Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protein-protein etkileşimleri, hedef proteinlerin işlevini aydınlatmak için önemlidir ve ko-immünopresipitasyon (co-IP), PPI'leri kolayca doğrulayabilir. Epitop etiketli bir proteini kodlayan bir plazmiti HEK-293 hücrelerine geçici olarak transfekte ettik ve iki hedef proteinin bağlanmasını kolayca doğrulamak için bir immünopresipitasyon yöntemi geliştirdik.

Özet

Protein-protein etkileşimleri (PPI'ler), hücresel organizasyon, hücre içi sinyal iletimi ve transkripsiyonel düzenleme gibi biyolojik olaylarda çok önemli bir rol oynar. Bu nedenle, PPI'leri anlamak, hedef proteinin işlevinin daha fazla araştırılması için önemli bir başlangıç noktasıdır. Bu çalışmada, memeli ekspresyon vektörlerini polietilenimin yöntemi kullanılarak HEK-293 hücrelerine sokarak, hücreleri ev yapımı protein lizis tamponunda parçalayarak ve hedef proteinleri bir epitop etiket afinite jeli üzerinde aşağı çekerek iki hedef proteinin bağlanmasını belirlemek için basit bir yöntem öneriyoruz. Ek olarak, çeşitli epitop etiketi kaynaşmış proteinler arasındaki PPI, epitop etiketi afinite jeli yerine her bir etikete karşı afinite antikorları kullanılarak doğrulanabilir. Bu protokol, diğer hücre hatlarından nükleer ekstraktlar da dahil olmak üzere çeşitli PPI'leri doğrulamak için de kullanılabilir. Bu nedenle, çeşitli PPI deneylerinde temel bir yöntem olarak kullanılabilir. Proteinler, uzun süreli seyri ve tekrarlanan donma-çözülme döngüleri ile bozunur. Bu nedenle, hücre lizisi, immünopresipitasyon ve immünoblotlama mümkün olduğunca sorunsuz bir şekilde gerçekleştirilmelidir.

Giriş

Proteinler, bilgi işleme, metabolizma, taşıma, karar verme ve yapısal organizasyon dahil olmak üzere tüm hücresel işlevlerde önemli bir rol oynar. Proteinler, diğer moleküllerle fiziksel olarak etkileşime girerek işlevlerine aracılık eder. Protein-protein etkileşimleri (PPI'ler), sinyal iletimine aracılık etmek, çevreyi algılamak, enerjiyi fiziksel harekete dönüştürmek, metabolik ve sinyal enzimlerinin aktivitesini düzenlemek ve hücresel organizasyonu sürdürmek gibi hücresel işlevlere aracılık etmek için önemlidir1. Böylece, ÜFE'ler bilinmeyen işlevleri aydınlatmak için kullanılabilir2. ÜFE'leri tespit etme yöntemleri üç tipte sınıflandırılabilir: in vitro, in vivo ve in silico. İn vitro PPI tespiti için ko-immünopresipitasyon (co-IP), afinite kromatografisi, tandem afinite saflaştırması, protein dizileri, faj gösterimi, protein fragmanı tamamlaması, X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi kullanılmıştır3. Bu yöntemler arasında co-IP, basitliği nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır.

Füzyon etiketi FLAG, bir enterokinaz bölünme bölgesi de dahil olmak üzere sekiz amino asitten (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK) oluşur ve immünoaffinite kromatografisi4 için özel olarak tasarlanmıştır. DYKDDDDK etiketli proteinler, bir anti-DYKDDDDK antikoru kullanılarak tanınır ve yakalanır. Bu nedenle, spesifik proteinlere bağlanmalarını basit bir şekilde doğrulamak için DYKDDDDK bağlayıcı agaroz boncukları5 kullanılarak verimli bir şekilde aşağı çekilirler. İmmünopresipitasyon çeşitli hücrelerde gerçekleştirilebilir ve ilgilenilen proteine karşı antikorlar kullanılarak çok çeşitli PPI'ler doğrulanabilir. Anti-DYKDDDDK agaroz boncukları ile immünopresipitasyon ve peptit elüsyonu daha önce bildirilmiştir5.

