Immunpräzipitation mit einem Anti-Epitop-Tag-Affinitätsgel zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für die Aufklärung der Funktion von Zielproteinen, und die Co-Immunpräzipitation (co-IP) kann PPIs leicht bestätigen. Wir transfizierten transient ein Plasmid, das für ein Epitop-markiertes Protein kodiert, in HEK-293-Zellen und entwickelten eine Immunpräzipitationsmethode, um die Bindung von zwei Zielproteinen einfach zu bestätigen.

Zusammenfassung

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) spielen eine zentrale Rolle bei biologischen Phänomenen wie der zellulären Organisation, der intrazellulären Signaltransduktion und der Transkriptionsregulation. Daher ist das Verständnis von PPIs ein wichtiger Ausgangspunkt für die weitere Untersuchung der Funktion des Zielproteins. In dieser Studie schlagen wir eine einfache Methode vor, um die Bindung von zwei Zielproteinen zu bestimmen, indem wir Säugetier-Expressionsvektoren mit der Polyethylenimin-Methode in HEK-293-Zellen einführen, die Zellen in hausgemachtem Proteinlysepuffer lysieren und die Zielproteine auf einem Epitop-Tag-Affinitätsgel herunterziehen. Darüber hinaus kann der PPI zwischen den verschiedenen mit Epitop-Tags fusionierten Proteinen bestätigt werden, indem Affinitätsantikörper gegen jeden Tag anstelle des Epitop-Tag-Affinitätsgels verwendet werden. Dieses Protokoll könnte auch verwendet werden, um verschiedene PPIs, einschließlich Kernextrakte, aus anderen Zelllinien zu verifizieren. Daher kann es als Basismethode in einer Vielzahl von PPI-Experimenten verwendet werden. Proteine werden durch einen verlängerten Zeitverlauf und wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen abgebaut. Daher sollten Zelllyse, Immunpräzipitation und Immunblotting so nahtlos wie möglich durchgeführt werden.

Einleitung

Proteine spielen eine wichtige Rolle bei allen zellulären Funktionen, einschließlich der Informationsverarbeitung, des Stoffwechsels, des Transports, der Entscheidungsfindung und der strukturellen Organisation. Proteine vermitteln ihre Funktionen, indem sie physikalisch mit anderen Molekülen interagieren. Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind wichtig für die Vermittlung zellulärer Funktionen, wie z. B. die Vermittlung der Signaltransduktion, die Wahrnehmung der Umgebung, die Umwandlung von Energie in körperliche Bewegung, die Regulierung der Aktivität von Stoffwechsel- und Signalenzymen und die Aufrechterhaltung der zellulären Organisation¹. So können PPIs verwendet werden, um unbekannte Funktionen aufzuklären². Die Methoden zum Nachweis von PPI können in drei Typen eingeteilt werden: in vitro, in vivo und in silico. Für den In-vitro-PPI-Nachweis wurden Co-Immunpräzipitation (co-IP), Affinitätschromatographie, Tandem-Affinitätsreinigung, Proteinarrays, Phagen-Display, Proteinfragment-Komplementierung, Röntgenkristallographie und Kernspinresonanzspektroskopie eingesetzt³. Unter diesen Methoden ist Co-IP aufgrund seiner Einfachheit weit verbreitet.

Der Fusionstag FLAG besteht aus acht Aminosäuren (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), einschließlich einer Enterokinase-Spaltstelle, und wurde speziell für die Immunaffinitätschromatographie^{entwickelt 4}. DYKDDDDDK-markierte Proteine werden mit einem Anti-DYKDDDDK-Antikörper erkannt und eingefangen. Daher werden sie unter Verwendung von DYCDDDDK-bindenden Agarosekügelchen⁵ effizient abgebaut, um ihre Bindung an spezifische Proteine auf einfache Weise zu bestätigen. Die Immunpräzipitation kann in einer Vielzahl von Zellen durchgeführt werden, und eine breite Palette von PPIs kann mit Antikörpern gegen das interessierende Protein bestätigt werden. Immunpräzipitation und Peptidelution mit Anti-DYKDDDDK Agarosekügelchen wurden bereits berichtet⁵.

