顕微鏡法による段階的肝切除術のための関連肝パーティションおよび門脈結紮のマウスモデル

要約

段階的肝切除術 (ALPPS) のための肝臓分割と門脈結紮を関連付けると、第 1 段階の手術後数週間後に顕著な肝臓再生がもたらされることが示されています。ALPPSを受けた動物モデルは、潜在的な肝臓再生能力を探求し、良好な臨床結果を達成するために開発されました。

要約

肝切除術は、肝悪性腫瘍の主要な治療法と広く見なされています。それでも、術後肝不全は依然として周術期死亡の主な原因であり、患者の転帰に深刻な影響を及ぼしています。堅牢な肝臓環境では、将来の肝残存物(FLR)は25%を超える必要があり、肝硬変の場合、この要件は40%以上に増加します。FLRの不十分さは、現在、肝臓手術の進行における大きな障害となっています。

FLR肥大を強化する従来の方法は、主に門脈塞栓術(PVE)に焦点を当てていますが、その有効性はかなり限られています。近年、肝臓分割と門脈結紮の関連付けとして知られる、肝分割と門脈結紮を伴う新しい二相性肝切除術法に関する多数の報告があります ステージ肝切除術 (ALPPS)。ALPPSは、効率的かつ大幅にFLR肥大を誘導する点でPVEを上回っています。しかし、ALPPSが促進する肝再生を駆動する詳細なメカニズムは十分には解明されていません。したがって、ALPPSを動物モデルで再現することは、肝臓再生の分子メカニズムを徹底的に調査するために重要であり、貴重な理論的および実践的な洞察を提供します。

概要

肝臓は恐ろしい再生能力を秘めており、さまざまな肝疾患の切除後わずか3か月で代謝要求を急速に増殖および回復します¹。しかし、腫瘍の縁の完全性を確認する必要性は、広範な肝切除の必然性を必要とします。したがって、将来の肝残骸(FLR)として知られる参加型肝環境の十分な量を確保することは、最も重要性を帯びています²。ALPPSは、過去数十年にわたる肝臓手術における画期的な技術であり、特に腫瘍切除後の残存肝量が不十分な患者向けに調整されており、肝臓腫瘍手術の領域で最も縁起の良いブレークスルーの1つとして歓迎されています³。

ALPPS動物モデルの開発は目覚ましい進歩を遂げています。理想的なモデルでは、典型的には、保存された肝葉における独立した血液流入(門脈と肝動脈)と流出(肝静脈)が必要であり、側副循環を防ぐために保存された肝葉と切除される肝葉との間に明確な分離^{が必要である4。}ALPPSは、残存する肝臓組織における肝臓の急速な再生を促しますが、その具体的なメカニズムはまだ解明されていません。

現在、ALPPSモデルは、大型動物モデル(豚や羊など)、中型モデル(ウサギやげっ歯類など)、小型モデル(マウス^など)の3種類に分類されています5。マウスの使用は、その迅速な繁殖と遺伝子改変の容易さから、肝臓の再生メカニズムの徹底的な研究に特に効果的である⁶。また、マウスの肝臓構造、特に中肝静脈はヒトの肝臓構造に酷似しており、ALPPSモデルの開発に非常に適しています。

臨床診療におけるほとんどの肝細胞がん患者は、研究で通常使用される健康な肝臓モデルとは異なり、基礎疾患を持っていることに注意することが重要です⁷。したがって、肝線維症またはウイルス感染をプレコンディショニングしたマウスを使用すると、さまざまな^{肝疾患の患者}に見られる外科的反応および術後の肝臓再生をより正確にシミュレートできる8。このアプローチにより、臨床的に関連性のある新たな治療標的が明らかになる可能性があります。

これまでに、チューリッヒ大学や東京大学などのいくつかの有名な研究グループが、マウスALPPSモデル^9,10の開発に成功しています。制御された条件下で標準化されたマウスモデルを作成することで、ALPPS処置後に観察される急速な肝臓再生についての理解が深まる可能性があります。

プロトコル

このプロトコルのすべての実験は、江西省人民病院の獣医当局によって承認されました(番号70/2022)。さらに、すべての実験ステップは、施設動物管理および使用委員会に厳密に準拠して実施されました。