Burada, DYKDDDDK etiketli bir proteini kodlayan bir plazmitin, ilgilenilen iki proteinin ilişkisini doğrulamak için HEK-293 hücrelerine geçici olarak sokulduğu basit bir immünopresipitasyon yöntemi sunuyoruz. Bazı DYKDDDDK antikorları, füzyon proteinlerinin hem N-terminaline hem de C-terminaline bağlanabilir, ancak diğerlerinebağlanamaz 6. Bu nedenle, karışıklığı önlemek için, hem N- hem de C-terminaline kaynaşmış etiketi tanıyan antikor seçilmelidir. Bir epitop etiketi yerleştirirken, epitop etiketi ile hedef protein arasına 3 ila 12 baz çifti ekleyerek proteindeki konformasyonel değişikliklerden kaçınmak mümkün olabilir. Bununla birlikte, eklenen dizi, çerçeve kaymasını önlemek için 3'ün katları olan bir baz çifti olmalıdır.

Protokol

Şekil 1 , protokole genel bir bakış sunar.

1. Çözeltilerin ve tamponların hazırlanması

  1. Protein lizis tamponu: Daha önce yayınlanmış bir rapor7'yi takiben protein lizis tamponunu hazırlayın (Tablo 1).
  2. Protein lizis tamponu + proteaz inhibitörü (PI): Yukarıda hazırlanan tampona proteaz inhibitörü ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (adım 1.1). -20 °C'de saklayın.
  3. Numune tamponu: 900 μL 4x Laemmli numune tamponunu (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 100 μL 2-merkaptoetanolü karıştırın. -20 °C'de saklayın.
  4. Polioksietilen (20) sorbitan monolaurat (PBS-P) ile fosfat tamponlu salin (PBS): 1.998 L PBS ve 2 mL polioksietilen (20) sorbitan monolauratı karıştırın (bkz. Oda sıcaklığında saklayın.
  5. 1x Tris/Glisin/SDS tamponu: 450 mL DDW ve 50 mL 10x Tris/Glisin/SDS'yi karıştırın. Kullanım günü oda sıcaklığında hazırlayın.

2. Plazmit transfeksiyonu

  1. HEK-293 hücrelerini, 10 cm'lik kollajen kaplı bir tabakta, Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin (10.000 ünite / mL penisilin G ve 10.000 μg/mL streptomisin) içeren modifiye kartal ortamını kullanarak alt birleşime (%80-95) kadar kültürleyin (bkz.
  2. Tabak başına transfekte edilecek 1-10 μg plazmit7 hazırlayın ve bir transfeksiyon karışımı yapın. Tabak başına 250 μL'lik son hacme 150 mM NaCl ekleyin. Karışımı girdaplayın ve döndürün.
  3. Tabak başına 60 μL 1 mg / mL Polietilenimin (PEI, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, ardından 250 μL PEI çözeltisinin nihai hacmine 150 mM NaCl ekleyin.
  4. Karışık bir çözelti elde etmek için PEI çözeltisini transfeksiyon karışımına ekleyin. Hemen girdap yapın (3-5 saniye boyunca en yüksek hızda, daha sonra aynısını yapın) ve aşağı döndürün.
  5. Oda sıcaklığında 15-30 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında, HEK-293 hücrelerinin ortamını değiştirin.
  6. HEK-293 hücrelerinin her yerine 500 μL / tabak karışık çözelti serpin ve gece boyunca (13-14 saat) inkübe edin.
  7. Ertesi gün orta değişim gerçekleştirin.

3. Hücre lizisi ve numune hazırlama

NOT: Protein bozulmasını önlemek için, sonraki adımlar numuneyi mümkün olduğunca korumadan veya donmadan-çözülmeden gerçekleştirilmelidir.

  1. Transfeksiyondan yaklaşık 48 saat sonra, hücreleri buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın, 500 μL / tabak protein lizis tamponu + PI ekleyin ve hücreleri hücre sıyırıcı ve buz üzerinde düşük protein adsorpsiyonu olan bir tüpte bir pipet ile toplayın.
  2. Her 5 dakikada bir vorteksleyin ve numuneleri 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  3. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve düşük protein adsorpsiyonu olan 1.5 mL'lik taze bir tüpe aktarın. Numuneler -80 °C'de saklanabilir.
  4. Numunelerin protein konsantrasyonunu, üreticinin protokolüne göre bir protein konsantrasyonu ölçüm kiti ile belirleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
  5. Her numunede aynı miktarda proteinden 200-1000 μg ayırın, ardından toplam hacmi 500-1000 μL'ye ayarlamak için protein lizis tamponu + PI ekleyin.
    NOT: Aşağıdaki adımlar buz üzerinde gerçekleştirilir.