Hier stellen wir eine einfache Immunpräzipitationsmethode vor, bei der ein Plasmid, das für ein DYKDDDDDK-markiertes Protein kodiert, transient in HEK-293-Zellen eingeführt wird, um die Assoziation zweier Proteine von Interesse zu bestätigen. Bestimmte DYKDDDDK Antikörper können sowohl an den N-Terminus als auch an den C-Terminus der Fusionsproteine binden, andere jedoch nicht⁶. Um Verwechslungen zu vermeiden, sollte daher der Antikörper gewählt werden, der den Tag erkennt, der sowohl mit dem N- als auch mit dem C-Terminus fusioniert ist. Beim Einfügen eines Epitop-Tags kann es möglich sein, Konformationsänderungen im Protein zu vermeiden, indem 3 bis 12 Basenpaare zwischen dem Epitop-Tag und dem Zielprotein eingefügt werden. Die eingefügte Sequenz sollte jedoch ein Basenpaar in Vielfachen von 3 sein, um Frameshift zu vermeiden.

Protokoll

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über das Protokoll.

1. Herstellung von Lösungen und Puffern

1. Proteinlysepuffer: Bereiten Sie den Proteinlysepuffer nach einem zuvor veröffentlichten Bericht^{vor 7} (Tabelle 1).
2. Proteinlysepuffer + Proteaseinhibitor (PI): Geben Sie den Proteaseinhibitor (siehe Materialtabelle) zu dem oben vorbereiteten Puffer (Schritt 1.1). Bei -20 °C lagern.
3. Probenpuffer: Mischen Sie 900 μl 4x Laemmli Probenpuffer (siehe Materialtabelle) und 100 μl 2-Mercaptoethanol. Bei -20 °C lagern.
4. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Polyoxyethylen (20)-sorbitanmonolaurat (PBS-P): Mischen Sie 1,998 l PBS und 2 mL Polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurat (siehe Materialtabelle). Bei Raumtemperatur lagern.
5. 1x Tris/Glycin/SDS-Puffer: Mischen Sie 450 mL DDW und 50 mL 10x Tris/Glycin/SDS. Am Tag der Anwendung bei Raumtemperatur zubereiten.

2. Transfektion von Plasmiden

1. Kultivieren Sie HEK-293-Zellen in einer 10 cm dicken, mit Kollagen beschichteten Schale zur Subkonfluenz (80 %-95 %) unter Verwendung des modifizierten Adlermediums von Dulbecco, das 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin (10.000 Einheiten/ml Penicillin G und 10.000 μg/ml Streptomycin) enthält (siehe Materialtabelle).
2. Pro Schale werden 1-10 μg Plasmid⁷ für die Transfizierung vorbereitet und eine Transfektionsmischung hergestellt. 150 mM NaCl zu einem Endvolumen von 250 μl pro Schale hinzufügen. Die Mischung verwirbeln und herunterschleudern.
3. 60 μl 1 mg/ml Polyethylenimin (PEI, siehe Materialtabelle) pro Schale, gefolgt von 150 mM NaCl zu einem Endvolumen von 250 μl PEI-Lösung.
4. Fügen Sie die PEI-Lösung zur Transfektionsmischung hinzu, um eine gemischte Lösung herzustellen. Sofort wirbeln (bei Höchstgeschwindigkeit für 3-5 s, danach das Gleiche tun) und nach unten drehen.
5. Bei Raumtemperatur 15-30 min inkubieren. Wechseln Sie während dieser Zeit das Medium der HEK-293-Zellen.
6. 500 μl/Schale mit gemischter Lösung über die Schale der HEK-293-Zellen streuen und über Nacht (13-14 h) inkubieren.
7. Führen Sie am nächsten Tag einen Medienaustausch durch.

3. Zelllyse und Probenvorbereitung

HINWEIS: Um einen Proteinabbau zu vermeiden, sollten die nachfolgenden Schritte so weit wie möglich ohne Konservierung oder Gefrier- und Auftauen der Probe durchgeführt werden.

1. Etwa 48 Stunden nach der Transfektion waschen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS, fügen Sie 500 μl/Schale Proteinlysepuffer + PI hinzu und sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und einer Pipette in einem Röhrchen mit geringer Proteinadsorption auf Eis.
2. Alle 5 Minuten einen Vortex durchführen und die Proben 10 Minuten lang auf Eis inkubieren.
3. Zentrifugieren bei 16.400 x g für 10 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand und überführen Sie ihn in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen mit geringer Proteinadsorption. Die Proben können bei -80 °C gelagert werden.
4. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Proben mit einem Proteinkonzentrationsmesskit gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle).
5. Trennen Sie 200-1000 μg der gleichen Proteinmenge in jeder Probe und fügen Sie dann Proteinlysepuffer + PI hinzu, um das Gesamtvolumen auf 500-1000 μl einzustellen.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte werden auf Eis durchgeführt.

4. Vorbereitung der Gülle

HINWEIS: Bereiten Sie am Tag vor oder am Tag der Immunpräzipitation eine 1:1-Aufschlämmung aus Protein-G-Gel und Epitop-Tag-Affinitätsgel vor.

1. Vorbereitung eines Protein-G-Gels
   1. Mit einer Spitze, deren Ende abgeschnitten ist, gut mischen und dann das Protein-G-Gel (siehe Materialtabelle) so trennen, dass 20 μl Kügelchen pro Probe hergestellt werden.
   2. Bei 12.000 x g für 20 s bei 4 °C zentrifugieren und die Kügelchen 1 min auf Eis legen, damit sich die Kügelchen einpendeln können. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
   3. 1 ml Proteinlysepuffer + PI zu dem in Schritt 4.1.2 hergestellten Protein-G-Gel geben und durch Klopfen und Invertieren mischen. Bei 12.000 x g für 20 s bei 4 °C zentrifugieren, die Kügelchen 1 min lang auf Eis legen, damit sich die Kügelchen einpendeln können, und den Überstand entsorgen.
   4. Wiederholen Sie Schritt 4.1.3 dreimal.
   5. Fügen Sie dem Protein-G-Gel ein gleiches Volumen Proteinlysepuffer hinzu, um eine 1:1-Protein-G-Gel-Aufschlämmung herzustellen. Die Protein-G-Gel-Aufschlämmung kann bei 4 °C für ca. 1 Tag gelagert werden.
2. Herstellung eines Epitop-Tag-Affinitätsgels
   1. Mit einer Spitze, bei der das Ende abgeschnitten ist, gut rühren und dann das Epitop-Tag-Affinitätsgel (siehe Materialtabelle) so trennen, dass 10-15 μl Kügelchen pro Probe hergestellt werden.
   2. Bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren und 1 min auf Eis warten, damit sich die Kügelchen einpendeln können. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
   3. 1 ml Proteinlysepuffer + PI zu dem in Schritt 4.2.2 hergestellten Epitop-Tag-Affinitätsgel geben und durch Klopfen und Invertieren mischen. Bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren, die Kügelchen 1 min lang auf Eis legen, damit die Kügelchen sich einpendeln können, und den Überstand mit einer Pipette entsorgen.
   4. Wiederholen Sie Schritt 4.2.3 zweimal.
   5. 500 μl 0,1 M Glycin (pH 3,5) zu dem in Schritt 4.2.4 hergestellten Epitop-Tag-Affinitätsgel geben und durch Klopfen und Invertieren mischen. Dieser Schritt wird durchgeführt, um freie Epitop-Tag-Antikörper zu entfernen. Innerhalb von 20 Minuten nach der Zugabe von Glycin bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren, die Kügelchen 1 min lang auf Eis legen, damit sich die Kügelchen einpendeln können, und den Überstand verwerfen.
   6. 500 μl Proteinlysepuffer + PI zu dem in Schritt 4.2.5 hergestellten Epitop-Tag-Affinitätsgel geben und durch Klopfen und Invertieren mischen. Zentrifugieren Sie bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C, legen Sie die Kügelchen 1 Minute lang auf Eis, damit sich die Kügelchen einpendeln können, und entsorgen Sie den Überstand.
   7. Wiederholen Sie Schritt 4.2.6 dreimal.
   8. Geben Sie ein gleiches Volumen Proteinlysepuffer in das Epitop-Tag-Affinitätsgel, um eine 1:1-Epitop-Tag-Affinitätsgel-Aufschlämmung herzustellen. Die Epitop-Tag-Affinitätsgel-Aufschlämmung kann bei 4 °C für ca. 1 Tag gelagert werden.

