Un modello murino dell'associazione della partizione epatica e della legatura della vena porta per la procedura di epatectomia in stadi con l'ausilio della microscopia

Riepilogo

È stato dimostrato che l'associazione della partizione epatica e della legatura della vena porta per l'epatectomia a stadi (ALPPS) determina una notevole rigenerazione del fegato dopo diverse settimane dall'intervento chirurgico di primo stadio. Sono stati sviluppati modelli animali sottoposti ad ALPPS per esplorare la potenziale capacità di rigenerazione del fegato e ottenere risultati clinici favorevoli.

Abstract

L'epatectomia è ampiamente considerata il trattamento primario per le neoplasie epatiche; Tuttavia, l'insufficienza epatica postoperatoria rimane una delle principali cause di mortalità perioperatoria, con un grave impatto sugli esiti dei pazienti. In un ambiente epatico robusto, il futuro residuo epatico (FLR) deve superare il 25% e, nei casi di cirrosi, questo fabbisogno aumenta a oltre il 40%. L'inadeguatezza della FLR è attualmente un grave ostacolo nella progressione della chirurgia epatica.

I metodi tradizionali per migliorare l'ipertrofia FLR si concentrano principalmente sull'embolizzazione della vena porta (PVE), ma la sua efficacia è considerevolmente limitata. Negli ultimi anni, ci sono stati numerosi rapporti su un nuovo metodo di epatectomia bifasica che coinvolge la partizione epatica e la legatura della vena porta, nota come associazione di partizione epatica e legatura della vena porta per l'epatectomia a stadi (ALPPS). ALPPS supera la PVE nell'indurre in modo efficiente e considerevole l'ipertrofia FLR. Tuttavia, i meccanismi dettagliati che guidano la rigenerazione epatica facilitata da ALPPS non sono completamente compresi. Pertanto, replicare l'ALPPS in modelli animali è fondamentale per studiare a fondo i meccanismi molecolari della rigenerazione epatica, offrendo preziose intuizioni teoriche e pratiche.

Introduzione

Il fegato ha un formidabile potenziale rigenerativo, proliferando rapidamente e ripristinando le richieste metaboliche entro soli 3 mesi dalla resezione per diversi disturbi epatici¹. Tuttavia, l'imperativo di accertare la completezza dei margini tumorali richiede l'inevitabilità dell'escissione epatica espansiva. Pertanto, garantire un ampio volume dell'ambiente epatico partecipativo, noto come futuro residuo epatico (FLR), assume un'importanza fondamentale². L'ALPPS è stata una tecnica rivoluzionaria nella chirurgia epatica negli ultimi decenni, particolarmente adatta per i pazienti con volume epatico residuo inadeguato a seguito di resezione del tumore, annunciata come una delle scoperte più propizie nel campo della chirurgia oncologica epatica³.

Sono stati compiuti notevoli progressi nello sviluppo di modelli animali ALPPS. Un modello ideale richiede tipicamente un afflusso di sangue indipendente (vena porta e arteria epatica) e un efflusso (vena epatica) nel lobo epatico conservato e una netta separazione tra i lobi epatici conservati e quelli da resecare per prevenire la circolazione collaterale⁴. Sebbene l'ALPPS stimoli una rapida rigenerazione epatica nel tessuto epatico rimanente, i meccanismi specifici di questo processo non sono ancora chiari.

Attualmente, i modelli ALPPS sono classificati in tre tipi: modelli di animali di grandi dimensioni (ad esempio, suini e ovini), modelli di medie dimensioni (ad esempio, conigli e roditori) e modelli di piccole dimensioni (ad esempio, topi)⁵. L'uso dei topi, con la loro rapida riproduzione e facilità di modificazione genetica, è particolarmente efficace per studi approfonditi dei meccanismi di rigenerazione epatica⁶. Inoltre, la struttura epatica dei topi, in particolare la vena epatica media, assomiglia molto a quella degli esseri umani, rendendoli altamente adatti per lo sviluppo di modelli ALPPS.

