Um modelo de camundongo da partição hepática associada e ligadura da veia porta para procedimento de hepatectomia encenada auxiliado por microscopia

Resumo

A associação da partição hepática e da ligadura da veia porta para hepatectomia estadiada (ALPPS) demonstrou resultar em regeneração hepática notável após várias semanas após a cirurgia de primeiro estágio. Modelos animais submetidos a ALPPS foram desenvolvidos para explorar a capacidade potencial de regeneração hepática e alcançar resultados clínicos favoráveis.

Resumo

A hepatectomia é amplamente considerada como o tratamento primário para neoplasias hepáticas; No entanto, a insuficiência hepática pós-operatória continua sendo uma das principais causas de mortalidade perioperatória, impactando gravemente os resultados dos pacientes. Em um ambiente hepático robusto, o futuro remanescente hepático (FLR) deve exceder 25% e, em casos de cirrose, essa necessidade aumenta para mais de 40%. A inadequação do FLR é atualmente um grande obstáculo na progressão da cirurgia hepática.

Os métodos tradicionais para aumentar a hipertrofia do FLR concentram-se principalmente na embolização da veia porta (PVE), mas sua eficácia é consideravelmente limitada. Nos últimos anos, houve inúmeros relatos sobre um novo método de hepatectomia bifásica envolvendo partição hepática e ligadura da veia porta, conhecido como associação de partição hepática e ligadura da veia porta para hepatectomia estagiada (ALPPS). O ALPPS supera o PVE na indução eficiente e considerável da hipertrofia do FLR. No entanto, os mecanismos detalhados que impulsionam a regeneração hepática facilitada por ALPPS não são totalmente compreendidos. Assim, replicar o ALPPS em modelos animais é crucial para investigar minuciosamente os mecanismos moleculares da regeneração hepática, oferecendo valiosos insights teóricos e práticos.

Introdução

O fígado abriga um potencial regenerativo formidável, proliferando e restaurando rapidamente as demandas metabólicas em apenas 3 meses após a ressecção de diversas doenças hepáticas¹. No entanto, o imperativo de verificar a integridade das margens do tumor exige a inevitabilidade da excisão hepática expansiva. Assim, a garantia de um amplo volume do meio hepático participativo, conhecido como futuro remanescente hepático (FLR), assume suma importância². A ALPPS tem sido uma técnica inovadora na cirurgia hepática nas últimas décadas, particularmente adaptada para pacientes com volume hepático residual inadequado após a ressecção do tumor, anunciada como um dos avanços mais auspiciosos no campo da cirurgia oncológica hepática³.

Um progresso notável foi feito no desenvolvimento de modelos animais ALPPS. Um modelo ideal normalmente requer entrada e saída de sangue independentes (veia porta e artéria hepática) no lobo hepático preservado e uma separação clara entre os lobos hepáticos preservados e os a serem ressecados para evitar a circulação colateral⁴. Embora a ALPPS estimule a rápida regeneração hepática no tecido hepático remanescente, os mecanismos específicos desse processo ainda não estão claros.

Atualmente, os modelos ALPPS são categorizados em três tipos: modelos animais de grande porte (por exemplo, suínos e ovinos), modelos de médio porte (por exemplo, coelhos e roedores) e modelos pequenos (por exemplo, camundongos)⁵. O uso de camundongos, com sua rápida reprodução e facilidade de modificação genética, é particularmente eficaz para estudos aprofundados dos mecanismos de regeneração hepática⁶. Além disso, a estrutura do fígado dos camundongos, especialmente sua veia hepática média, se assemelha muito à dos humanos, tornando-os altamente adequados para o desenvolvimento do modelo ALPPS.

É importante notar que a maioria dos pacientes com carcinoma hepatocelular na prática clínica tem condições hepáticas subjacentes, ao contrário dos modelos hepáticos saudáveis tipicamente usados em estudos⁷. Assim, o uso de camundongos pré-condicionados com fibrose hepática ou infecções virais pode simular com mais precisão as respostas cirúrgicas e a regeneração hepática pós-operatória observadas em pacientes com várias doenças hepáticas⁸. Essa abordagem pode revelar novos alvos terapêuticos de relevância clínica.

Até agora, alguns grupos de pesquisa renomados, como os da Universidade de Zurique e da Universidade de Tóquio, desenvolveram com sucesso modelos ALPPS murinos ^9,10. A criação de um modelo murino padronizado sob condições controladas pode avançar nossa compreensão da rápida regeneração hepática observada após os procedimentos de ALPPS.

Protocolo

Todos os experimentos deste protocolo foram aprovados pelas Autoridades Veterinárias do Hospital Popular da Província de Jiangxi (número 70/2022). Além disso, todas as etapas experimentais foram realizadas em estrita conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.

