使用抗表位标签亲和凝胶进行免疫沉淀以研究蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用对于阐明靶蛋白的功能非常重要，免疫共沉淀 （co-IP） 可以很容易地确认 PPI。我们将编码表位标记蛋白的质粒瞬时转染到 HEK-293 细胞中，并开发了一种免疫沉淀方法，以轻松确认两种靶蛋白的结合。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 在细胞组织、细胞内信号转导和转录调控等生物现象中起着关键作用。因此，了解PPIs是进一步研究靶蛋白功能的重要起点。在这项研究中，我们提出了一种简单的方法来确定两种靶蛋白的结合，方法是使用聚乙烯亚胺方法将哺乳动物表达载体引入 HEK-293 细胞中，在自制的蛋白质裂解缓冲液中裂解细胞，并将目标蛋白拉下表位标签亲和凝胶上。此外，可以使用针对每个标签的亲和抗体而不是表位标签亲和凝胶来确认各种表位标签融合蛋白之间的PPI。该协议还可用于验证来自其他细胞系的各种PPI，包括核提取物。因此，它可以作为各种PPI实验中的基本方法。蛋白质通过延长的时间进程和反复的冻融循环来降解。因此，细胞裂解、免疫沉淀和免疫印迹应尽可能无缝地进行。

引言

蛋白质在所有细胞功能中起着重要作用，包括信息处理、新陈代谢、运输、决策和结构组织。蛋白质通过与其他分子的物理相互作用来介导其功能。蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 对于介导细胞功能很重要，例如介导信号转导、感知环境、将能量转化为物理运动、调节代谢和信号酶的活动以及维持细胞组织¹。因此，PPI 可用于阐明未知功能²。PPIs的检测方法可分为 体外、 体内和 计算机三种类型。免疫共沉淀 （co-IP）、亲和色谱、串联亲和纯化、蛋白质阵列、噬菌体展示、蛋白质片段互补、X 射线晶体学和核磁共振波谱已用于 体外 PPI 检测³。在这些方法中，co-IP因其简单性而被广泛使用。

融合标签 FLAG 由八个氨基酸 （AspTyrLysAspAspAspAspLys： DYKDDDDK） 组成，包括一个肠激酶切割位点，专为免疫亲和色谱⁴ 而设计。使用抗 DYKDDDDK 抗体识别和捕获带 DYKDDDDK 标签的蛋白质。因此，使用 DYKDDDDK 结合琼脂糖珠⁵ 有效地拉低它们，以简单的方式确认它们与特定蛋白质的结合。免疫沉淀可以在多种细胞中进行，并且可以使用针对目标蛋白的抗体来确认各种 PPI。免疫沉淀和用抗 DYKDDDDK 琼脂糖微球洗脱肽已有先前的报道⁵.

在这里，我们提供了一种简单的免疫沉淀方法，其中将编码 DYKDDDDK 标记的蛋白质的质粒瞬时引入 HEK-293 细胞中，以确认两种目标蛋白质的关联。某些 DYKDDDDK 抗体可以与融合蛋白的 N 端和 C 端结合，但不能与其他⁶ 结合。因此，为避免混淆，应选择能够识别融合到 N 端和 C 端的标签的抗体。插入表位标签时，可以通过在表位标签和靶蛋白之间插入 3 至 12 个碱基对来避免蛋白质的构象变化。但是，插入的序列应该是 3 的倍数的碱基对，以避免帧偏移。