4. Bulamacın hazırlanması

NOT: İmmünopresipitasyondan bir gün önce veya o gün 1: 1 oranında bir protein G jeli ve epitop etiketi afinite jeli bulamacı hazırlayın.

  1. Bir protein G jelinin hazırlanması
    1. Ucu kesilmiş bir uç kullanarak, iyice karıştırın ve ardından protein G jelini ( Malzeme Tablosuna bakınız) numune başına 20 μL boncuk hazırlanacak şekilde ayırın.
    2. 4 ° C'de 20 saniye boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin ve boncukların düzleşmesini sağlamak için boncukları 1 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın.
    3. Adım 4.1.2'de hazırlanan protein G jeline 1 mL protein lizis tamponu + PI ekleyin ve hafifçe vurarak ve ters çevirerek karıştırın. 4 ° C'de 20 saniye boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin, boncukların düzleşmesini sağlamak için boncukları 1 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve süpernatanı atın.
    4. Adım 4.1.3'ü üç kez tekrarlayın.
    5. 1: 1 protein G jel bulamacı yapmak için protein G jeline eşit hacimde protein lizis tamponu ekleyin. Protein G jel bulamacı 4 ° C'de yaklaşık 1 gün saklanabilir.
  2. Bir epitop etiket afinite jelinin hazırlanması
    1. Ucu kesilmiş bir uç kullanarak, iyice çalkalayın ve ardından epitop etiket afinite jelini ayırın ( Malzeme Tablosuna bakınız) numune başına 10-15 μL boncuk hazırlanacak şekilde.
    2. 4 °C'de 30 saniye boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin ve boncukların düzleşmesi için buz üzerinde 1 dakika bekleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın.
    3. Adım 4.2.2'de hazırlanan epitop etiketi afinite jeline 1 mL protein lizis tamponu + PI ekleyin ve hafifçe vurarak ve ters çevirerek karıştırın. 4 ° C'de 30 saniye boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin, boncukların düzleşmesini sağlamak için boncukları 1 dakika buzun üzerine koyun ve süpernatantı bir pipetle atın.
    4. Adım 4.2.3'ü iki kez tekrarlayın.
    5. Adım 4.2.4'te hazırlanan epitop etiketi afinite jeline 500 μL 0.1 M glisin (pH 3.5) ekleyin ve hafifçe vurarak ve ters çevirerek karıştırın. Bu adım, serbest epitop etiket antikorlarını çıkarmak için gerçekleştirilir. Glisin ilavesinden sonraki 20 dakika içinde, 4 ° C'de 30 saniye boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin, boncukların düzleşmesini sağlamak için boncukları 1 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve süpernatanı atın.
    6. Adım 4.2.5'te hazırlanan epitop etiketi afinite jeline 500 μL protein lizis tamponu + PI ekleyin ve hafifçe vurarak ve ters çevirerek karıştırın. 4 ° C'de 30 saniye boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin, boncukların düzleşmesini sağlamak için boncukları 1 dakika buzun üzerine koyun ve süpernatanı atın.
    7. Adım 4.2.6'yı üç kez tekrarlayın.
    8. 1: 1 epitop etiket afinite jeli bulamacı hazırlamak için epitop etiketi afinite jeline eşit hacimde protein lizis tamponu ekleyin. Epitop etiketi afinite jeli bulamacı yaklaşık 1 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

