Un modelo de ratón de la partición hepática asociada y la ligadura de la vena porta para el procedimiento de hepatectomía por etapas con ayuda de microscopía

Resumen

Se ha demostrado que la asociación de la partición hepática y la ligadura de la vena porta para la hepatectomía por etapas (ALPPS) da lugar a una regeneración hepática notable después de varias semanas después de la cirugía de primera etapa. Se han desarrollado modelos animales que se han sometido a ALPPS para explorar la posible capacidad de regeneración hepática y lograr resultados clínicos favorables.

Resumen

La hepatectomía es ampliamente considerada como el tratamiento primario para las neoplasias malignas hepáticas; Sin embargo, la insuficiencia hepática postoperatoria sigue siendo una causa importante de mortalidad perioperatoria, lo que afecta gravemente los resultados de los pacientes. En un ambiente hepático robusto, el futuro remanente hepático (FLR) debe superar el 25%, y en casos de cirrosis, este requerimiento aumenta a más del 40%. La insuficiencia de la FLR es actualmente un obstáculo importante en la progresión de la cirugía hepática.

Los métodos tradicionales para mejorar la hipertrofia de la FLR se centran principalmente en la embolización de la vena porta (EVP), pero su eficacia es considerablemente limitada. En los últimos años, ha habido numerosos informes sobre un nuevo método de hepatectomía bifásica que involucra la partición hepática y la ligadura de la vena porta, conocida como partición hepática asociada y ligadura de la vena porta para la hepatectomía por etapas (ALPPS). La ALPPS supera a la PVE en la hipertrofia FLR de manera eficiente y considerable. Sin embargo, los mecanismos detallados que impulsan la regeneración hepática facilitada por ALPPS no se comprenden completamente. Por lo tanto, la replicación de ALPPS en modelos animales es crucial para investigar a fondo los mecanismos moleculares de la regeneración hepática, lo que ofrece valiosos conocimientos teóricos y prácticos.

Introducción

El hígado alberga un formidable potencial regenerativo, proliferando rápidamente y restaurando las demandas metabólicas^en tan solo 3 meses después de la resección de diversas dolencias hepáticas. Sin embargo, el imperativo de determinar la integridad de los márgenes tumorales requiere la inevitabilidad de la escisión hepática expansiva. Por lo tanto, asegurar un amplio volumen del medio hepático participativo, conocido como el futuro remanente hepático (FLR), asume una importancia primordial². La ALPPS ha sido una técnica pionera en cirugía hepática en las últimas décadas, especialmente adaptada a los pacientes con volumen hepático residual inadecuado tras la resección tumoral, anunciada como uno de los avances más auspiciosos en el ámbito de la cirugía oncológica hepática³.

Se han realizado progresos notables en el desarrollo de modelos animales de ALPPS. Un modelo ideal suele requerir un flujo sanguíneo independiente de entrada (vena porta y arteria hepática) y de salida (vena hepática) en el lóbulo hepático preservado y una separación clara entre los lóbulos hepáticos preservados y los que se van a resecar para evitar la circulación colateral⁴. Aunque la ALPPS estimula la rápida regeneración hepática en el tejido hepático restante, los mecanismos específicos de este proceso aún no están claros.

En la actualidad, los modelos de ALPPS se clasifican en tres tipos: modelos animales grandes (p. ej., cerdos y ovejas), modelos medianos (p. ej., conejos y roedores) y modelos pequeños (p. ej., ratones)⁵. El uso de ratones, con su rápida reproducción y facilidad de modificación genética, es particularmente eficaz para estudios en profundidad de los mecanismos de regeneración hepática⁶. Además, la estructura hepática de los ratones, especialmente su vena hepática media, se parece mucho a la de los humanos, lo que los hace muy adecuados para el desarrollo de modelos de ALPPS.