1. 手術開始

注:体重20〜22gの雄C57BL/6マウスを換気の良いケージに収容し、標準的な病原体のない環境で12時間/12時間の明暗サイクルで維持しました。動物たちは、22°Cから1°Cに制御された周囲温度で、餌と水 を自由に摂取± ことができました。 手術は、専用の顕微手術室で手術用顕微鏡を用いて行いました(図1)。偽群のマウスは開腹術のみで手術されましたが、肝臓の手術は行われませんでした。PVL群では門脈枝の一部を結紮し、ALPPS群では門脈結紮術(PVL)に基づいて中肝葉を切除した。

1. マウスを術前4〜6時間の絶食期間にさらします。
   注:食事はマウスの胃の膨らみを引き起こし、手術野が悪くなり、胃壁に偶発的な損傷を受けやすいため、絶食が必要です。
2. マイクロ鉗子、はさみ、腹部開創器、および事前に準備された8-0を含む滅菌手術器具を手配しますサイドテーブル上の門脈結紮糸縫合糸。滅菌ガーゼとコットンボールからなる術中材料を37°Cの生理食塩水に浸します。
3. 導入のために、動物を5%v / vイソフルランに30秒間さらし、続いて3vol%イソフルランを使用して深い麻酔状態を達成するまで維持麻酔をかけます。つま先のつま先つまみ反射を調べて、麻酔のレベルを確認します。導入期にメデトミジンを5 mg / kgの用量で皮下注射します。.
4. 動物の目に軟膏を塗布し、5%グルコースと混合した1 mLの乳酸リンゲル液を皮下に注射し、両側の下腹部に均等に用量を分けます。.
5. 小動物のバリカンを使用して、剣状突起から生殖器領域までの2cmの横方向の領域を含む腹部を細心の注意を払って剃ります。
6. ポビドンヨードとアルコールを交互に繰り返して、手術部位を3回徹底的に消毒します。
7. 外科用メスを使用して皮膚に2.5〜3.0cmの正中線切開を行い、その後、外科用ハサミを使用して腹腔を繊細に開きます。
8. 腹部リトラクターを使用して切開部を拡大し、滅菌された湿った綿棒を使用して十二指腸と小腸の一部を穏やかに牽引します。これらの構造を事前に準備された滅菌ガーゼで覆い、同時に門脈の肝部分を露出させます。

2. 門脈結紮術(PVL)

注意: 手順全体を通して、すべてのアクションが穏やかであることを確認してください。肝臓組織を操作するときは、湿らせた綿球を使用してください。

1. 腹膜と腸管をはがし、門脈が完全に露出していることを確認します。
2. メインポータル静脈を露出させる過程で、ゆっくりと意図的に前方に押し広げる動きを使用して、その枝を取り囲むように進めます。
3. 門脈のさまざまな枝を、(1)右後枝、(2)左外側と左正中枝の組み合わせ、(3)尾状枝の順に順番に特定します(図2A)。

3. 門脈枝の右後枝の解剖

1. 主門脈を介して肝門を横切ると、見えるようになった右後葉の目立つ枝を観察します。
2. 湿らせたコットンボールを充填剤として使用し、肝臓の中葉と右後葉を分離して、潜在的な損傷を防ぎます。
3. グリッソン嚢(肝臓の表面に広がる腹膜)に沿って解剖し、1.5cmの絹を引っ張って門脈の枝の周りに結びます。
4. 門脈の右後枝を8-0で結紮しますシルク縫合糸。門脈結紮の成功を示す信頼できる指標は、肝臓の目に見える蒼白です。

4.門脈の左外側枝と左内側枝の解剖

1. 左外側葉(LLL)と左内側葉(LML)の枝は、共通の主要な門脈を共有しています。LLLと尾状葉の間の潜在的な間隙を必ず解剖してください。
   注:LLLと門脈のLMLブランチの結紮は、マイクロ鉗子が門脈の周りの空間を横断し、肝臓の損傷を避ける必要があるため、この手術モデルで最も困難です。
2. ステップ4.1で入り口から微小鉗子を導入し、わずかな抵抗でも肝臓や血管に近接している可能性を示唆するため、手をゆっくりと動かします。
3. 抵抗が感じられたら、マイクロ鉗子をわずかに調整して、右内側葉(RML)のグリッソン嚢の表面を前進して通過します(図3C)。
4. 用意した8-0を採用LLLの門脈の周りに結び、私の人生の枝を愛するシルク縫合糸。肝臓の中葉内に顕著な虚血性の境界を探しますが、左葉は門脈の枝の結紮時に蒼白になります。