5. Protein G jeli ile ön temizleme ve epitop etiket afinite jeli ile protein komplekslerinin yakalanması

  1. 1:1 protein G bulamacını (4. adımda hazırlanan) kesik uçlu bir pipetle karıştırın ve numuneye bir seferde 40 μL ekleyin.
  2. Numuneyi bir döndürücü üzerinde 1 saat döndürün ( Malzeme Tablosuna bakın) soğutulmuş bir odada (30 ° C) döngü başına yaklaşık 4 s'de.
  3. 4 ° C'de 20 saniye boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin ve boncukların düzleşmesini sağlamak için boncukları 1 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
  4. Süpernatanı toplayın ve düşük protein adsorpsiyonu olan 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
  5. Giriş için numuneyi adım 5.4'teki numuneden ayırın ve yeni bir 1.5 mL'lik tüpe aktarın.
  6. Numuneye 20-30 μL 1: 1 epitop etiket jel bulamacı ekleyin.
  7. 30 saat boyunca soğutulmuş bir odada (4 ° C) döngü başına yaklaşık 2 saniye döndürücü üzerinde döndürün.
  8. 4x'e seyreltmek için adım 5.5'te hazırlanan girişe numune tamponu ekleyin ve 98 °C'de 10 dakika ısıtın. Giriş -80 °C'de saklanabilir.
    NOT: Donma ve çözülme nedeniyle protein bozulması olasılığı nedeniyle, sonraki adımlar proteini mümkün olduğunca korumadan gerçekleştirilmelidir.

6. Çökelmiş proteinlerin yıkanması ve ayrıştırılması

  1. Isı bloğunun sıcaklığını 98 °C'ye ayarlayın.
  2. 4 °C'de 30 saniye boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin ve boncukların düzleşmesi için buz üzerinde 1 dakika bekleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın.
  3. 1 mL protein lizis tamponu + PI ekleyin ve dokunarak ve ters çevirerek karıştırın. Soğutulmuş bir odada (30 ° C) döngü başına yaklaşık 4 saniye boyunca bir döndürücü üzerinde 5 dakika döndürün. 4 ° C'de 30 saniye boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin, boncukların düzleşmesi için buz üzerinde 1 dakika bekleyin ve süpernatanı atın.
  4. Adım 6.3'ü 5-10 kez tekrarlayın.
  5. Adım 6.4'te hazırlanan numuneye 10 μL numune tamponu ekleyin. 98 °C'de 10 dakika kaynatın.
  6. 30 saniye boyunca 4 ° C'de 5.000 x g'da santrifüjleyin.
  7. Düşük protein adsorpsiyonuna sahip yeni bir tüpe bir kolon yerleştirin ve kesilmiş uçlu bir pipet kullanarak jeli kolona aktarın. Jelin kirlenmesini önlemek için bir sütun kullanılır.
  8. 4 ° C'de 1 dakika boyunca 9.730 x g'da santrifüjleyin. Akışı toplayın. Numune -80 °C'de saklanabilir.
    NOT: Numune bozulması söz konusuysa, aşağıdaki immünoblotlama işlemi dondurulmadan yapılmalıdır.

7. İmmünoblotlama

NOT: İmmünoblotlama prosedürleri önceki raporlara dayanmaktadır 7,8.

  1. Tüm numuneleri bir sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel üzerine yükleyin (SDS-PAGE, bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Gerekirse, tüm numunenin aktarılabileceği şekilde büyük kuyulu jeller kullanın. Burada 50 μL'lik kuyucuklu jeller kullanıldı.
  2. Jelleri elektroforez odasına yerleştirin ve jellerin etrafındaki uygun hacme kadar 1x Tris/Glisin/SDS tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
  3. 100 V ve 400 mA'da elektroforez jelleri.
  4. Poliviniliden florür (PVDF, Malzeme Tablosuna bakınız) membranlarına aktarın.
  5. PVDF membran lekelerini oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS-P'de %5 yağsız sütle bloke edin.
  6. Membranı PBS-P ile bir çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca en yüksek hızda üç kez yıkayın. Daha sonra yıkarken de aynı işlemi uygulayın.
  7. Birincil antikor ile bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız) 4 ° C'de.
  8. Ertesi gün membranı PBS-P ile üç kez yıkayın.
  9. İkincil antikor ile oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat inkübe edin.
    NOT: Hedef proteinin moleküler ağırlığı, yaklaşık 50 kDa'lık bir moleküler ağırlığa sahip olan IgG ağır zincirine yakınsa, hedef bandın IgG ağır zinciri ile örtüşmesini önlemek için hafif zincire özgü bir ikincil antikor kullanılabilir. Bu çalışmada, IP tespit reaktifi olarak hafif zincire özgü antikorlar7 veya Veriblot kullanılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu).
  10. Peroksidaz ışıldayan substratları ile protein bantlarını tanımlayın. Membran, PBS-P ile iki kez yıkandıktan sonra PBS'de saklanabilir.
  11. Bir sıyırma solüsyonu ile 10 dakika soyun ( Malzeme Tablosuna bakın).
  12. Üç kez yıkayın ve PBS-P'de% 5 yağsız süt ile bloke edin. Bundan sonraki protokol, adım 7.6'dan sonraki ile aynıdır.