È importante notare che la maggior parte dei pazienti con carcinoma epatocellulare nella pratica clinica presenta condizioni epatiche sottostanti, a differenza dei modelli di fegato sano tipicamente utilizzati negli studi⁷. Pertanto, l'utilizzo di topi precondizionati con fibrosi epatica o infezioni virali può simulare in modo più accurato le risposte chirurgiche e la rigenerazione epatica postoperatoria osservate in pazienti con varie malattie del fegato⁸. Questo approccio potrebbe rivelare nuovi bersagli terapeutici di rilevanza clinica.

Finora, alcuni rinomati gruppi di ricerca, come quelli dell'Università di Zurigo e dell'Università di Tokyo, hanno sviluppato con successo modelli ALPPS murini ^9,10. La creazione di un modello murino standardizzato in condizioni controllate potrebbe far progredire la nostra comprensione della rapida rigenerazione epatica osservata dopo le procedure ALPPS.

Protocollo

Tutti gli esperimenti di questo protocollo sono stati approvati dalle Autorità veterinarie dell'Ospedale del popolo provinciale di Jiangxi (numero 70/2022). Inoltre, tutte le fasi sperimentali sono state eseguite nel rigoroso rispetto del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali.

1. Inizio dell'intervento chirurgico

NOTA: I topi maschi C57BL/6 del peso di 20-22 g sono stati alloggiati in una gabbia ben ventilata, mantenuti in un ambiente standard privo di agenti patogeni con un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore. Agli animali è stato garantito l'accesso ad libitum a cibo e acqua a una temperatura ambiente controllata di 22 ± 1 °C. L'intervento è stato eseguito in una sala microchirurgica dedicata utilizzando un microscopio operatorio (Figura 1). I topi del gruppo fittizio sono stati operati solo per laparotomia, ma non è stata eseguita alcuna operazione sul fegato. Nel gruppo PVL, parte dei rami della vena porta è stata legata e nel gruppo ALPPS, il lobo medio del fegato è stato sezionato sulla base della legatura della vena porta (PVL).

1. Sottoporre i topi a un periodo di digiuno preoperatorio di 4-6 ore.
   NOTA: Il digiuno è necessario perché mangiare provoca rigonfiamento gastrico nei topi, si traduce in un campo chirurgico insufficiente ed è soggetto a danni accidentali alla parete gastrica.
2. Predisporre strumenti chirurgici sterili, tra cui micropinze, forbici, divaricatori addominali e 8-0 pre-preparati suture di legatura della vena porta, su un tavolino. Immergere i materiali intraoperatori, compresi una garza sterile e batuffoli di cotone, in una soluzione salina a 37 °C.
3. Per l'induzione, esporre gli animali a isoflurano al 5% v/v per 30 s, seguita da anestesia di mantenimento con isoflurano al 3% in volume fino a raggiungere uno stato anestetico profondo. Esaminare il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi per accertare il livello di anestesia. Iniettare per via sottocutanea medetomidina alla dose di 5 mg/kg durante la fase di induzione.
4. Applicare l'unguento sugli occhi degli animali e iniettare 1 ml di soluzione di Ringer lattato miscelata con glucosio al 5% per via sottocutanea, dividendo equamente la dose tra il basso ventre su ciascun lato.
5. Radere meticolosamente la regione addominale utilizzando un tagliacapelli per piccoli animali, che comprende un'area laterale di 2 cm dal processo xifoideo alla regione genitale.
6. Disinfettare accuratamente il sito chirurgico 3 volte con cicli alternati di iodio povidone e alcol.
7. Praticare un'incisione della linea mediana di 2,5-3,0 cm sulla pelle utilizzando un bisturi chirurgico, successivamente utilizzando le forbici chirurgiche per aprire delicatamente la cavità addominale.
8. Utilizzare il divaricatore addominale per espandere l'incisione, facilitando la trazione delicata del duodeno e di un segmento dell'intestino tenue utilizzando tamponi di cotone sterili e umidi. Coprire queste strutture con la garza sterile pre-preparata, esponendo contemporaneamente il segmento epatico della vena porta.

2. Legatura della vena porta (PVL)

NOTA: Assicurarsi che tutte le azioni siano delicate durante l'intera procedura. Usa batuffoli di cotone inumiditi quando manipoli il tessuto epatico.

