Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Anti-Epitop Etiket Afinite Jeli ile İmmünopresipitasyon

Özet

Protein-protein etkileşimleri, hedef proteinlerin işlevini aydınlatmak için önemlidir ve ko-immünopresipitasyon (co-IP), PPI'leri kolayca doğrulayabilir. Epitop etiketli bir proteini kodlayan bir plazmiti HEK-293 hücrelerine geçici olarak transfekte ettik ve iki hedef proteinin bağlanmasını kolayca doğrulamak için bir immünopresipitasyon yöntemi geliştirdik.

Özet

Protein-protein etkileşimleri (PPI'ler), hücresel organizasyon, hücre içi sinyal iletimi ve transkripsiyonel düzenleme gibi biyolojik olaylarda çok önemli bir rol oynar. Bu nedenle, PPI'leri anlamak, hedef proteinin işlevinin daha fazla araştırılması için önemli bir başlangıç noktasıdır. Bu çalışmada, memeli ekspresyon vektörlerini polietilenimin yöntemi kullanılarak HEK-293 hücrelerine sokarak, hücreleri ev yapımı protein lizis tamponunda parçalayarak ve hedef proteinleri bir epitop etiket afinite jeli üzerinde aşağı çekerek iki hedef proteinin bağlanmasını belirlemek için basit bir yöntem öneriyoruz. Ek olarak, çeşitli epitop etiketi kaynaşmış proteinler arasındaki PPI, epitop etiketi afinite jeli yerine her bir etikete karşı afinite antikorları kullanılarak doğrulanabilir. Bu protokol, diğer hücre hatlarından nükleer ekstraktlar da dahil olmak üzere çeşitli PPI'leri doğrulamak için de kullanılabilir. Bu nedenle, çeşitli PPI deneylerinde temel bir yöntem olarak kullanılabilir. Proteinler, uzun süreli seyri ve tekrarlanan donma-çözülme döngüleri ile bozunur. Bu nedenle, hücre lizisi, immünopresipitasyon ve immünoblotlama mümkün olduğunca sorunsuz bir şekilde gerçekleştirilmelidir.

Giriş

Proteinler, bilgi işleme, metabolizma, taşıma, karar verme ve yapısal organizasyon dahil olmak üzere tüm hücresel işlevlerde önemli bir rol oynar. Proteinler, diğer moleküllerle fiziksel olarak etkileşime girerek işlevlerine aracılık eder. Protein-protein etkileşimleri (PPI'ler), sinyal iletimine aracılık etmek, çevreyi algılamak, enerjiyi fiziksel harekete dönüştürmek, metabolik ve sinyal enzimlerinin aktivitesini düzenlemek ve hücresel organizasyonu sürdürmek gibi hücresel işlevlere aracılık etmek için önemlidir¹. Böylece, ÜFE'ler bilinmeyen işlevleri aydınlatmak için kullanılabilir². ÜFE'leri tespit etme yöntemleri üç....

Protokol

Şekil 1 , protokole genel bir bakış sunar.

1. Çözeltilerin ve tamponların hazırlanması

1. Protein lizis tamponu: Daha önce yayınlanmış bir rapor^7'yi takiben protein lizis tamponunu hazırlayın (Tablo 1).
2. Protein lizis tamponu + proteaz inhibitörü (PI): Yukarıda hazırlanan tampona proteaz inhibitörü ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (adım 1.1). -20 °C'de saklayın.
3. Numune tamponu: 900 μL 4x Laemmli numune tamponunu (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 100 μL 2-merkaptoetanolü karıştırın. -20 °C'de sak....

Tartışmalar

Bu protokol neredeyse daha önce bildirilen 5,7,14,15 protokolleri gibidir. Bu protokolün önemli noktası, deneyi hücre lizis basamağından immünopresipitasyon basamağına kadar asla durdurmamamızdır. Protein bozulması ÜFE tespitini engeller. Uzun süreli seyri ve tekrarlanan donma-çözülme döngüleri proteinleri bozar. SDS-PAGE'deki elektroforez, sadece protein yıkımını en aza.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH8.0)	Nippon gene	311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL	Biorad	4561034
10x Tris/Glycine/SDS	Biorad	1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep	GE Healthcare	NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey	GE Healthcare	NA934-1ML
Cell Scraper M	Sumitomo Bakelite	MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm	IWAKI	4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Invitrogen	10565042
D-PBS (-)	FUJIFILM Wako	045-29795
Glycerol	FUJIFILM Wako	072-00626
Glycine	FUJIFILM Wako	077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724	Cell Signaling	C29F4
Laemmli Sample buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Biorad	7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels	Biorad	1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma	F3165
NaCl	FUJIFILM Wako	191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16	This paper	N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1	This paper	N/A
pcDNA3.1-vector	This paper	N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride	PSI	24765
Penicillin-streptomycin solution	FUJIFILM Wako	168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	FUJIFILM Wako	168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako	167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs	Cytiva	17061801
Protein LoBind Tubes	eppendorf	30108442
ROTATOR RT-5	TAITEC	RT-5
skim milk	Morinaga	0652842
Stripping Solution	FUJIFILM Wako	193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack	Biorad	1704156B03
Trans-Blot Turbo System	Biorad	N/A
Trizma base	Sigma	T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30910.03
Veriblot	Abcam	ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970	Cell Signaling	4970S