציאליות נגד השמנת יתר ונגד אי סבילות לגלוקוז. PR (PRD1-BF1-RIZ1 הומולוגי) תחום המכיל 16 (PRDM16) הוא קו-פקטור שעתוק הממלא תפקיד חשוב בקביעת זהות אדיפוציט תרמוגנית ^9,10.

EHMT1 (euchromatic hist.......

Discussion

פרוטוקול זה הוא כמעט כמו פרוטוקולים 5,7,14,15 שדווחו בעבר. הנקודה החשובה של פרוטוקול זה היא שאנו אף פעם לא עוצרים את הניסוי משלב הליזה התאית לשלב המשקעים החיסוניים. פירוק חלבונים מעכב זיהוי PPI. מסלול זמן ממושך ומחזורי הקפאה-.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH8.0)	Nippon gene	311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL	Biorad	4561034
10x Tris/Glycine/SDS	Biorad	1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep	GE Healthcare	NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey	GE Healthcare	NA934-1ML
Cell Scraper M	Sumitomo Bakelite	MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm	IWAKI	4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Invitrogen	10565042
D-PBS (-)	FUJIFILM Wako	045-29795
Glycerol	FUJIFILM Wako	072-00626
Glycine	FUJIFILM Wako	077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724	Cell Signaling	C29F4
Laemmli Sample buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Biorad	7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels	Biorad	1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma	F3165
NaCl	FUJIFILM Wako	191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16	This paper	N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1	This paper	N/A
pcDNA3.1-vector	This paper	N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride	PSI	24765
Penicillin-streptomycin solution	FUJIFILM Wako	168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	FUJIFILM Wako	168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako	167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs	Cytiva	17061801
Protein LoBind Tubes	eppendorf	30108442
ROTATOR RT-5	TAITEC	RT-5
skim milk	Morinaga	0652842
Stripping Solution	FUJIFILM Wako	193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack	Biorad	1704156B03
Trans-Blot Turbo System	Biorad	N/A
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30910.03
Veriblot	Abcam	ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970	Cell Signaling	4970S