1. Staccare il peritoneo e il tratto intestinale e assicurarsi che la vena porta sia completamente esposta.
2. Nel corso dell'esposizione della vena porta principale, procedere circondando i suoi rami con movimenti lenti, deliberati di spinta in avanti e di allargamento.
3. Identificare in sequenza i vari rami della vena porta nel seguente ordine: (1) il ramo posteriore destro, (2) i rami laterali sinistro e mediano sinistro combinati e (3) il ramo caudato (Figura 2A).

3. Dissezione del ramo posteriore destro dei rami della vena porta

1. Dopo aver attraversato l'ilo epatico attraverso la vena porta principale, osservare un ramo cospicuo del lobo posteriore destro che è diventato visibile.
2. Usa batuffoli di cotone inumiditi come agente follante e separa il lobo medio del fegato e il lobo posteriore destro per evitare potenziali lesioni.
3. Assicurati di sezionare lungo la capsula di Glisson (il peritoneo che si estende sulla superficie del fegato) e tirare una seta di 1,5 cm per legare attorno ai rami della vena porta.
4. Legare il ramo posteriore destro della vena porta con 8-0 sutura di seta. Un indicatore affidabile del successo della legatura della vena porta è il pallore visibile del fegato.

4. Dissezione dei rami laterale sinistro e mediale sinistro della vena porta

1. I rami del lobo laterale sinistro (LLL) e del lobo mediale sinistro (LML) condividono una vena porta principale comune. Assicurati di sezionare qualsiasi potenziale interstizio tra il LLL e il lobo caudato.
   NOTA: La legatura della LLL e i rami LML della vena porta sono i più difficili in questo modello chirurgico perché le micropinze devono attraversare lo spazio intorno alla vena porta ed evitare lesioni al fegato.
2. Introdurre le micropinze attraverso l'ingresso al passaggio 4.1 e muovere la mano lentamente, poiché anche la minima resistenza suggerisce la potenziale vicinanza al fegato o ai vasi sanguigni.
3. Quando si avverte resistenza, regolare leggermente le micropinze per spostarsi in avanti e attraverso la superficie della capsula di Glisson del lobo mediale destro (RML) (Figura 3C).
4. Impiega l'8-0 preparato sutura di seta da legare intorno alla vena porta del LLL e ai rami LML. Cerca una sorprendente demarcazione ischemica all'interno del lobo medio del fegato, mentre il lobo sinistro assume pallore, dopo la legatura dei rami della vena porta.

5. Dissezione del ramo caudato dei rami della vena porta

1. Sezionare il lobo caudato e utilizzare un batuffolo di cotone per riempire lo spazio potenziale tra la vena porta principale e il lobo caudato.
2. Staccare il peritoneo dei lobi caudati per visualizzare i rami della vena porta del lobo.
3. Utilizzare la sutura di cucitura piuttosto che legare per legare il ramo caudato, assicurandosi che il percorso dell'ago avvolga adeguatamente il ramo caudato della vena porta.
   NOTA: La difficoltà di legare il ramo caudato della vena porta è dovuta al fatto che la vena porta del lobo caudato incapsula il tessuto epatico ed è vicina alla vena porta principale. Si consiglia una profondità di penetrazione dell'ago di 1 mm.

6. Trassezione epatica e colecistectomia

1. Osservare una linea di demarcazione distinta nel lobo medio del fegato ed eseguire la transezione lungo questa linea (Figura 2B).
2. Utilizzare una penna per elettrocauterizzazione per creare una linea pretagliata di 0,5 mm lungo la linea di demarcazione.
3. Usa una micro pinza e una penna per elettrocauterizzazione per tagliare il tessuto epatico, applicando tamponi di cotone per fermare l'emorragia.
   NOTA: La difficoltà nella trassezione è quella di padroneggiare la profondità. L'obiettivo è dividere il fegato il più vicino possibile alla vena cava. Il sanguinamento intraoperatorio è difficile da evitare e richiede una pratica ripetitiva per padroneggiare la profondità della transezione. La combustione a caldo, i tamponi di cotone e le spugne di gelatina possono essere utilizzati per aiutare nell'emostasi.
4. Rimuovere la cistifellea per ultima in quanto ciò fornirà un buon punto di trazione durante l'intera operazione.
5. Utilizzare un batuffolo di cotone per applicare una pressione controllata per l'emostasi e, se l'emorragia persiste, la vena cava inferiore è ferita e l'effetto della riparazione della sutura sarà scarso; sopprimere l'animale senza esitazione.