5.門脈枝の尾状枝の解剖

1. 尾状葉を解剖し、綿棒を使用して、主門脈と尾状葉の間の潜在的なスペースを埋めます。
2. 尾状葉の腹膜をはがして、葉の門脈枝を視覚化します。
3. 尾状枝を結紮するのではなく、ステッチアップ縫合糸を使用して、針の経路が門脈の尾状枝を適切に包み込むようにします。
   注:門脈の尾状枝を結紮することの難しさは、尾状葉門脈が肝臓組織をカプセル化し、主要な門脈に近いためです。針の貫通深さは1mmが推奨されます。

6. 肝臓の切断と胆嚢摘出術

1. 中肝葉に明確な境界線を観察し、この線に沿って切断を実行します(図2B)。
2. 電気焼灼ペンを使用して、境界線に沿って0.5mmのプレカットラインを作成します。
3. マイクロ鉗子と電気焼灼ペンを使用して肝臓組織を切断し、綿棒を当てて出血を止めます。
   注:交差の難しさは、深さを習得することです。目標は、肝臓を大静脈にできるだけ近づけて分割することです。術中出血は避けるのが難しく、交差の深さを習得するには反復的な練習が必要です。熱い燃焼、綿棒、ゼラチンスポンジを使用して、止血を助けることができます。
4. 胆嚢を最後に取り外すと、手術全体で良好な引っ張りポイントが得られます。
5. 綿棒を使用して止血のために制御された圧力を適用し、出血が続くと、下大静脈が損傷し、縫合糸の修復効果が不十分になります。ためらうことなく動物を安楽死させます。

7. 手術の最終ステップ

1. 閉鎖する前に、小腸を腹腔内に細心の注意を払って配置してください。
2. 腹膜と腹壁は6-0吸収性縫合糸で、皮膚は4-0吸収性縫合糸でしっかりと閉じます。
3. 最適な清潔さを確保するために、皮膚表面を再度消毒します。
4. 切開部位に 1 mL の生理食塩水とフェンタニル 0.02 mg/kg とメロキシカム 4 mg/kg を皮下投与して、術後の痛みを軽減し、術中の補助的な体液損失に対処します。
5. 動物を温めた表面に置いて自然な目覚めを促進し、四肢への血液供給を監視します。その後、意識を取り戻すまで観察を続けるために、個別にケージに入れます。
6. 回復時に 4 mg/kg の用量でメデトミジンを皮下注射し、術後 24 時間継続します。

8. 肝臓の再生と肝機能の術中測定

1. マウスを安楽死させ、手術後1、2、3、および7日の間隔で肝臓と血液サンプルを採取します。
2. HE染色と肝機能検査を実施し、血清炎症マーカーを調べることで、モデル構築の影響をさらに検証できます。
3. 外科的処置後1週間にわたるマウスの体重とFLR/BW(体重)比の日々の変動を記録します。

結果

PVL(プロトコルステップ2、3、4、および5)とは対照的に、ALPPS(ステップ2、3、4、5、および6)の外科的介入を受けたマウスは、細胞増殖に対する高い傾向を示しました。図2は、門脈結紮後の中肝葉の虚血性境界と、ALPPSとPVLの重要な違いを表す肝切断中の視野を示しています。特に、肝組織内の炎症性メディエーター(TNF-α(TNF-α)、インターロイキン...

ディスカッション

この研究では、マウスのALPPS手術の初期段階のプロトコルを提示します。これには、門脈の部分的な結紮と正中肝葉の分割が含まれます。この方法は、ヒトのALPPS手順を密接に模倣しており、マウス肝臓のユニークな小葉構造と正中葉への二重門脈供給により、手術後の明確な血流が確保されます¹¹。ALPPSの手術は、2つの異なる手術段階で構成されて...

資料

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C57 BL/6	The Jackson Lab	22349-2023	Stability of strains
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meloxicam	Boehringer-Ingelheim	H20020217	Durable and efficient
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