1. Início da cirurgia

NOTA: Camundongos C57BL / 6 machos pesando 20-22 g foram alojados em uma gaiola bem ventilada, mantida em um ambiente padrão livre de patógenos com um ciclo claro / escuro de 12 h / 12 h. Os animais receberam acesso ad libitum a comida e água a uma temperatura ambiente controlada de 22 ± 1 °C. A cirurgia foi realizada em uma sala microcirúrgica dedicada, utilizando-se microscópio cirúrgico (Figura 1). Os camundongos do grupo simulado foram operados apenas por laparotomia, mas nenhuma operação foi realizada no fígado. No grupo LPV, parte dos ramos da veia porta foi ligada, e no grupo ALPPS, o lobo médio do fígado foi seccionado com base na ligadura da veia porta (LPV).

1. Sujeite os camundongos a um período de jejum pré-operatório de 4-6 horas.
   NOTA: O jejum é necessário porque comer causa protuberância gástrica em camundongos, resulta em campo cirúrgico ruim e é propenso a danos acidentais à parede gástrica.
2. Providencie instrumentos cirúrgicos estéreis, incluindo micropinças, tesouras, afastadores abdominais e 8-0 pré-preparados pontos de ligadura da veia porta, em mesa lateral. Mergulhe os materiais intraoperatórios compostos por gaze estéril e bolas de algodão em solução salina a 37 °C.
3. Para indução, expor os animais ao isoflurano a 5% v/v por 30 s, seguido de anestesia de manutenção com isoflurano a 3% vol até atingir um estado anestésico profundo. Examine o reflexo de pinça do dedo do pé para determinar o nível de anestesia. Injete medetomidina por via subcutânea na dose de 5 mg/kg durante a fase de indução.
4. Aplique pomada nos olhos dos animais e injete 1 mL de solução de Ringer com lactato misturada com glicose a 5% por via subcutânea, dividindo a dose igualmente entre a parte inferior do abdômen de cada lado.
5. Depile meticulosamente a região abdominal usando aparadores de pêlos de pequenos animais, abrangendo uma área lateral de 2 cm do processo xifóide até a região genital.
6. Desinfete completamente o local da cirurgia 3 vezes com rodadas alternadas de iodopovidona e álcool.
7. Faça uma incisão na linha média de 2,5-3,0 cm de comprimento na pele usando um bisturi cirúrgico, posteriormente utilizando uma tesoura cirúrgica para abrir delicadamente a cavidade abdominal.
8. Empregue o afastador abdominal para expandir a incisão, facilitando a tração suave do duodeno e de um segmento do intestino delgado usando cotonetes estéreis e úmidos. Cubra essas estruturas com a gaze estéril pré-preparada, expondo simultaneamente o segmento hepático da veia porta.

2. Ligadura da veia porta (PVL)

NOTA: Certifique-se de que todas as ações sejam suaves durante todo o procedimento. Use bolas de algodão umedecidas ao manipular o tecido hepático.

1. Retire o peritônio e o trato intestinal e certifique-se de que a veia porta esteja totalmente exposta.
2. No decorrer da exposição da veia porta principal, prossiga circundando seus ramos usando movimentos lentos e deliberados de empurrar para frente e espalhar.
3. Identifique sequencialmente os vários ramos da veia porta na seguinte ordem: (1) o ramo posterior direito, (2) os ramos laterais esquerdos e medianos esquerdos combinados e (3) o ramo caudado (Figura 2A).

3. Dissecção do ramo posterior direito dos ramos da veia porta

1. Ao atravessar o hilo hepático através da veia porta principal, observe um ramo conspícuo do lobo posterior direito que se tornou visível.
2. Use bolas de algodão umedecidas como agente de enchimento e separe o lobo médio do fígado e o lobo posterior direito para evitar possíveis lesões.
3. Certifique-se de dissecar ao longo da cápsula de Glisson (o peritônio que se estende sobre a superfície do fígado) e puxe uma seda de 1,5 cm para amarrar em torno dos ramos da veia porta.
4. Ligue o ramo posterior direito da veia porta com 8-0 sutura de seda. Um indicador confiável de ligadura bem-sucedida da veia porta é a palidez visível do fígado.

4. Dissecção dos ramos lateral esquerdo e medial esquerdo da veia porta

1. Os ramos do lobo lateral esquerdo (LLL) e do lobo medial esquerdo (LML) compartilham uma veia porta principal comum. Certifique-se de dissecar qualquer interstício potencial entre o LLL e o lobo caudado.
   NOTA: A ligadura dos ramos LLL e LML da veia porta é a mais difícil neste modelo cirúrgico porque as micropinças devem atravessar o espaço ao redor da veia porta e evitar lesões hepáticas.
2. Introduza as micropinças pela entrada na etapa 4.1 e mova a mão lentamente, pois mesmo a menor resistência sugere a proximidade potencial do fígado ou dos vasos sanguíneos.
3. Quando sentir resistência, ajuste ligeiramente as micropinças para avançar e atravessar a superfície da cápsula de Glisson do lobo medial direito (RML) (Figura 3C).
4. Empregue o 8-0 preparado sutura de seda para amarrar ao redor da veia porta dos ramos LLL e LML. Procure uma demarcação isquêmica marcante dentro do lobo médio do fígado, enquanto o lobo esquerdo assume palidez, após a ligadura dos ramos da veia porta.

