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요약

단백질-단백질 상호작용은 표적 단백질의 기능을 규명하는 데 중요하며, co-IP(co-immunoprecipitation)를 통해 PPI를 쉽게 확인할 수 있습니다. 에피토프 태그 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 HEK-293 세포에 임시로 transfection하고 두 타겟 단백질의 결합을 쉽게 확인할 수 있는 면역침전 방법을 개발했습니다.

초록

단백질-단백질 상호 작용(PPI)은 세포 조직, 세포 내 신호 전달 및 전사 조절과 같은 생물학적 현상에서 중추적인 역할을 합니다. 따라서 PPI를 이해하는 것은 표적 단백질의 기능에 대한 추가 연구를 위한 중요한 출발점입니다. 본 연구에서는 폴리에틸렌이민 방법을 사용하여 HEK-293 세포에 포유류 발현 벡터를 도입하고, 집에서 만든 단백질 용해 완충액에서 세포를 용해하고, 에피토프 태그 친화성 겔에서 표적 단백질을 끌어내려 두 표적 단백질의 결합을 결정하는 간단한 방법을 제안합니다. 또한, 다양한 에피토프 태그 융합 단백질 간의 PPI는 에피토프 태그 친화성 겔 대신 각 태그에 대한 친화성 항체를 사용하여 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 세포주에서 핵 추출물을 포함한 다양한 PPI를 검증하는 데에도 사용할 수 있습니다. 따라서 다양한 PPI 실험에서 기본 방법으로 사용할 수 있습니다. 단백질은 연장된 시간 경과와 반복되는 동결-해동 주기에 의해 분해됩니다. 따라서 세포 용해, 면역침전 및 면역블로팅은 가능한 한 원활하게 수행되어야 합니다.

서문

단백질은 정보 처리, 신진대사, 수송, 의사 결정 및 구조적 조직을 포함한 모든 세포 기능에서 중요한 역할을 합니다. 단백질은 다른 분자와 물리적으로 상호 작용하여 기능을 매개합니다. 단백질-단백질 상호작용(PPI)은 신호 전달 매개, 환경 감지, 에너지를 물리적 움직임으로 전환, 대사 및 신호 전달 효소의 활동 조절, 세포 조직 유지와 같은 세포 기능을 매개하는 데 중요합니다1. 따라서 PPI는 알려지지 않은 기능을 설명하는 데 사용할 수 있습니다2. PPI를 검출하는 방법은 in vitro, in vivo 및 in silico의 세 가지 유형으로 분류할 수 있습니다. 공면역침전(co-IP), 친화성 크로마토그래피, 탠덤 친화도 정제, 단백질 어레이, 파지 디스플레이, 단백질 절편 보완, X선 결정학 및 핵 자기 공명 분광법이 체외 PPI 검출에 사용되었습니다3. 이러한 방법 중 co-IP는 단순성으로 인해 널리 사용됩니다.

융합 태그 FLAG는 엔테로키나제 절단 부위를 포함한 8개의 아미노산(AspTyrLysAspAspAspLys: DYKDDDDK)으로 구성되며, 면역친화성 크로마토그래피4를 위해 특별히 설계되었습니다. DYKDDDDK 태그 단백질은 anti-DYKDDDDK 항체를 사용하여 인식되고 캡처됩니다. 따라서 DYKDDDDK 결합 아가로스 비드5 를 사용하여 효율적으로 끌어내려 간단한 방법으로 특정 단백질에 대한 결합을 확인합니다. 면역침전은 다양한 세포에서 수행될 수 있으며, 관심 단백질에 대한 항체를 사용하여 광범위한 PPI를 확인할 수 있습니다. anti-DYKDDDDK 아가로스 비드를 사용한 면역침전 및 펩타이드 용출은 이전에 보고된 바 있다5.

