단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 Anti-Epitope Tag Affinity Gel을 사용한 면역침전

요약

단백질-단백질 상호작용은 표적 단백질의 기능을 규명하는 데 중요하며, co-IP(co-immunoprecipitation)를 통해 PPI를 쉽게 확인할 수 있습니다. 에피토프 태그 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 HEK-293 세포에 임시로 transfection하고 두 타겟 단백질의 결합을 쉽게 확인할 수 있는 면역침전 방법을 개발했습니다.

초록

단백질-단백질 상호 작용(PPI)은 세포 조직, 세포 내 신호 전달 및 전사 조절과 같은 생물학적 현상에서 중추적인 역할을 합니다. 따라서 PPI를 이해하는 것은 표적 단백질의 기능에 대한 추가 연구를 위한 중요한 출발점입니다. 본 연구에서는 폴리에틸렌이민 방법을 사용하여 HEK-293 세포에 포유류 발현 벡터를 도입하고, 집에서 만든 단백질 용해 완충액에서 세포를 용해하고, 에피토프 태그 친화성 겔에서 표적 단백질을 끌어내려 두 표적 단백질의 결합을 결정하는 간단한 방법을 제안합니다. 또한, 다양한 에피토프 태그 융합 단백질 간의 PPI는 에피토프 태그 친화성 겔 대신 각 태그에 대한 친화성 항체를 사용하여 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 세포주에서 핵 추출물을 포함한 다양한 PPI를 검증하는 데에도 사용할 수 있습니다. 따라서 다양한 PPI 실험에서 기본 방법으로 사용할 수 있습니다. 단백질은 연장된 시간 경과와 반복되는 동결-해동 주기에 의해 분해됩니다. 따라서 세포 용해, 면역침전 및 면역블로팅은 가능한 한 원활하게 수행되어야 합니다.

서문

단백질은 정보 처리, 신진대사, 수송, 의사 결정 및 구조적 조직을 포함한 모든 세포 기능에서 중요한 역할을 합니다. 단백질은 다른 분자와 물리적으로 상호 작용하여 기능을 매개합니다. 단백질-단백질 상호작용(PPI)은 신호 전달 매개, 환경 감지, 에너지를 물리적 움직임으로 전환, 대사 및 신호 전달 효소의 활동 조절, 세포 조직 유지와 같은 세포 기능을 매개하는 데 중요합니다¹. 따라서 PPI는 알려지지 않은 기능을 설명하는 데 사용할 수 있습니다². PPI를 검출하는 방법은 in vitro, in vivo 및 in silico의 세 가지 유형으로 분류할 수 있습니다. 공면역침전(co-IP), 친화성 크로마토그래피, 탠덤 친화도 정제, 단백질 어레이, 파지 디스플레이, 단백질 절편 보완, X선 결정학 및 핵 자기 공명 분광법이 체외 PPI 검출에 사용되었습니다³. 이러한 방법 중 co-IP는 단순성으로 인해 널리 사용됩니다.

융합 태그 FLAG는 엔테로키나제 절단 부위를 포함한 8개의 아미노산(AspTyrLysAspAspAspLys: DYKDDDDK)....

프로토콜

그림 1 은 프로토콜의 개요를 보여줍니다.

1. 용액 및 완충액의 준비

1. 단백질 용해 완충액: 이전에 발표된 보고서⁷ (표 1)에 따라 단백질 용해 완충액을 준비합니다.
2. 단백질 용해 완충액 + 프로테아제 억제제(PI): 프로테아제 억제제( 재료 표 참조)를 위에서 준비된 완충액(단계 1.1)에 추가합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
3. 시료 완충액: 900μL의 4x Laemmli 시료 완충액( 재료 표 참조)과 100μL의 2-메르캅토에탄올을 혼합합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
4. 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트(PBS-P)와 인산염 완충 식염수(PBS): PBS 1.998L와 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 2mL를 혼합합니다( 재료 표 참조). 실온에서 보관하십시오.
5. 1x Tris/Glycine/SDS 완충액: DDW 450mL와 10x Tris/Glycine/SDS 50mL를 ....

토론

이 프로토콜은 이전에 보고된 프로토콜 5,7,14,15와 거의 유사합니다. 이 프로토콜의 중요한 점은 세포 용해 단계에서 면역침전 단계까지 실험을 중단하지 않는다는 것입니다. 단백질 분해는 PPI 검출을 방해합니다. 연장된 시간 경과와 반복되는 동결-해동 주기는 단백질을 분해합니다. SDS-PAGE에 있는 전.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH8.0)	Nippon gene	311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL	Biorad	4561034
10x Tris/Glycine/SDS	Biorad	1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep	GE Healthcare	NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey	GE Healthcare	NA934-1ML
Cell Scraper M	Sumitomo Bakelite	MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm	IWAKI	4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Invitrogen	10565042
D-PBS (-)	FUJIFILM Wako	045-29795
Glycerol	FUJIFILM Wako	072-00626
Glycine	FUJIFILM Wako	077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724	Cell Signaling	C29F4
Laemmli Sample buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Biorad	7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels	Biorad	1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma	F3165
NaCl	FUJIFILM Wako	191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16	This paper	N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1	This paper	N/A
pcDNA3.1-vector	This paper	N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride	PSI	24765
Penicillin-streptomycin solution	FUJIFILM Wako	168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	FUJIFILM Wako	168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako	167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs	Cytiva	17061801
Protein LoBind Tubes	eppendorf	30108442
ROTATOR RT-5	TAITEC	RT-5
skim milk	Morinaga	0652842
Stripping Solution	FUJIFILM Wako	193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack	Biorad	1704156B03
Trans-Blot Turbo System	Biorad	N/A
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30910.03
Veriblot	Abcam	ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970	Cell Signaling	4970S