Sonuçlar

Kahverengi ve bej adipositler olarak da bilinen termojenik adipositler, potansiyel anti-obezite ve anti-glukoz intoleransı etkilerine sahiptir. PR (PRD1-BF1-RIZ1 homolog) alan içeren 16 (PRDM16), termojenik adiposit kimliğininbelirlenmesinde önemli rol oynayan bir transkripsiyon kofaktörüdür 9,10.

GLP olarak da bilinen EHMT1 (ökromatik histon-lizin N-metiltransferaz 1), esas olarak S-adenosil metiyonin 11 kofaktörün?...

Tartışmalar

Bu protokol neredeyse daha önce bildirilen 5,7,14,15 protokolleri gibidir. Bu protokolün önemli noktası, deneyi hücre lizis basamağından immünopresipitasyon basamağına kadar asla durdurmamamızdır. Protein bozulması ÜFE tespitini engeller. Uzun süreli seyri ve tekrarlanan donma-çözülme döngüleri proteinleri bozar. SDS-PAGE'deki elektroforez, sadece protein yıkımını en aza...

Açıklamalar

Yazarların hiçbirinin bu çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederiz.

Teşekkürler

Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği (JSPS) KAKENHI Hibe Numarası 19K18008 (GN), JSPS KAKENHI Hibe Numarası 22K16415 (GN), JSPS Kakenhi Hibe Numarası 22K08672 (H.O.), Japonya Diyabet Derneği Genç Araştırmacılar için Araştırma Bursu (GN) ve MSD Yaşam Bilimleri Vakfı Genç Araştırmacılar için Araştırma Bursu (GN) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA (pH8.0)Nippon gene311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µLBiorad4561034
10x Tris/Glycine/SDSBiorad1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab SheepGE HealthcareNA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab DonkeyGE HealthcareNA934-1ML
Cell Scraper MSumitomo BakeliteMS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mmIWAKI4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementInvitrogen10565042
D-PBS (-)FUJIFILM Wako045-29795
GlycerolFUJIFILM Wako072-00626
GlycineFUJIFILM Wako077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724Cell SignalingC29F4
Laemmli Sample bufferBio-Rad Laboratories161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography ColumnsBiorad7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast GelsBiorad1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouseSigmaF3165
NaClFUJIFILM Wako191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16This paperN/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1This paperN/A
pcDNA3.1-vectorThis paperN/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine HydrochloridePSI24765
Penicillin-streptomycin solutionFUJIFILM Wako168-23191
Pierce BCA Protein Assay KitThermo scientific23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl EtherFUJIFILM Wako168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan MonolaurateFUJIFILM Wako167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab PacksCytiva17061801
Protein LoBind Tubeseppendorf30108442
ROTATOR RT-5TAITECRT-5
skim milkMorinaga0652842 
Stripping SolutionFUJIFILM Wako193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer PackBiorad1704156B03
Trans-Blot Turbo SystemBioradN/A
Trizma baseSigmaT1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30910.03
VeriblotAbcamab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970Cell Signaling4970S

Referanslar

  1. Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
  2. Yanagida, M. Functional proteomics; current achievements. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).
  3. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
  4. Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  5. Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
  6. Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
  7. Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143 (2023).
  8. Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584 (2015).
  9. Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
  10. Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
  11. Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
  12. Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674 (2023).
  13. Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
  14. Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569 (2022).
  15. Cristea, I. M., Chait, B. T. Affinity purification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  16. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  17. Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243 (2009).
  18. Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
  19. Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de bu aysay 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır