نموذج فأر لربط قسم الكبد وربط الوريد البابي لإجراء استئصال الكبد المرحلي بمساعدة الفحص المجهري

Summary

ثبت أن ربط تقسيم الكبد وربط الوريد البابي لاستئصال الكبد المرحلي (ALPPS) يؤدي إلى تجديد ملحوظ للكبد بعد عدة أسابيع من الجراحة في المرحلة الأولى. تم تطوير النماذج الحيوانية التي خضعت ل ALPPS لاستكشاف القدرة المحتملة على تجديد الكبد وتحقيق نتائج سريرية مواتية.

Abstract

يعتبر استئصال الكبد على نطاق واسع العلاج الأساسي للأورام الخبيثة الكبدية. ومع ذلك ، لا يزال فشل الكبد بعد العملية الجراحية سببا رئيسيا للوفيات المحيطة بالجراحة ، مما يؤثر بشدة على نتائج المرضى. في بيئة كبدية قوية ، يجب أن تتجاوز بقايا الكبد المستقبلية (FLR) 25٪ ، وفي حالات تليف الكبد ، يزيد هذا المطلب إلى أكثر من 40٪. يعد عدم كفاية FLR حاليا عقبة رئيسية في تطور جراحة الكبد.

تركز الطرق التقليدية لتعزيز تضخم FLR بشكل أساسي على إصمام الوريد البابي (PVE) ، لكن فعاليته محدودة إلى حد كبير. في السنوات الأخيرة ، كانت هناك العديد من التقارير حول طريقة جديدة لاستئصال الكبد ثنائي الطور تتضمن التقسيم الكبدي وربط الوريد البابي ، والمعروفة باسم ربط تقسيم الكبد وربط الوريد البابي لاستئصال الكبد على مراحل (ALPPS). يتفوق ALPPS على PVE في تضخم FLR بكفاءة وبشكل كبير. ومع ذلك ، فإن الآليات التفصيلية التي تقود التجديد الكبدي الميسر بواسطة ALPPS ليست مفهومة تماما. وبالتالي ، فإن تكرار ALPPS في النماذج الحيوانية أمر بالغ الأهمية للتحقيق الشامل في الآليات الجزيئية لتجديد الكبد ، وتقديم رؤى نظرية وعملية قيمة.

Introduction

يحتوي الكبد على إمكانات تجديد هائلة ، حيث يتكاثر بسرعة ويستعيد متطلبات التمثيل الغذائي في غضون 3 أشهر فقط بعد استئصال أمراض الكبد المتنوعة¹. ومع ذلك ، فإن حتمية التأكد من اكتمال هوامش الورم تستلزم حتمية الاستئصال الكبدي الموسع. وبالتالي ، فإن ضمان حجم كبير من الوسط الكبدي التشاركي ، المعروف باسم بقايا الكبد المستقبلية (FLR) ، يكتسب أهمية قصوى². لقد كان ALPPS تقنية متطورة في جراحة الكبد على مدى العقود القليلة الماضية ، مصممة خصيصا للمرضى الذين يعانون من عدم كفاية الحجم الكبدي المتبقي بعد استئصال الورم ، والتي تم الإعلان عنها كواحدة من أكثر الاختراقات الميمونة في مجال جراحة الأورام الكبدية³.

تم إحراز تقدم ملحوظ في تطوير النماذج الحيوانية ALPPS. يتطلب النموذج المثالي عادة تدفق الدم المستقل (الوريد البابي والشريان الكبدي) والتدفق الخارجي (الوريد الكبدي) في الفص الكبدي المحفوظ وفصل واضح بين الفص الكبدي المحفوظ والفص الكبدي المراد استئصاله لمنع الدورة الدموية الجانبية⁴. على الرغم من أن ALPPS يحفز التجدد الكبدي السريع في أنسجة الكبد المتبقية ، إلا أن الآليات المحددة لهذه العملية لا تزال غير واضحة.

حاليا ، يتم تصنيف نماذج ALPPS إلى ثلاثة أنواع: نماذج حيوانية كبيرة (مثل الخنازير والأغنام) ، ونماذج متوسطة الحجم (مثل الأرانب والقوارض) ، ونماذج صغيرة (مثل الفئران)⁵. يعد استخدام الفئران ، مع تكاثرها السريع وسهولة التعديل الوراثي ، فعالا بشكل خاص في الدراسات المتعمقة لآليات تجديد الكبد⁶. علاوة على ذلك ، فإن بنية الكبد للفئران ، وخاصة الوريد الكبدي الأوسط ، تشبه إلى حد كبير بنية البشر ، مما يجعلها مناسبة للغاية لتطوير نموذج ALPPS.

من المهم ملاحظة أن معظم مرضى سرطان الخلايا الكبدية في الممارسة السريرية يعانون من أمراض الكبد الكامنة ، على عكس نماذج الكبد الصحية المستخدمة عادة في الدراسات⁷. وبالتالي ، فإن استخدام الفئران المشروطة مسبقا بالتليف الكبدي أو الالتهابات الفيروسية يمكن أن يحاكي بدقة أكبر الاستجابات الجراحية وتجديد الكبد بعد العملية الجراحية في المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد المختلفة⁸. يمكن أن يكشف هذا النهج عن أهداف علاجية جديدة ذات أهمية سريرية.

حتى الآن ، نجحت بعض المجموعات البحثية الشهيرة ، مثل تلك الموجودة في جامعة زيورخ وجامعة طوكيو ، في تطوير نماذج ALPPS للفئران ^9,10. يمكن أن يؤدي إنشاء نموذج موحد للفأر في ظل ظروف خاضعة للرقابة إلى تعزيز فهمنا لتجديد الكبد السريع الذي لوحظ بعد إجراءات ALPPS.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب في هذا البروتوكول من قبل السلطات البيطرية في مستشفى مقاطعة جيانغشي الشعبي (رقم 70/2022). علاوة على ذلك ، تم تنفيذ جميع الخطوات التجريبية في الامتثال الصارم للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام.

1. بداية الجراحة

ملاحظة: تم إيواء ذكور الفئران C57BL / 6 التي تزن 20-22 جم في قفص جيد التهوية ، ويتم الاحتفاظ بها في بيئة قياسية خالية من مسببات الأمراض مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة / 12 ساعة. تم تزويد بإمكانية الوصول إلى الطعام والماء في درجة حرارة محيطة خاضعة للرقابة تبلغ 22 ± 1 درجة مئوية. تم إجراء الجراحة في غرفة جراحية مجهرية مخصصة باستخدام مجهر جراحي (الشكل 1). تم تشغيل الفئران في المجموعة الوهمية فقط عن طريق فتح البطن ، ولكن لم يتم إجراء أي عملية على الكبد. في مجموعة PVL ، تم ربط جزء من فروع الوريد البابي ، وفي مجموعة ALPPS ، تم نقل فص الكبد الأوسط على أساس ربط الوريد البابي (PVL).

1. إخضاع الفئران لفترة صيام 4-6 ساعات قبل الجراحة.
   ملاحظة: الصيام مطلوب لأن الأكل يسبب انتفاخ المعدة في الفئران ، ويؤدي إلى ضعف المجال الجراحي ويكون عرضة للتلف العرضي لجدار المعدة.
2. ترتيب الأدوات الجراحية المعقمة ، بما في ذلك الملقط الدقيق ، والمقص ، ومبعدات البطن ، والمعدة مسبقا 8-0 خيوط رباط الوريد البابي ، على طاولة جانبية. انقع المواد أثناء العملية التي تتكون من شاش معقم وكرات قطنية في محلول ملحي 37 درجة مئوية.
3. للتحريض ، قم بتعريض ل 5٪ v / v isoflurane لمدة 30 ثانية ، متبوعا بتخدير الصيانة باستخدام 3٪ vol٪ isoflurane حتى تحقيق حالة مخدر عميق. افحص منعكس قرصة إصبع القدم للتأكد من مستوى التخدير. حقن ميديتوميدين تحت الجلد بجرعة 5 ملغ/كغ خلال مرحلة التحريض.
4. ضع مرهما على عيون وحقن 1 مل من محلول رينغر المرضع الممزوج بالجلوكوز 5٪ تحت الجلد ، وقسم الجرعة بالتساوي بين أسفل البطن على كل جانب.
5. حلق منطقة البطن بدقة باستخدام ماكينات قص شعر الصغيرة ، بما في ذلك منطقة جانبية 2 سم من عملية الخنجري إلى المنطقة التناسلية.
6. تطهير موقع الجراحة تماما 3 مرات مع جولات بالتناوب من البوفيدون اليود والكحول.
7. قم بعمل شق بطول 2.5-3.0 سم في خط الوسط على الجلد باستخدام مشرط جراحي ، ثم استخدم المقص الجراحي لفتح تجويف البطن بدقة.
8. استخدم مبعدة البطن لتوسيع الشق ، مما يسهل الجر اللطيف للاثني عشر وجزء من الأمعاء الدقيقة باستخدام مسحات قطنية معقمة ورطبة. قم بتغطية هذه الهياكل بشاش معقم معد مسبقا ، مع تعريض الجزء الكبدي من الوريد البابي في وقت واحد.

2. ربط الوريد البابي (PVL)

ملاحظة: تأكد من أن جميع الإجراءات لطيفة طوال الإجراء بأكمله. استخدم كرات القطن المبللة عند التلاعب بأنسجة الكبد.

1. انزع الصفاق والأمعاء وتأكد من تعرض الوريد البابي بالكامل.
2. في سياق كشف الوريد البابي الرئيسي ، تابع تطويق فروعه باستخدام حركات بطيئة ومتعمدة للدفع إلى الأمام والانتشار.
3. حدد بالتتابع الفروع المختلفة للوريد البابي بالترتيب التالي: (1) الفرع الخلفي الأيمن ، (2) الفروع المتوسطة اليسرى واليسرى مجتمعة ، و (3) الفرع المذنب (الشكل 2 أ).

3. تشريح الفرع الخلفي الأيمن لفروع الوريد البابي

1. عند اجتياز الهيلوم الكبدي عبر الوريد البابي الرئيسي ، لاحظ فرعا واضحا من الفص الخلفي الأيمن أصبح مرئيا.
2. استخدم كرات القطن المبللة كعامل ملء وافصل الفص الأوسط للكبد والفص الخلفي الأيمن لتجنب الإصابة المحتملة.
3. تأكد من تشريح كبسولة غليسون (الصفاق الذي يمتد على سطح الكبد) وسحب حرير 1.5 سم لربطه حول فروع الوريد البابي.
4. ربط الفرع الخلفي الأيمن من الوريد البابي بنتيجة 8-0 خياطة الحرير. مؤشر موثوق لربط الوريد البابي الناجح هو شحوب الكبد المرئي.

4. تشريح الفروع الإنسية اليسرى واليسرى للوريد البابي

1. تشترك فروع الفص الجانبي الأيسر (LLL) والفص الإنسي الأيسر (أحب حياتي) في الوريد البابي الرئيسي المشترك. تأكد من تشريح أي فاصل محتمل بين LLL والفص المذنب.
   ملاحظة: ربط فروع LLL وأحب حياتي من الوريد البابي هو الأصعب في هذا النموذج الجراحي لأن الملقط الدقيق يجب أن يجتاز المساحة حول الوريد البابي ويتجنب إصابة الكبد.
2. أدخل micromailps من خلال المدخل في الخطوة 4.1 وحرك اليد ببطء ، حتى أدنى مقاومة تشير إلى القرب المحتمل من الكبد أو الأوعية الدموية.
3. عندما تشعر بالمقاومة ، اضبط الملقط الدقيق قليلا للتحرك للأمام وعبر سطح كبسولة جليسون للفص الإنسي الأيمن (RML) (الشكل 3C).
4. توظيف المعد 8-0 خياطة حريرية لربط الوريد البابي ل LLL وأحب فروع حياتي. ابحث عن ترسيم إقفاري مذهل داخل الفص الأوسط للكبد ، بينما يفترض الفص الأيسر شحوبا ، عند ربط فروع الوريد البابي.

5. تشريح الفرع المذنب لفروع الوريد البابي

1. تشريح الفص المذنب واستخدام مسحة القطن لملء الفراغ المحتمل بين الوريد البابي الرئيسي والفص المذنب.
2. انزع الصفاق من الفصوص المذنبة لتصور فروع الوريد البابي للفص.
3. استخدم خياطة الغرز بدلا من ربطها لربط الفرع المذنب ، مع التأكد من أن مسار الإبرة يلف بشكل كاف الفرع المذنب للوريد البابي.
   ملاحظة: تكمن صعوبة ربط الفرع المذنب للوريد البابي في أن الوريد البابي الفصي المذنب يغلف أنسجة الكبد وهو قريب من الوريد البابي الرئيسي. يوصى بعمق اختراق إبرة يبلغ 1 مم.

6. استئصال الكبد واستئصال المرارة

1. لاحظ خطا فاصلا مميزا في الفص الكبدي الأوسط وقم بإجراء المقطع على طول هذا الخط (الشكل 2 ب).
2. استخدم قلم الكي الكهربائي لإنشاء خط مقطوع مسبقا 0.5 مم على طول خط الترسيم.
3. استخدم ملقط دقيق وقلم كي كهربائي لقطع أنسجة الكبد ، وتطبيق مسحات القطن لوقف النزيف.
   ملاحظة: تكمن الصعوبة في عملية النقل في إتقان العمق. الهدف هو تقسيم الكبد بالقرب من الوريد الأجوف قدر الإمكان. من الصعب تجنب النزيف أثناء العملية ويتطلب ممارسة متكررة لإتقان عمق التقطيع. يمكن استخدام الحرق الساخن ومسحات القطن وإسفنج الجيلاتين للمساعدة في الإرقاء.
4. قم بإزالة المرارة أخيرا لأن هذا سيوفر نقطة سحب جيدة أثناء العملية بأكملها.
5. استخدم قطعة قطن لتطبيق الضغط المتحكم فيه للإرقاء ، وإذا استمر النزف ، يصاب الوريد الأجوف السفلي وسيكون تأثير إصلاح الخياطة ضعيفا ؛ القتل الرحيم للحيوان دون تردد.

7. الخطوات النهائية للجراحة

1. تأكد من وضع الأمعاء الدقيقة بدقة داخل تجويف البطن قبل الإغلاق.
2. أغلق الصفاق وجدار البطن بشكل آمن باستخدام خيوط قابلة للامتصاص 6-0 والجلد بخيوط قابلة للامتصاص 4-0.
3. تطهير سطح الجلد مرة أخرى لضمان النظافة المثلى.
4. يتم تطبيق 1 مل من المحلول الملحي والفنتانيل 0.02 ملغ/كغ تحت الجلد بالإضافة إلى ميلوكسيكام 4 ملغ/كغ في موقع الشق لتخفيف الألم بعد العملية الجراحية ومعالجة أي فقدان إضافي للسوائل أثناء العملية.
5. ضع على سطح دافئ لتسهيل الصحوة الطبيعية ، ومراقبة تدفق الدم إلى أطرافه. بعد ذلك ، قم بإيوائهم بشكل فردي في أقفاص للمراقبة المستمرة أثناء استعادة وعيهم.
6. حقن ميديتوميدين تحت الجلد بجرعة 4 ملغ/كغ عند الشفاء، ويستمر لمدة 24 ساعة بعد الجراحة.

8. القياس أثناء العملية لتجديد الكبد ووظائف الكبد

1. القتل الرحيم للفئران وجمع عينات الكبد والدم على فترات 1 و 2 و 3 و 7 أيام بعد الجراحة.
2. قم بإجراء اختبار تلطيخ HE واختبار وظائف الكبد وفحص علامات التهاب المصل ، وبالتالي توفير تحقق إضافي لتأثير بناء النموذج.
3. توثيق الاختلافات اليومية في وزن الجسم ونسبة FLR / BW (وزن الجسم) للفئران على مدى أسبوع 1 بعد العملية الجراحية.

النتائج

على عكس PVL (خطوات البروتوكول 2 و 3 و 4 و 5) ، أظهرت الفئران التي خضعت للتدخل الجراحي ALPPS (الخطوات 2،3،4،5 و 6) ميلا متزايدا نحو الانتشار الخلوي. يحدد الشكل 2 الترسيم الإقفاري لفص الكبد الأوسط بعد ربط الوريد البابي ، جنبا إلى جنب مع المجال البصري أثناء استئصال الكب?...

Discussion

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا للمرحلة الأولية من جراحة ALPPS في الفئران ، بما في ذلك الربط الجزئي للوريد البابي وانقسام فص الكبد المتوسط. تحاكي هذه الطريقة عن كثب إجراء ALPPS البشري ، مع الهيكل الفصيصي الفريد لكبد الفأر والإمداد الوريدي المزدوج البابي إلى الفص المتوسط لضمان تد?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% glucose injection (500 mL)	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20003666	Efficient, cheap,Easy to access
anaesthesia machine	RWD (www.rwdls.com)	R500	low price and valuable quality. It is suitable for operations with beginners
C57 BL/6	The Jackson Lab	22349-2023	Stability of strains
isoflurane	KCSW (kcsw.szqisoubao.com)	H19980141	durable, cost-effective
meloxicam	Boehringer-Ingelheim	H20020217	Durable and efficient
microforceps	maydeal	60018920	Durable and efficient
microinstrument	CH microsurgical instrument factory	HC-A804-1	durable, cost-effective
sodium lactate ringer	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20193277	Efficient, cheap, easy to access
suture line	CH microsurgical instrument factory	6-0/8-0	high performance-price ratio
topical antibodies	chenxin pharmacology (www.cisen-pharma.com)	H20020217	Effectively avoid incision infection