Es importante destacar que la mayoría de los pacientes con carcinoma hepatocelular en la práctica clínica presentan afecciones hepáticas subyacentes, a diferencia de los modelos de hígado sano que se utilizan habitualmente en los estudios⁷. Así, el uso de ratones precondicionados con fibrosis hepática o infecciones virales puede simular con mayor precisión las respuestas quirúrgicas y la regeneración hepática postoperatoria observada en pacientes con diversas enfermedades hepáticas⁸. Este enfoque podría revelar nuevas dianas terapéuticas de relevancia clínica.

Hasta ahora, algunos grupos de investigación de renombre, como los de la Universidad de Zúrich y la Universidad de Tokio, han desarrollado con éxito modelos murinos de ALPPS ^9,10. La creación de un modelo murino estandarizado en condiciones controladas podría avanzar en nuestra comprensión de la rápida regeneración hepática observada después de los procedimientos de ALPPS.

Protocolo

Todos los experimentos de este protocolo fueron aprobados por las Autoridades Veterinarias del Hospital Popular Provincial de Jiangxi (número 70/2022). Además, todas las etapas experimentales se realizaron en estricto cumplimiento del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.

1. Inicio de la cirugía

NOTA: Los ratones machos C57BL/6 que pesaban entre 20 y 22 g se alojaron en una jaula bien ventilada, mantenida en un entorno estándar libre de patógenos con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. Se proporcionó a los animales acceso ad libitum a alimentos y agua a una temperatura ambiente controlada de 22 ± 1 °C. La cirugía se realizó en una sala de microcirugía específica utilizando un microscopio quirúrgico (Figura 1). Los ratones del grupo simulado solo fueron operados por laparotomía, pero no se realizó ninguna operación en el hígado. En el grupo de PVL, se ligaron parte de las ramas de la vena porta, y en el grupo de ALPPS, el lóbulo medio del hígado se seccionó sobre la base de la ligadura de la vena porta (PVL).

1. Someter a los ratones a un período de ayuno preoperatorio de 4-6 h.
   NOTA: El ayuno es necesario porque comer causa protuberancia gástrica en ratones, resulta en un campo quirúrgico deficiente y es propenso a daños accidentales en la pared gástrica.
2. Organice instrumentos quirúrgicos estériles, incluidos microfórceps, tijeras, retractores abdominales y 8-0 preparados previamente Suturas de ligadura de vena porta, en una mesa auxiliar. Remojar los materiales intraoperatorios compuestos por gasas estériles y bolas de algodón en solución salina a 37 °C.
3. Para la inducción, exponer a los animales a isoflurano al 5% v/v durante 30 s, seguido de anestesia de mantenimiento con isoflurano al 3% vol% hasta alcanzar un estado anestésico profundo. Examine el reflejo de pellizco del dedo del pie para determinar el nivel de anestesia. Inyectar medetomidina por vía subcutánea a una dosis de 5 mg/kg durante la fase de inducción.
4. Aplicar pomada en los ojos de los animales e inyectar 1 mL de solución de Ringer lactato mezclada con glucosa al 5% por vía subcutánea, dividiendo la dosis en partes iguales entre la parte inferior del abdomen a cada lado.
5. Afeitar meticulosamente la región abdominal con cortapelos de animales pequeños, abarcando un área lateral de 2 cm desde la apófisis xifoides hasta la región genital.
6. Desinfecte a fondo el sitio quirúrgico 3 veces con rondas alternas de povidona yodada y alcohol.
7. Realice una incisión de 2,5-3,0 cm en la línea media de la piel con un bisturí quirúrgico, utilizando posteriormente unas tijeras quirúrgicas para abrir delicadamente la cavidad abdominal.
8. Utilice el retractor abdominal para expandir la incisión, facilitando la tracción suave del duodeno y un segmento del intestino delgado utilizando hisopos de algodón estériles y húmedos. Cubra estas estructuras con la gasa estéril preparada previamente, exponiendo simultáneamente el segmento hepático de la vena porta.

2. Ligadura de la vena porta (PVL)

NOTA: Asegúrese de que todas las acciones sean suaves durante todo el procedimiento. Use bolas de algodón humedecidas cuando manipule el tejido hepático.