7. Fasi finali dell'intervento chirurgico

1. Assicurarsi che l'intestino tenue sia posizionato meticolosamente all'interno della cavità addominale prima della chiusura.
2. Chiudere saldamente il peritoneo e la parete addominale utilizzando suture riassorbibili 6-0 e la pelle con suture riassorbibili 4-0.
3. Disinfettare nuovamente la superficie della pelle per garantire una pulizia ottimale.
4. Somministrare per via sottocutanea 1 mL di soluzione salina e fentanil 0,02 mg/kg più meloxicam 4 mg/kg nel sito di incisione per alleviare il dolore postoperatorio e affrontare qualsiasi perdita di liquidi intraoperatoria supplementare.
5. Posiziona l'animale su una superficie riscaldata per facilitare il risveglio naturale e monitora l'afflusso di sangue alle estremità. Successivamente, ospitali individualmente in gabbie per un'osservazione continua mentre riprendono conoscenza.
6. Iniettare per via sottocutanea medetomidina alla dose di 4 mg/kg al momento del recupero, continuando per 24 ore dopo l'intervento.

8. Misurazione intraoperatoria della rigenerazione epatica e della funzionalità epatica

1. Sopprimere i topi e raccogliere campioni di fegato e sangue a intervalli di 1, 2, 3 e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico.
2. Eseguire la colorazione HE e il test di funzionalità epatica ed esaminare i marcatori infiammatori sierici, fornendo così un'ulteriore convalida dell'impatto della costruzione del modello.
3. Documentare le variazioni giornaliere del peso corporeo e del rapporto FLR/BW (peso corporeo) dei topi nell'arco di 1 settimana dopo la procedura chirurgica.

Risultati

A differenza della PVL (fasi 2, 3, 4 e 5 del protocollo), i topi sottoposti all'intervento chirurgico ALPPS (fasi 2, 3, 4, 5 e 6) hanno dimostrato una maggiore propensione alla proliferazione cellulare. La Figura 2 delinea la demarcazione ischemica del lobo medio del fegato dopo la legatura della vena porta, insieme al campo visivo durante la transezione epatica, che rappresenta una distinzione chiave tra ALPPS e PVL. In particolare, i livelli di mediatori d...

Discussione

Questo studio presenta un protocollo per la fase iniziale della chirurgia ALPPS nei topi, che prevede la legatura parziale della vena porta e la divisione del lobo epatico mediano. Questo metodo imita da vicino la procedura ALPPS umana, con l'esclusiva struttura lobulare del fegato di topo e il doppio apporto venoso portale al lobo mediano che garantisce un flusso sanguigno distinto dopo l'intervento chirurgico¹¹. È interessante notare che la procedura ALPPS comp...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% glucose injection (500 mL)	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20003666	Efficient, cheap,Easy to access
anaesthesia machine	RWD (www.rwdls.com)	R500	low price and valuable quality. It is suitable for operations with beginners
C57 BL/6	The Jackson Lab	22349-2023	Stability of strains
isoflurane	KCSW (kcsw.szqisoubao.com)	H19980141	durable, cost-effective
meloxicam	Boehringer-Ingelheim	H20020217	Durable and efficient
microforceps	maydeal	60018920	Durable and efficient
microinstrument	CH microsurgical instrument factory	HC-A804-1	durable, cost-effective
sodium lactate ringer	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20193277	Efficient, cheap, easy to access
suture line	CH microsurgical instrument factory	6-0/8-0	high performance-price ratio
topical antibodies	chenxin pharmacology (www.cisen-pharma.com)	H20020217	Effectively avoid incision infection