여기에서는 DYKDDDDK 태그 단백질을 암호화하는 플라스미드를 HEK-293 세포에 일시적으로 도입하여 두 관심 단백질의 연관성을 확인하는 간단한 면역침전 방법을 제공합니다. 특정 DYKDDDDK 항체는 융합 단백질의 N-말단과 C-말단 모두에 결합할 수 있지만 다른 항체는 결합할 수 없다6. 따라서 혼동을 피하기 위해 N-말단과 C-말단 모두에 융합된 태그를 인식하는 항체를 선택해야 합니다. 에피토프 태그를 삽입할 때, 에피토프 태그와 타겟 단백질 사이에 3 내지 12개의 염기쌍을 삽입함으로써 단백질의 구조적 변화를 피할 수 있을 수 있다. 그러나 삽입된 시퀀스는 프레임 이동을 피하기 위해 3의 배수로 된 기본 쌍이어야 합니다.

프로토콜

그림 1 은 프로토콜의 개요를 보여줍니다.

1. 용액 및 완충액의 준비

  1. 단백질 용해 완충액: 이전에 발표된 보고서7 (표 1)에 따라 단백질 용해 완충액을 준비합니다.
  2. 단백질 용해 완충액 + 프로테아제 억제제(PI): 프로테아제 억제제( 재료 표 참조)를 위에서 준비된 완충액(단계 1.1)에 추가합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
  3. 시료 완충액: 900μL의 4x Laemmli 시료 완충액( 재료 표 참조)과 100μL의 2-메르캅토에탄올을 혼합합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
  4. 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트(PBS-P)와 인산염 완충 식염수(PBS): PBS 1.998L와 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 2mL를 혼합합니다( 재료 표 참조). 실온에서 보관하십시오.
  5. 1x Tris/Glycine/SDS 완충액: DDW 450mL와 10x Tris/Glycine/SDS 50mL를 혼합합니다. 사용 당일은 상온에서 준비하십시오.

2. 플라스미드 transfection

  1. 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신(10,000 단위/mL 페니실린 G 및 10,000 μg/mL 스트렙토마이신)을 함유한 Dulbecco의 변형 독수리 배지를 사용하여 10cm 콜라겐 코팅 접시에서 하위 합류점(80%-95%)으로 HEK-293 세포를 배양합니다( 재료 표 참조).
  2. 접시당 1-10 μg의 plasmid7 을 transfection하고 transfection mix를 만듭니다. 접시당 250μL의 최종 부피에 150mM NaCl을 추가합니다. 혼합물을 소용돌이치게 하고 회전시킵니다.
  3. 접시당 60μL의 1mg/mL 폴리에틸렌민(PEI, 재료 표 참조)을 추가한 다음 150mM NaCl을 PEI 용액 250μL의 최종 부피에 추가합니다.
  4. PEI 용액을 transfection mix에 추가하여 혼합 용액을 만듭니다. 즉시 소용돌이치고(3-5초 동안 최고 속도로, 그 후에도 동일한 수행) 스핀 다운합니다.
  5. 실온에서 15-30분 동안 배양합니다. 이 시간 동안 HEK-293 세포의 배지를 변화시킵니다.
  6. HEK-293 세포 접시 전체에 500 μL/접시의 혼합 용액을 뿌리고 하룻밤(13-14시간) 배양합니다.
  7. 다음날 매체 교환을 실시하십시오.

3. 세포 용해 및 시료 전처리

참고: 단백질 분해를 방지하기 위해 가능한 한 샘플을 보존하거나 동결-해동하지 않고 후속 단계를 수행해야 합니다.

  1. transfection 후 약 48시간 후에 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 3회 세척하고, 500 μL/접시의 단백질 용해 완충액 + PI를 추가하고, 얼음 위에서 단백질 흡착이 적은 튜브에 세포 스크레이퍼와 피펫으로 세포를 수집합니다.
  2. 5분마다 소용돌이치고 10분 동안 얼음 위에서 샘플을 배양합니다.
  3. 16,400 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 채취하여 단백질 흡착이 적은 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 샘플은 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
  4. 제조업체의 프로토콜에 따라 단백질 농도 측정 키트를 사용하여 샘플의 단백질 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).
  5. 각 샘플에서 동일한 양의 단백질 200-1000μg을 분리한 다음 단백질 용해 완충액 + PI를 추가하여 총 부피를 500-1000μL로 조정합니다.
    알림: 다음 단계는 얼음 위에서 수행됩니다.

4. 슬러리의 제조

참고: 단백질 G 겔과 에피토프 태그 친화성 겔의 1:1 슬러리를 면역침전 전날 또는 당일에 준비합니다.

  1. 단백질 G 겔의 준비
    1. 끝이 잘린 팁을 사용하여 잘 섞은 다음 단백질 G 겔( 재료 표 참조)을 분리하여 샘플당 20μL의 비드가 준비되도록 합니다.
    2. 12,000 x g 에서 4 °C에서 20초 동안 원심분리하고 비드가 수평을 이룰 수 있도록 1분 동안 비드를 얼음 위에 놓습니다. 피펫을 사용하여 상층액을 폐기하십시오.
    3. 단계 4.1.2에서 준비한 단백질 G 겔에 단백질 용해 완충액 + PI 1mL를 추가하고 탭하고 뒤집어서 혼합합니다. 4 °C에서 12,000 x g 에서 20 초 동안 원심 분리하고 비드를 얼음 위에 1 분 동안 올려 비드가 수평을 이루도록 한 다음 상층액을 버립니다.
    4. 4.1.3단계를 세 번 반복합니다.
    5. 단백질 G 겔에 동일한 부피의 단백질 용해 완충액을 추가하여 1:1 단백질 G 겔 슬러리를 만듭니다. 단백질 G 겔 슬러리는 4°C에서 약 1일 동안 보관할 수 있습니다.
  2. epitope tag 친화성 겔의 제조
    1. 끝이 잘린 팁을 사용하여 잘 저어준 다음 에피토프 태그 친화성 겔( 재료 표 참조)을 분리하여 샘플당 10-15μL의 비드가 준비되도록 합니다.
    2. 5,000 x g 에서 4 °C에서 30초 동안 원심분리하고 비드가 수평을 이룰 수 있도록 얼음 위에서 1분 동안 기다립니다. 피펫을 사용하여 상층액을 폐기하십시오.
    3. 단계 4.2.2에서 준비한 epitope tag affinity gel에 단백질 용해 완충액 + PI 1mL를 추가하고 탭하고 뒤집어 혼합합니다. 4 °C에서 5,000 x g 의 원심분리기로 30초 동안 원심분리를 하고 비드를 얼음 위에 1분 동안 올려 비드가 수평을 이룰 수 있도록 한 다음 피펫으로 상층액을 버립니다.
    4. 4.2.3단계를 두 번 반복합니다.
    5. 단계 4.2.4에서 준비한 에피토프 태그 친화성 겔에 500μL의 0.1M 글리신(pH 3.5)을 첨가하고 두드리거나 뒤집어 혼합합니다. 이 단계는 유리 에피토프 태그 항체를 제거하기 위해 수행됩니다. 글리신 첨가 후 20분 이내에 4°C에서 5,000 x g 으로 30초 동안 원심분리하고 비드를 얼음 위에 1분 동안 올려 비드가 수평을 이루도록 한 다음 상층액을 버립니다.
    6. 500단계에서 준비한 epitope tag affinity gel에 4.2.5μL의 단백질 용해 완충액 + PI를 추가하고 탭하고 반전하여 혼합합니다. 5,000 x g 에서 4 °C에서 30초 동안 원심분리하고 비드를 얼음 위에 1분 동안 올려 비드가 수평을 이룰 수 있도록 한 다음 상층액을 버립니다.
    7. 4.2.6단계를 세 번 반복합니다.
    8. 동일한 부피의 단백질 용해 완충액을 에피토프 태그 친화성 겔에 추가하여 1:1 에피토프 태그 친화성 겔 슬러리를 준비합니다. 에피토프 태그 친화성 겔 슬러리는 4°C에서 약 1일 동안 보관할 수 있습니다.

5. 단백질 G 겔로 사전 클리어링하고 에피토프 태그 친화성 겔로 단백질 복합체를 포획합니다.

  1. 1:1 단백질 G 슬러리(4단계에서 준비)를 절단 팁이 장착된 피펫과 혼합하고 한 번에 40μL를 샘플에 추가합니다.
  2. 냉장 챔버(4°C)에서 사이클당 약 30초 내에 로테이터( 재료 표 참조)에서 1시간 동안 샘플을 회전시킵니다.
  3. 12,000 x g 에서 4 °C에서 20초 동안 원심분리하고 비드가 수평을 이룰 수 있도록 1분 동안 비드를 얼음 위에 놓습니다.
  4. 상층액을 채취하여 단백질 흡착이 적은 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  5. 5.4단계에서 주입용 시료를 시료에서 분리하여 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  6. 20-30 μL의 1:1 에피토프 태그 겔 슬러리를 샘플에 추가합니다.
  7. 냉장 챔버(4°C)에서 2시간 동안 사이클당 약 30초 동안 회전합니다.
  8. 5.5단계에서 준비한 입력에 샘플 버퍼를 추가하여 4배로 희석하고 98°C에서 10분 동안 가열합니다. 입력은 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
    알림: 동결 및 해동으로 인한 단백질 분해 가능성 때문에 가능한 한 단백질을 보존하지 않고 후속 단계를 수행해야 합니다.

6. 침전된 단백질을 세척하고 용출시키기

  1. 히트 블록의 온도를 98°C로 설정합니다.
  2. 5,000 x g 에서 4 °C에서 30초 동안 원심분리하고 비드가 수평을 이룰 수 있도록 얼음 위에서 1분 동안 기다립니다. 피펫을 사용하여 상층액을 폐기하십시오.
  3. 단백질 용해 완충액 + PI 1mL를 넣고 두드리거나 뒤집어 섞습니다. 냉장 챔버(30°C)에서 사이클당 약 4초 동안 로테이터를 5분 동안 회전합니다. 5,000 x g 에서 4 °C에서 30초 동안 원심분리기를 하고 비드가 수평을 이룰 때까지 얼음 위에서 1분 동안 기다린 다음 상층액을 버립니다.
  4. 6.3 단계를 5-10회 반복합니다.
  5. 6.4단계에서 준비한 샘플에 10μL의 샘플 버퍼를 추가합니다. 98°C에서 10분 동안 끓입니다.
  6. 4°C에서 5,000 x g 으로 30초 동안 원심분리기.
  7. 단백질 흡착이 적은 새 튜브에 컬럼을 넣고 절단 팁이 있는 피펫을 사용하여 겔을 컬럼으로 옮깁니다. 겔의 오염을 방지하기 위해 컬럼이 사용됩니다.
  8. 9,730 x g 에서 4 °C에서 1분 동안 원심분리기. 플로우 스루를 수집합니다. 샘플은 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
    참고: 샘플 분해가 우려되는 경우 동결하지 않고 다음 면역블로팅을 수행해야 합니다.

7. 면역블로팅

참고: 면역블로팅 절차는 이전 보고서 7,8을 기반으로 합니다.

  1. 소듐 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE, 재료 표 참조)에 전체 샘플을 로드합니다.
    참고: 필요한 경우 전체 샘플이 전달될 수 있도록 대형 웰 젤을 사용하십시오. 여기에는 50μL 웰이 있는 겔이 사용되었습니다.
  2. 전기영동 챔버에 겔을 놓고 겔 주위에 적절한 부피까지 1x Tris/Glycine/SDS 완충액( 재료 표 참조)을 추가합니다.
  3. 100 V 및 400 mA에서 전기영동 겔.
  4. 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF, 재료 표 참조) 멤브레인으로 전사합니다.
  5. 실온에서 1시간 동안 PBS-P의 5% 탈지유로 PVDF 멤브레인 블롯을 차단합니다.
  6. PBS-P로 셰이커에서 최고 속도로 5분 동안 멤브레인을 세 번 세척합니다. 그 후 세탁할 때도 동일한 절차를 수행하십시오.
  7. 4 °C에서 1차 항체( 재료 표 참조)가 있는 쉐이커에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  8. 다음날 PBS-P로 멤브레인을 세 번 세척합니다.
  9. 2차 항체를 쉐이커에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    참고: 타겟 단백질의 분자량이 약 50kDa의 분자량을 갖는 IgG 중쇄에 가까운 경우, 경쇄 특이적 2차 항체를 사용하여 타겟 밴드와 IgG 중쇄의 중복을 방지할 수 있습니다. 이 연구는 IP 검출 시약으로 경쇄 특이적 항체7 또는 Veriblo을 사용했습니다( 재료 표 참조).
  10. peroxidase luminescent substrates를 가진 단백질 띠를 식별합니다. 멤브레인은 PBS-P로 두 번 세척한 후 PBS에 저장할 수 있습니다.
  11. 스트리핑 용액으로 10분 동안 스트리핑합니다( 재료 표 참조).
  12. 세 번 씻고 PBS-P에 5% 탈지유로 차단합니다. 그 이후의 프로토콜은 7.6단계 이후와 동일합니다.

결과

갈색 및 베이지색 지방세포라고도 하는 열발생 지방세포는 잠재적인 항비만 및 항포도당 불내성 효과가 있습니다. PR(PRD1-BF1-RIZ1 상동) 도메인 함유 16(PRDM16)은 열발생 지방세포 정체성 9,10을 결정하는 데 중요한 역할을 하는 전사 보조인자입니다.

GLP라고도 하는 EHMT1(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 1)은 주로 보조 인자 S-아?...

토론

이 프로토콜은 이전에 보고된 프로토콜 5,7,14,15와 거의 유사합니다. 이 프로토콜의 중요한 점은 세포 용해 단계에서 면역침전 단계까지 실험을 중단하지 않는다는 것입니다. 단백질 분해는 PPI 검출을 방해합니다. 연장된 시간 경과와 반복되는 동결-해동 주기는 단백질을 분해합니다. SDS-PAGE에 있는 전...

공개

우리는 저자 중 누구도 이 연구와 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 일본 과학 진흥회(JSPS) KAKENHI 보조금 번호 19K18008(G.N.), JSPS KAKENHI 보조금 번호 22K16415(G.N.), JSPS KAKENHI 보조금 번호 22K08672(H.O.), 일본 당뇨병 학회 젊은 연구자를 위한 연구 보조금(G.N.), MSD 생명과학재단 젊은 연구자를 위한 연구 보조금(G.N.)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA (pH8.0)Nippon gene311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µLBiorad4561034
10x Tris/Glycine/SDSBiorad1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab SheepGE HealthcareNA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab DonkeyGE HealthcareNA934-1ML
Cell Scraper MSumitomo BakeliteMS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mmIWAKI4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementInvitrogen10565042
D-PBS (-)FUJIFILM Wako045-29795
GlycerolFUJIFILM Wako072-00626
GlycineFUJIFILM Wako077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724Cell SignalingC29F4
Laemmli Sample bufferBio-Rad Laboratories161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography ColumnsBiorad7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast GelsBiorad1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouseSigmaF3165
NaClFUJIFILM Wako191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16This paperN/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1This paperN/A
pcDNA3.1-vectorThis paperN/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine HydrochloridePSI24765
Penicillin-streptomycin solutionFUJIFILM Wako168-23191
Pierce BCA Protein Assay KitThermo scientific23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl EtherFUJIFILM Wako168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan MonolaurateFUJIFILM Wako167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab PacksCytiva17061801
Protein LoBind Tubeseppendorf30108442
ROTATOR RT-5TAITECRT-5
skim milkMorinaga0652842 
Stripping SolutionFUJIFILM Wako193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer PackBiorad1704156B03
Trans-Blot Turbo SystemBioradN/A
Trizma baseSigmaT1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30910.03
VeriblotAbcamab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970Cell Signaling4970S

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