显微镜辅助分期肝切除术的关联肝分区和门静脉结扎的小鼠模型

摘要

将肝分区和门静脉结扎术关联用于分期肝切除术 （ALPPS） 已被证明可在第一阶段手术后数周后导致显着的肝脏再生。已经开发了经过 ALPPS 的动物模型，以探索潜在的肝脏再生能力并取得良好的临床结果。

摘要

肝切除术被广泛认为是肝脏恶性肿瘤的主要治疗方法;然而，术后肝衰竭仍然是围手术期死亡的主要原因，严重影响患者的预后。在强大的肝脏环境中，未来残余肝脏 （FLR） 必须超过 25%，在肝硬化的情况下，这一要求增加到 40% 以上。FLR 的不足是目前肝脏手术进展的主要障碍。

增强 FLR 肥大的传统方法主要集中在门静脉栓塞 （PVE） 上，但其有效性相当有限。近年来，关于一种涉及肝分区和门静脉结扎的新型双相肝切除术方法的报道很多，称为将肝脏分区和门静脉结扎相关联进行分期肝切除术 （ALPPS）。ALPPS 在有效和显着诱导 FLR 肥大方面优于 PVE。然而，驱动 ALPPS 促进肝脏再生的详细机制尚不完全清楚。因此，在动物模型中复制 ALPPS 对于彻底研究肝脏再生的分子机制至关重要，提供有价值的理论和实践见解。

引言

肝脏具有强大的再生潜力，在切除各种肝脏疾病后的短短 3 个月内即可迅速增殖和恢复代谢需求¹。然而，确定肿瘤切缘完整性的必要性需要扩大性肝切除术的必然性。因此，确保参与性肝脏环境（称为未来残余肝 （FLR））的容量充足至关重要²。ALPPS 是过去几十年来肝脏外科领域的一项突破性技术，特别适合肿瘤切除后残余肝容量不足的患者，被誉为肝肿瘤外科领域最吉祥的突破之一³。

在开发 ALPPS 动物模型方面取得了显著进展。理想的模型通常需要在保留的肝叶中独立地流入（门静脉和肝动脉）和流出（肝静脉），并在保留的肝叶和待切除的肝叶之间明确分离，以防止侧支循环⁴。尽管 ALPPS 刺激剩余肝组织中的肝脏快速再生，但这一过程的具体机制仍不清楚。

目前，ALPPS 模型分为三种类型：大型动物模型（例如猪和羊）、中型模型（例如兔子和啮齿动物）和小型模型（例如小鼠）⁵。使用小鼠繁殖快、易于基因改造，对于深入研究肝脏再生机制特别有效⁶。此外，小鼠的肝脏结构，尤其是肝中静脉，与人类非常相似，使其非常适合 ALPPS 模型开发。

值得注意的是，与研究中通常使用的健康肝脏模型不同，临床实践中的大多数肝细胞癌患者都有潜在的肝脏疾病⁷。因此，使用预先适应肝纤维化或病毒感染的小鼠可以更准确地模拟各种肝病患者的手术反应和术后肝脏再生⁸。这种方法可以揭示具有临床相关性的新治疗靶点。

到目前为止，一些著名的研究小组，如苏黎世大学和东京大学的研究小组，已经成功开发了小鼠 ALPPS 模型 ^9,10。在受控条件下创建标准化小鼠模型可以促进我们对 ALPPS 手术后观察到的快速肝脏再生的理解。

研究方案

该方案中的所有实验均已获得江西省人民医院兽医当局（第 70/2022 号）的批准。此外，所有实验步骤均严格按照机构动物护理和使用委员会进行。

1. 手术开始

注意：将体重为 20-22 g 的雄性 C57BL/6 小鼠饲养在通风良好的笼子中，维持在标准无病原体的环境中，具有 12 小时/12 小时的光照/黑暗循环。动物在 22 ± °C 的受控环境温度下 随意 获取食物和水。 手术是在专用的显微外科室使用手术显微镜进行的（图 1）。假手术组小鼠仅行剖腹手术，未进行肝脏手术。PVL 组结扎部分门静脉分支，ALPPS 组在门静脉结扎 （PVL） 的基础上横切肝中叶。