研究方案

图 1 显示了该协议的概述。

1. 溶液和缓冲液的制备

1. 蛋白裂解缓冲液：按照先前^{发表的报告7} （表1）制备蛋白裂解缓冲液。
2. 蛋白裂解缓冲液+蛋白酶抑制剂（PI）：将蛋白酶抑制剂（见 材料表）加入上述制备的缓冲液（步骤1.1）中。储存在-20°C。
3. 样品缓冲液：混合 900 μL 4x Laemmli 样品缓冲液（参见 材料表）和 100 μL 2-巯基乙醇。储存在-20°C。
4. 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 与聚氧乙烯 （20） 脱水山梨糖醇单月桂酸酯 （PBS-P）：混合 1.998 L PBS 和 2 mL 聚氧乙烯 （20） 脱水山梨糖醇单月桂酸酯（参见 材料表）。在室温下储存。
5. 1x Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液：混合 450 mL DDW 和 50 mL 10x Tris/甘氨酸/SDS。使用当天在室温下准备。

2. 质粒转染

1. 使用含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素（10,000 单位/mL 青霉素 G 和 10,000 μg/mL 链霉素）的 Dulbecco 改良鹰培养基在 10 cm 胶原包被培养皿中培养 HEK-293 细胞至亚汇合 （80%-95%）（参见 材料表）。
2. 每个培养皿制备 1-10 μg 要转染的质粒⁷ 并制备转染混合物。加入 150 mM NaCl 至每个培养皿的最终体积为 250 μL。涡旋并旋转混合物。
3. 每个培养皿加入 60 μL 1 mg/mL 聚乙烯亚胺 （PEI，参见 材料表），然后加入 150 mM NaCl 至最终体积为 250 μL PEI 溶液。
4. 将 PEI 溶液加入转染混合物中，制成混合溶液。立即涡旋（以最高速度 3-5 秒，此后执行相同的操作）并下降。
5. 在室温下孵育 15-30 分钟。在此期间，更换HEK-293细胞的培养基。
6. 在 HEK-293 细胞培养皿中撒上 500 μL/培养皿的混合溶液，并孵育过夜 （13-14 小时）。
7. 第二天进行培养基交换。

3. 细胞裂解和样品制备

注意：为避免蛋白质降解，应尽可能在不保存或冻融样品的情况下执行后续步骤。

1. 转染后约 48 小时，用冰冷的 PBS 洗涤细胞三次，加入 500 μL/培养皿的蛋白质裂解缓冲液 + PI，并通过细胞刮刀和移液管将细胞收集在冰上低蛋白吸附的试管中。
2. 每 5 分钟涡旋一次，并将样品在冰上孵育 10 分钟。
3. 在4°C下以16,400× g 离心10分钟。 收集上清液并将其转移到低蛋白吸附的新鲜 1.5 mL 管中。样品可以储存在-80°C。
4. 根据制造商的协议，使用蛋白质浓度测量套件确定样品的蛋白质浓度（参见 材料表）。
5. 在每个样品中分离 200-1000 μg 相同量的蛋白质，然后加入蛋白质裂解缓冲液 + PI 以调节总体积至 500-1000 μL。
   注意：以下步骤是在冰上执行的。