1. Pele el peritoneo y el tracto intestinal y asegúrese de que la vena porta esté completamente expuesta.
2. En el curso de la exposición de la vena porta principal, proceda rodeando sus ramas con movimientos lentos y deliberados de empuje y expansión hacia adelante.
3. Identifique secuencialmente las diversas ramas de la vena porta en el siguiente orden: (1) la rama posterior derecha, (2) las ramas lateral izquierda y mediana izquierda combinadas, y (3) la rama caudada (Figura 2A).

3. Disección de la rama posterior derecha de las ramas de la vena porta

1. Al atravesar el hilio hepático a través de la vena porta principal, observe una rama conspicua del lóbulo posterior derecho que se ha vuelto visible.
2. Use bolas de algodón humedecidas como agente de relleno y separe el lóbulo medio del hígado y el lóbulo posterior derecho para evitar posibles lesiones.
3. Asegúrese de diseccionar a lo largo de la cápsula de Glisson (el peritoneo que se extiende sobre la superficie del hígado) y tire de una seda de 1,5 cm para atar alrededor de las ramas de la vena porta.
4. Ligar la rama posterior derecha de la vena porta con 8-0 Sutura de seda. Un indicador fiable del éxito de la ligadura de la vena porta es la palidez visible del hígado.

4. Disección de las ramas lateral izquierda y medial izquierda de la vena porta

1. Las ramas del lóbulo lateral izquierdo (LLL) y del lóbulo medial izquierdo (love my life) comparten una vena porta principal común. Asegúrese de diseccionar cualquier posible intersticio entre la LLL y el lóbulo caudado.
   NOTA: La ligadura de las ramas LLL y love my life de la vena porta es la más difícil en este modelo quirúrgico porque las micropinzas deben atravesar el espacio alrededor de la vena porta y evitar la lesión hepática.
2. Introduzca las micropinzas a través de la entrada en el paso 4.1 y mueva la mano lentamente, ya que incluso la más mínima resistencia insinúa la posible proximidad al hígado o a los vasos sanguíneos.
3. Cuando se sienta resistencia, ajuste ligeramente las micropinzas para avanzar y atravesar la superficie de la cápsula de Glisson del lóbulo medial derecho (RML) (Figura 3C).
4. Emplea el 8-0 preparado sutura de seda para atar alrededor de la vena porta de las ramas LLL y love my life. Busque una demarcación isquémica llamativa dentro del lóbulo medio del hígado, mientras que el lóbulo izquierdo asume palidez, tras la ligadura de las ramas de la vena porta.

5. Disección de la rama caudada de las ramas de la vena porta

1. Diseccione el lóbulo caudado y use un hisopo de algodón para llenar el espacio potencial entre la vena porta principal y el lóbulo caudado.
2. Despegue el peritoneo de los lóbulos caudados para visualizar las ramas de la vena porta del lóbulo.
3. Utilice la sutura de sutura en lugar de atar para ligar la rama caudalizada, asegurándose de que la trayectoria de la aguja envuelva adecuadamente la rama caudada de la vena porta.
   NOTA: La dificultad de ligar la rama caudada de la vena porta se debe a que la vena porta del lóbulo caudado encapsula el tejido hepático y está cerca de la vena porta principal. Se recomienda una profundidad de penetración de la aguja de 1 mm.

6. Transsección hepática y colecistectomía

1. Observe una línea de demarcación distinta en el lóbulo medio del hígado y realice la transección a lo largo de esta línea (Figura 2B).
2. Utilice un bolígrafo de electrocauterio para crear una línea de precorte de 0,5 mm a lo largo de la línea de demarcación.
3. Use micropinzas y una pluma de electrocauterización para cortar el tejido hepático, aplicando hisopos de algodón para detener el sangrado.
   NOTA: La dificultad en la transección es dominar la profundidad. El objetivo es dividir el hígado lo más cerca posible de la vena cava. El sangrado intraoperatorio es difícil de evitar y requiere práctica repetitiva para dominar la profundidad de la transección. Se pueden usar esponjas de gelatina y hisopos de algodón quemados en caliente para ayudar en la hemostasia.
4. Retire la vesícula biliar al final, ya que esto proporcionará un buen punto de tracción durante toda la operación.
5. Emplee un hisopo de algodón para aplicar presión controlada para la hemostasia, y si la hemorragia persiste, la vena cava inferior se lesiona y el efecto de la reparación de la sutura será pobre; Practica la eutanasia al animal sin dudarlo.

7. Pasos finales de la cirugía

1. Asegurar la colocación meticulosa del intestino delgado dentro de la cavidad abdominal antes del cierre.
2. Cierre de forma segura el peritoneo y la pared abdominal con suturas reabsorbibles 6-0 y la piel con suturas reabsorbibles 4-0.
3. Vuelva a desinfectar la superficie de la piel para garantizar una limpieza óptima.
4. Por vía subcutánea, administre 1 mL de solución salina y fentanilo 0,02 mg/kg más meloxicam 4 mg/kg en el sitio de la incisión para aliviar el dolor postoperatorio y tratar cualquier pérdida de líquido intraoperatorio suplementaria.
5. Coloque al animal sobre una superficie caliente para facilitar el despertar natural y controle el suministro de sangre a sus extremidades. Posteriormente, alójelos individualmente en jaulas para su observación continua mientras recuperan la conciencia.
6. Inyectar medetomidina por vía subcutánea a una dosis de 4 mg/kg en el momento de la recuperación, continuando durante 24 h en el postoperatorio.

8. Medición intraoperatoria de la regeneración hepática y la función hepática

1. Eutanasiar a los ratones y recolectar muestras de hígado y sangre a intervalos de 1, 2, 3 y 7 días después de la cirugía.
2. Realice la tinción de HE y la prueba de función hepática y examine los marcadores inflamatorios séricos, proporcionando así una validación adicional para el impacto de la construcción del modelo.
3. Documentar las variaciones diarias en el peso corporal y la relación FLR/BW (peso corporal) de los ratones durante un lapso de 1 semana después del procedimiento quirúrgico.

Resultados

A diferencia de la PVL (pasos 2, 3, 4 y 5 del protocolo), los ratones que se sometieron a la intervención quirúrgica ALPPS (pasos 2, 3, 4, 5 y 6) demostraron una mayor proclividad a la proliferación celular. La figura 2 delinea la demarcación isquémica del lóbulo medio del hígado después de la ligadura de la vena porta, junto con el campo visual durante la transección hepática, que representa una distinción clave entre ALPPS y PVL. En particular, ...

Discusión

En este estudio se presenta un protocolo para la fase inicial de la cirugía de ALPPS en ratones, que consiste en la ligadura parcial de la vena porta y la división del lóbulo hepático mediano. Este método imita de cerca el procedimiento de ALPPS humano, con la estructura lobulillar única del hígado de ratón y el suministro venoso portal dual al lóbulo mediano que garantiza un flujo sanguíneo distinto después de la cirugía¹¹. Cabe destacar que el proced...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% glucose injection (500 mL)	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20003666	Efficient, cheap,Easy to access
anaesthesia machine	RWD (www.rwdls.com)	R500	low price and valuable quality. It is suitable for operations with beginners
C57 BL/6	The Jackson Lab	22349-2023	Stability of strains
isoflurane	KCSW (kcsw.szqisoubao.com)	H19980141	durable, cost-effective
meloxicam	Boehringer-Ingelheim	H20020217	Durable and efficient
microforceps	maydeal	60018920	Durable and efficient
microinstrument	CH microsurgical instrument factory	HC-A804-1	durable, cost-effective
sodium lactate ringer	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20193277	Efficient, cheap, easy to access
suture line	CH microsurgical instrument factory	6-0/8-0	high performance-price ratio
topical antibodies	chenxin pharmacology (www.cisen-pharma.com)	H20020217	Effectively avoid incision infection