5. Dissecção do ramo caudado dos ramos da veia porta

1. Disseque o lobo caudado e use um cotonete para preencher o espaço potencial entre a veia porta principal e o lobo caudado.
2. Retire o peritônio dos lobos caudados para visualizar os ramos da veia porta do lobo.
3. Use sutura de costura em vez de amarrar para ligar o ramo caudado, garantindo que o caminho da agulha envolva adequadamente o ramo caudado da veia porta.
   NOTA: A dificuldade de ligar o ramo caudado da veia porta é porque a veia porta do lobo caudado encapsula o tecido hepático e está próxima à veia porta principal. Recomenda-se uma profundidade de penetração da agulha de 1 mm.

6. Transsecção hepática e colecistectomia

1. Observe uma linha de demarcação distinta no lobo médio do fígado e faça a transecção ao longo dessa linha (Figura 2B).
2. Use uma caneta de eletrocautério para criar uma linha pré-cortada de 0,5 mm ao longo da linha de demarcação.
3. Use microfórceps e uma caneta de eletrocautério para cortar o tecido hepático, aplicando cotonetes para parar o sangramento.
   NOTA: A dificuldade na transecção é dominar a profundidade. O objetivo é dividir o fígado o mais próximo possível da veia cava. O sangramento intraoperatório é difícil de evitar e requer prática repetitiva para dominar a profundidade da transecção. Queima quente, cotonetes e esponjas de gelatina podem ser usados para auxiliar na hemostasia.
4. Remova a vesícula biliar por último, pois isso fornecerá um bom ponto de tração durante toda a operação.
5. Empregue um cotonete para aplicar pressão controlada para hemostasia e, se a hemorragia persistir, a veia cava inferior é lesada e o efeito do reparo da sutura será ruim; sacrificar o animal sem hesitação.

7. Etapas finais da cirurgia

1. Garanta a colocação meticulosa do intestino delgado dentro da cavidade abdominal antes do fechamento.
2. Feche com segurança o peritônio e a parede abdominal usando suturas absorvíveis 6-0 e a pele com suturas absorvíveis 4-0.
3. Desinfete a superfície da pele novamente para garantir a limpeza ideal.
4. Administrar subcutaneamente 1 mL de solução salina e fentanil 0,02 mg/kg mais meloxicam 4 mg/kg no local da incisão para aliviar a dor pós-operatória e tratar qualquer perda de fluidos intraoperatórios suplementares.
5. Coloque o animal em uma superfície aquecida para facilitar o despertar natural e monitore o suprimento de sangue para suas extremidades. Posteriormente, abrigue-os individualmente em gaiolas para observação contínua enquanto recuperam a consciência.
6. Injetar medetomidina por via subcutânea na dose de 4 mg/kg após a recuperação, continuando por 24 h no pós-operatório.

8. Medição intraoperatória da regeneração hepática e da função hepática

1. Eutanásia dos camundongos e coleta amostras de fígado e sangue em intervalos de 1, 2, 3 e 7 dias após a cirurgia.
2. Realize a coloração HE e o teste de função hepática e examine os marcadores inflamatórios séricos, fornecendo validação adicional para o impacto da construção do modelo.
3. Documente as variações diárias no peso corporal e na relação FLR / BW (peso corporal) dos camundongos durante um período de 1 semana após o procedimento cirúrgico.

Resultados

Em contraste com o PVL (etapas 2,3,4 e 5 do protocolo), os camundongos que foram submetidos à intervenção cirúrgica ALPPS (etapas 2,3,4,5 e 6) demonstraram uma maior propensão à proliferação celular. A Figura 2 delineia a demarcação isquêmica do lobo médio do fígado após a ligadura da veia porta, juntamente com o campo visual durante a transecção hepática, o que representa uma distinção fundamental entre ALPPS e PVL. Notavelmente, os níve...

Discussão

Este estudo apresenta um protocolo para a fase inicial da cirurgia de ALPPS em camundongos, envolvendo ligadura parcial da veia porta e divisão do lobo mediano do fígado. Este método imita de perto o procedimento ALPPS humano, com a estrutura lobular única do fígado do camundongo e o suprimento venoso portal duplo para o lobo mediano, garantindo um fluxo sanguíneo distinto após a cirurgia¹¹. Vale ressaltar que o procedimento ALPPS compreende duas etapas cir...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% glucose injection (500 mL)	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20003666	Efficient, cheap,Easy to access
anaesthesia machine	RWD (www.rwdls.com)	R500	low price and valuable quality. It is suitable for operations with beginners
C57 BL/6	The Jackson Lab	22349-2023	Stability of strains
isoflurane	KCSW (kcsw.szqisoubao.com)	H19980141	durable, cost-effective
meloxicam	Boehringer-Ingelheim	H20020217	Durable and efficient
microforceps	maydeal	60018920	Durable and efficient
microinstrument	CH microsurgical instrument factory	HC-A804-1	durable, cost-effective
sodium lactate ringer	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20193277	Efficient, cheap, easy to access
suture line	CH microsurgical instrument factory	6-0/8-0	high performance-price ratio
topical antibodies	chenxin pharmacology (www.cisen-pharma.com)	H20020217	Effectively avoid incision infection