4.浆料的制备

注：在免疫沉淀前一天或当天制备 1：1 的蛋白 G 凝胶和表位标签亲和凝胶浆液。

1. 蛋白质G凝胶的制备
   1. 使用末端切断的吸头，充分混合，然后分离蛋白质 G 凝胶（参见 材料表），使每个样品制备 20 μL 珠子。
   2. 在4°C下以12,000× g 离心20秒，并将珠子置于冰上1分钟以使珠子趋平。用移液管弃去上清液。
   3. 将 1 mL 蛋白裂解缓冲液 + PI 加入步骤 4.1.2 制备的蛋白 G 凝胶中，并通过敲击和倒置进行混合。在4°C下以12,000× g 离心20秒，将珠子放在冰上1分钟以使珠子趋平，并弃去上清液。
   4. 重复步骤 4.1.3 三次。
   5. 向蛋白 G 凝胶中加入等体积的蛋白裂解缓冲液，制成 1：1 的蛋白 G 凝胶浆液。蛋白G凝胶浆液可以在4°C下储存约1天。
2. 表位标签亲和凝胶的制备
   1. 使用末端切断的吸头充分搅拌，然后分离表位标签亲和凝胶（参见 材料表），使每个样品制备 10-15 μL 珠子。
   2. 在4°C下以5,000× g 离心30秒，并在冰上等待1分钟以使珠子趋于平坦。用移液管弃去上清液。
   3. 将 1 mL 蛋白裂解缓冲液 + PI 加入步骤 4.2.2 中制备的表位标签亲和凝胶中，并通过敲击和倒置进行混合。在4°C下以5,000× g 离心30秒，将珠子置于冰上1分钟以使珠子趋平，并用移液管弃去上清液。
   4. 重复步骤 4.2.3 两次。
   5. 将 500 μL 0.1 M 甘氨酸 （pH 3.5） 加入到步骤 4.2.4 中制备的表位标签亲和凝胶中，并通过敲击和倒置混合。执行此步骤以去除游离表位标签抗体。在加入甘氨酸后20分钟内，在4°C下以5,000× g 离心30秒，将珠子置于冰上1分钟以使珠子趋平，并弃去上清液。
   6. 将 500 μL 蛋白裂解缓冲液 + PI 加入步骤 4.2.5 制备的表位标签亲和凝胶中，并通过敲击和倒置混合。在4°C下以5,000× g 离心30秒，将珠子置于冰上1分钟以使珠子趋平，并弃去上清液。
   7. 重复步骤 4.2.6 三次。
   8. 向表位标签亲和凝胶中加入等体积的蛋白质裂解缓冲液，以制备 1：1 表位标签亲和凝胶浆液。表位标签亲和凝胶浆液可在4°C下储存约1天。

5. 用蛋白 G 凝胶预透明化并使用表位标签亲和凝胶捕获蛋白质复合物

1. 将 1：1 蛋白 G 浆液（在步骤 4 中制备）与装有切割吸头的移液管混合，一次向样品中加入 40 μL。
2. 在冷藏室（4°C）中，将样品在旋转器（参见 材料表）上旋转1小时，每个周期约30秒。
3. 在4°C下以12,000× g 离心20秒，并将珠子置于冰上1分钟以使珠子趋平。
4. 收集上清液并将其转移到低蛋白吸附的新 1.5 mL 管中。
5. 在步骤 5.4 中将用于输入的样品与样品分离，并将其转移到新的 1.5 mL 管中。
6. 向样品中加入 20-30 μL 1：1 表位标签凝胶浆液。
7. 在冷藏室（4°C）中每个周期在旋转器上旋转约30秒2小时。
8. 将样品缓冲液添加到步骤5.5中制备的输入中，将其稀释至4x，并在98°C下加热10分钟。输入可以存储在 -80 °C 下。
   注意：由于冻融可能导致蛋白质降解，因此应在不尽可能保留蛋白质的情况下执行后续步骤。

6. 洗涤和洗脱沉淀的蛋白质

1. 将加热块的温度设置为 98 °C。
2. 在4°C下以5,000× g 离心30秒，并在冰上等待1分钟以使珠子趋于平坦。用移液管弃去上清液。
3. 加入 1 mL 蛋白裂解缓冲液 + PI，通过敲击和倒置进行混合。在冷藏室（4°C）中，每个周期在旋转器上旋转约30秒5分钟。在4°C下以5,000× g 离心30秒，在冰上等待1分钟以使珠子趋平，并弃去上清液。
4. 重复步骤 6.3 5-10 次。
5. 向步骤 6.4 中制备的样品中加入 10 μL 样品缓冲液。在98°C下煮沸10分钟。
6. 在4°C下以5,000× g 离心30秒。
7. 将色谱柱置于蛋白质吸附率低的新管中，并使用带有切割尖端的移液管将凝胶转移到色谱柱中。使用色谱柱来避免凝胶污染。
8. 在4°C下以9,730× g 离心1分钟。 收集流出物。样品可以储存在-80°C。
   注意：如果担心样品降解，则应在不冷冻的情况下进行以下免疫印迹。