1. 让小鼠进行术前 4-6 小时的禁食期。
   注意：禁食是必需的，因为进食会导致小鼠胃膨出，导致手术区域不佳，并且容易意外损伤胃壁。
2. 安排无菌手术器械，包括显微镊子、剪刀、腹部牵开器和预先准备好的 8-0门静脉结扎缝合线，在边桌上。将包含无菌纱布和棉球的术中材料浸泡在 37 °C 盐水溶液中。
3. 对于诱导，将动物暴露于 5% v/v 异氟醚 30 秒，然后使用 3 vol% 异氟醚维持麻醉，直至达到深度麻醉状态。检查脚趾捏反射以确定麻醉程度。在诱导期皮下注射剂量为 5 mg/kg 的美托咪定。
4. 将软膏涂抹在动物的眼睛上，皮下注射 1 mL 与 5% 葡萄糖混合的乳酸林格氏液，在每侧的下腹部之间平均分配剂量。
5. 使用小动物理发器仔细剃除腹部区域，包括从剑突到生殖器区域的 2 厘米外侧区域。
6. 用聚维酮碘和酒精交替对手术部位彻底消毒 3 次。
7. 使用手术刀在皮肤上做一个 2.5-3.0 厘米的中线切口，然后用手术剪刀小心翼翼地打开腹腔。
8. 使用腹部牵开器扩大切口，使用无菌、湿润的棉签促进轻柔地牵引十二指肠和一段小肠。用预先准备好的无菌纱布覆盖这些结构，同时暴露门静脉的肝段。

2. 门静脉结扎术 （PVL）

注意：确保在整个过程中所有动作都轻柔。操作肝组织时使用湿润的棉球。

1. 剥去腹膜和肠道，确保门静脉完全暴露。
2. 在暴露主门脉的过程中，通过缓慢、刻意的向前推进和扩张的动作来包围它的分支。
3. 按以下顺序依次识别门静脉的各个分支：（1） 右后支，（2） 组合的左侧和左侧正中分支，以及 （3） 尾状核分支（图 2A）。

3. 门静脉分支右后支解剖

1. 通过主门静脉穿过肝门叶后，观察到右后叶的一个明显分支已经可见。
2. 使用湿润的棉球作为填充剂，将肝脏的中叶和右后叶分开，以避免潜在的损伤。
3. 一定要沿着 Glisson 囊（延伸到肝脏表面的腹膜）解剖，并拉出 1.5 厘米的丝绸系在门静脉分支上。
4. 用 8-0 连接门静脉的右后支丝缝合线。门静脉结扎成功的可靠指标是肝脏可见苍白。

4. 门静脉左侧和左侧内侧支夹层

1. 左外侧叶 （LLL） 和左内侧叶 （LML） 分支共享一个共同的主门静脉。请务必剖析 LLL 和尾状叶之间的任何潜在间隙。
   注意：在这种手术模型中，LLL 和门静脉分支的结扎是最困难的，因为微镊子必须穿过门静脉周围的空间并避免肝损伤。
2. 在步骤 4.1 中，将显微镊子通过入口并缓慢移动手，因为即使是最轻微的阻力也暗示可能接近肝脏或血管。
3. 当感到阻力时，稍微调整微镊子以向前移动并穿过右内侧叶 （RML） 的 Glisson 囊表面（图 3C）。
4. 使用准备好的 8-0丝绸缝合线系在 LLL 和 LML 分支的门静脉上。在门静脉分支结扎后，在肝中叶内寻找明显的缺血分界，而左叶呈苍白。

5. 门静脉分支尾状核解剖

1. 解剖尾状叶，用棉签填充主门静脉和尾状叶之间的潜在空间。
2. 剥去尾状核叶的腹膜，以观察叶的门静脉分支。
3. 使用 Stitch-up 缝合线而不是系带来结扎尾状核支，确保针路充分包裹门静脉的尾状核支。
   注意：结扎门静脉尾状核支的困难是因为尾状叶门静脉包裹着肝组织，靠近主门静脉。建议针的穿透深度为 1 mm。