5. Preclearing mit dem Protein G-Gel und Einfangen von Proteinkomplexen mit dem Epitop-Tag-Affinitätsgel

1. Mischen Sie die in Schritt 4 hergestellte 1:1-Protein-G-Aufschlämmung mit einer Pipette mit abgeschnittener Spitze und geben Sie jeweils 40 μl in die Probe.
2. Die Probe wird 1 h lang auf einem Rotator (siehe Materialtabelle) in einer Kühlkammer (4 °C) in ca. 30 s pro Zyklus gedreht.
3. Bei 12.000 x g für 20 s bei 4 °C zentrifugieren und die Kügelchen 1 min auf Eis legen, damit sich die Kügelchen einpendeln können.
4. Sammeln Sie den Überstand und überführen Sie ihn in ein neues 1,5-ml-Röhrchen mit geringer Proteinadsorption.
5. Trennen Sie die Probe für die Eingabe von der Probe in Schritt 5.4 und überführen Sie sie in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
6. Geben Sie 20-30 μl 1:1-Epitop-Tag-Gel-Slurry in die Probe.
7. Auf einem Rotator ca. 30 s pro Zyklus in einer Kühlkammer (4 °C) für 2 h drehen.
8. Dem in Schritt 5.5 vorbereiteten Input Probenpuffer zugeben, ihn auf 4x zu verdünnen, und 10 min bei 98 °C erhitzen. Der Eingang kann bei -80 °C gelagert werden.
   HINWEIS: Aufgrund der Möglichkeit eines Proteinabbaus durch Einfrieren und Auftauen sollten nachfolgende Schritte durchgeführt werden, ohne das Protein so weit wie möglich zu erhalten.

6. Waschen und Eluieren der gefällten Proteine

1. Stellen Sie die Temperatur des Heizblocks auf 98 °C ein.
2. Bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren und 1 min auf Eis warten, damit sich die Kügelchen einpendeln können. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
3. 1 ml Proteinlysepuffer + PI zugeben und durch Klopfen und Invertieren mischen. Auf einem Rotator ca. 30 s pro Zyklus in einer Kühlkammer (4 °C) für 5 min drehen. Zentrifugieren Sie bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C, warten Sie 1 Minute auf Eis, damit sich die Kügelchen einpendeln können, und entsorgen Sie den Überstand.
4. Wiederholen Sie Schritt 6.3 5-10 Mal.
5. 10 μl Probenpuffer werden zu der in Schritt 6.4 vorbereiteten Probe gegeben. Bei 98 °C 10 Min. kochen lassen.
6. Zentrifugieren bei 5.000 x g bei 4 °C für 30 s.
7. Setzen Sie eine Säule in ein neues Röhrchen mit geringer Proteinadsorption ein und übertragen Sie das Gel mit einer Pipette mit abgeschnittener Spitze auf die Säule. Eine Säule wird verwendet, um eine Kontamination des Gels zu vermeiden.
8. Zentrifugieren bei 9.730 x g für 1 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Durchfluss. Die Probe kann bei -80 °C gelagert werden.
   HINWEIS: Wenn der Probenabbau ein Problem darstellt, sollte die folgende Immunoblotting ohne Einfrieren durchgeführt werden.

7. Immunoblottierung

HINWEIS: Immunoblotting-Verfahren basieren auf früheren Berichten ^7,8.