7. 免疫印迹

注：免疫印迹程序基于以前的报告 ^7,8。

1. 将整个样品加载到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE，参见 材料表）上。
   注意：如有必要，请使用大孔凝胶，以便可以转移整个样品。此处使用具有 50 μL 孔的凝胶。
2. 将凝胶置于电泳室中，并加入1x Tris /甘氨酸/ SDS缓冲液（参见 材料表）至凝胶周围的适当体积。
3. 100 V 和 400 mA 的电泳凝胶。
4. 转移到聚偏二氟乙烯（PVDF，见 材料表）膜上。
5. 在室温下用5%脱脂牛奶在PBS-P中封闭PVDF膜印迹1小时。
6. 在振荡器上用PBS-P以最高速度洗涤膜三次，持续5分钟。此后洗涤时执行相同的步骤。
7. 在4°C下与一抗（参见 材料表）一起在振荡器上孵育过夜。
8. 第二天用PBS-P洗涤膜三次。
9. 在室温下将二抗与二抗在振荡器上孵育 1 小时。
   注：如果靶蛋白的分子量接近 IgG 重链，其分子量约为 50 kDa，则可以使用轻链特异性二抗来避免靶带与 IgG 重链重叠。本研究使用轻链特异性抗体⁷ 或 Veriblot 作为 IP 检测试剂（参见 材料表）。
10. 鉴定具有过氧化物酶发光底物的蛋白质条带。膜用PBS-P洗涤两次后，可保存在PBS中。
11. 用剥离溶液剥离 10 分钟（参见 材料表）。
12. 洗涤三次，并用 5% 脱脂牛奶在 PBS-P 中块状。此后的协议与步骤 7.6 开始的协议相同。

结果

生热脂肪细胞，也称为棕色和米色脂肪细胞，具有潜在的抗肥胖和抗葡萄糖不耐受作用。PR （PRD1-BF1-RIZ1 homologous） 结构域 16 （PRDM16） 是一种转录辅因子，在确定产热脂肪细胞身份中起重要作用 ^9,10。

EHMT1（常染色体组蛋白-赖氨酸 N-甲基转移酶 1），也称为 GLP，主要使用辅因子 S-腺苷甲硫氨酸¹¹ 催化?...

讨论

该协议几乎与先前报告的协议^5,7,14,15相似。该协议的重要一点是，我们从未停止从细胞裂解步骤到免疫沉淀步骤的实验。蛋白质降解会阻碍 PPI 检测。延长的时间进程和反复的冻融循环会降解蛋白质。SDS-PAGE中的电泳也应在免疫沉淀的同一天进行，这不仅可以最大限度地减少蛋白质降解，还可以最大限...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH8.0)	Nippon gene	311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL	Biorad	4561034
10x Tris/Glycine/SDS	Biorad	1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep	GE Healthcare	NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey	GE Healthcare	NA934-1ML
Cell Scraper M	Sumitomo Bakelite	MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm	IWAKI	4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Invitrogen	10565042
D-PBS (-)	FUJIFILM Wako	045-29795
Glycerol	FUJIFILM Wako	072-00626
Glycine	FUJIFILM Wako	077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724	Cell Signaling	C29F4
Laemmli Sample buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Biorad	7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels	Biorad	1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma	F3165
NaCl	FUJIFILM Wako	191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16	This paper	N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1	This paper	N/A
pcDNA3.1-vector	This paper	N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride	PSI	24765
Penicillin-streptomycin solution	FUJIFILM Wako	168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	FUJIFILM Wako	168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako	167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs	Cytiva	17061801
Protein LoBind Tubes	eppendorf	30108442
ROTATOR RT-5	TAITEC	RT-5
skim milk	Morinaga	0652842
Stripping Solution	FUJIFILM Wako	193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack	Biorad	1704156B03
Trans-Blot Turbo System	Biorad	N/A
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30910.03
Veriblot	Abcam	ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970	Cell Signaling	4970S