6. 肝横切术和胆囊切除术

1. 在肝叶中观察到一条明显的分界线，并沿这条线进行横切（图 2B）。
2. 使用电烙笔沿分界线创建一条 0.5 毫米的预切割线。
3. 使用微型镊子和电烙笔切割肝组织，使用棉签止血。
   注意：横断面的难点是掌握深度。目标是将肝脏尽可能靠近腔静脉劈开。术中出血难以避免，需要反复练习以掌握横断面深度。热灼热、棉签和明胶海绵可用于辅助止血。
4. 最后取出胆囊，因为这将在整个手术过程中提供良好的拉动点。
5. 用棉签控制压力止血，如果出血持续，下腔静脉受伤，缝合修复效果会差;毫不犹豫地对动物实施安乐死。

7. 手术的最后步骤

1. 确保在闭合前将小肠仔细放置在腹腔内。
2. 使用 6-0 可吸收缝合线牢固闭合腹膜和腹壁，并使用 4-0 可吸收缝合线牢固闭合皮肤。
3. 再次对皮肤表面进行消毒，以确保最佳清洁度。
4. 在切口部位皮下注射 1 mL 生理盐水和芬太尼 0.02 mg/kg 加美洛昔康 4 mg/kg，以减轻术后疼痛并解决任何补充的术中液体流失。
5. 将动物放在温暖的表面上，以促进自然觉醒，并监测其四肢的血液供应。随后，将它们单独关在笼子里，以便在它们恢复意识时继续观察。
6. 恢复后以 4 mg/kg 的剂量皮下注射美托咪定，术后持续 24 小时。

8. 术中肝脏再生和肝功能的测量

1. 对小鼠实施安乐死，并在手术后 1 、 2 、 3 和 7 天间隔收集肝脏和血液样本。
2. 进行 HE 染色和肝功能测试并检查血清炎症标志物，从而为模型构建的影响提供额外的验证。
3. 记录手术后 1 周内小鼠体重和 FLR/BW（体重）比率的每日变化。

结果

与 PVL （方案步骤 2、3、4 和 5） 相比，接受 ALPPS （步骤 2、3、4、5 和 6）手术干预的小鼠表现出细胞增殖的倾向性增强。 图 2 描绘了门静脉结扎后肝中叶的缺血性分界，以及肝脏横断过程中的视野，这代表了 ALPPS 和 PVL 之间的关键区别。值得注意的是，肝组织内炎症介质的水平，包括肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、白细胞介素和肝生长因子 （HGF），?...

讨论

本研究提出了小鼠 ALPPS 手术初始阶段的方案，涉及门静脉的部分结扎和正中肝叶的分裂。该方法与人类 ALPPS 程序非常相似，小鼠肝脏独特的小叶结构和通往正中叶的双门静脉供应确保了术后不同的血流¹¹。值得注意的是，ALPPS 手术包括两个不同的手术阶段。在这项研究中，我们专门介绍了涉及门静脉分支结扎和肝横断术的初始阶段，表示为 PVL+T。值得?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% glucose injection (500 mL)	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20003666	Efficient, cheap,Easy to access
anaesthesia machine	RWD (www.rwdls.com)	R500	low price and valuable quality. It is suitable for operations with beginners
C57 BL/6	The Jackson Lab	22349-2023	Stability of strains
isoflurane	KCSW (kcsw.szqisoubao.com)	H19980141	durable, cost-effective
meloxicam	Boehringer-Ingelheim	H20020217	Durable and efficient
microforceps	maydeal	60018920	Durable and efficient
microinstrument	CH microsurgical instrument factory	HC-A804-1	durable, cost-effective
sodium lactate ringer	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20193277	Efficient, cheap, easy to access
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topical antibodies	chenxin pharmacology (www.cisen-pharma.com)	H20020217	Effectively avoid incision infection