1. Laden Sie ganze Proben auf ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE, siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf Big-Well-Gele, damit die gesamte Probe übertragen werden kann. Hier kamen Gele mit 50 μL Wells zum Einsatz.
2. Setzen Sie die Gele in die Elektrophoresekammer und fügen Sie 1x Tris/Glycin/SDS-Puffer (siehe Materialtabelle) bis zum entsprechenden Volumen um die Gele herum hinzu.
3. Elektrophorese-Gele bei 100 V und 400 mA.
4. Auf Membranen aus Polyvinylidenfluorid (PVDF, siehe Materialtabelle) übertragen.
5. Blockieren Sie die PVDF-Membranblots mit 5 % Magermilch in PBS-P für 1 h bei Raumtemperatur.
6. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBS-P auf einem Shaker bei Höchstgeschwindigkeit für 5 Minuten. Führen Sie danach beim Waschen den gleichen Vorgang durch.
7. Über Nacht auf einem Shaker mit dem Primärantikörper (siehe Materialtabelle) bei 4 °C inkubieren.
8. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal mit PBS-P.
9. 1 h lang mit dem Sekundärantikörper auf einem Shaker bei Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Wenn das Molekulargewicht des Zielproteins nahe an der IgG-Schwerkette liegt, die ein Molekulargewicht von etwa 50 kDa hat, kann ein leichter kettenspezifischer Sekundärantikörper verwendet werden, um eine Überlappung der Zielbande mit der IgG-Schwerkette zu vermeiden. In dieser Studie wurden leichtkettenspezifische Antikörper⁷ oder Veriblot als IP-Nachweisreagenz verwendet (siehe Materialtabelle).
10. Identifizieren Sie Proteinbanden mit Peroxidase-lumineszierenden Substraten. Die Membran kann nach zweimaligem Waschen mit PBS-P in PBS gespeichert werden.
11. 10 min lang mit einer Abbeizlösung abstreifen (siehe Materialtabelle).
12. Dreimal waschen und mit 5 % Magermilch in PBS-P verschließen. Das Protokoll danach ist das gleiche wie in Schritt 7.6 und höher.

Ergebnisse

Thermogene Adipozyten, auch bekannt als braune und beige Adipozyten, haben potenzielle Wirkungen gegen Fettleibigkeit und Glukoseintoleranz. PR (PRD1-BF1-RIZ1 homolog) domänenhaltiges 16 (PRDM16) ist ein Transkriptionscofaktor, der eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der thermogenen Adipozytenidentität spielt ^9,10.

EHMT1 (euchromatische Histon-Lysin-N-Methyltransferase 1), auch bekannt als GLP, katalysiert primär die Mon...

Diskussion

Dieses Protokoll ist fast wie die zuvor berichteten Protokolle 5,7,14,15. Der wichtige Punkt dieses Protokolls ist, dass wir das Experiment nie vom Schritt der Zelllyse bis zum Schritt der Immunpräzipitation stoppen. Der Proteinabbau behindert den PPI-Nachweis. Ein verlängerter Zeitverlauf und wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen bauen Proteine ab. Die Elektrophorese in SDS-PAGE sollte ebenfalls am...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH8.0)	Nippon gene	311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL	Biorad	4561034
10x Tris/Glycine/SDS	Biorad	1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep	GE Healthcare	NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey	GE Healthcare	NA934-1ML
Cell Scraper M	Sumitomo Bakelite	MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm	IWAKI	4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Invitrogen	10565042
D-PBS (-)	FUJIFILM Wako	045-29795
Glycerol	FUJIFILM Wako	072-00626
Glycine	FUJIFILM Wako	077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724	Cell Signaling	C29F4
Laemmli Sample buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Biorad	7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels	Biorad	1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma	F3165
NaCl	FUJIFILM Wako	191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16	This paper	N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1	This paper	N/A
pcDNA3.1-vector	This paper	N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride	PSI	24765
Penicillin-streptomycin solution	FUJIFILM Wako	168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	FUJIFILM Wako	168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako	167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs	Cytiva	17061801
Protein LoBind Tubes	eppendorf	30108442
ROTATOR RT-5	TAITEC	RT-5
skim milk	Morinaga	0652842
Stripping Solution	FUJIFILM Wako	193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack	Biorad	1704156B03
Trans-Blot Turbo System	Biorad	N/A
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30910.03
Veriblot	Abcam	ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970	Cell Signaling	4970S