Ein Mausmodell der zugehörigen Leberpartition und der Pfortaderligatur für ein gestuftes Hepatektomieverfahren mit Hilfe der Mikroskopie

Zusammenfassung

Es hat sich gezeigt, dass die Assoziierung der Leberpartition und der Pfortaderligatur bei der gestiebenen Hepatektomie (ALPPS) mehrere Wochen nach der Operation im ersten Stadium zu einer bemerkenswerten Leberregeneration führt. Tiermodelle, die einer ALPPS unterzogen wurden, wurden entwickelt, um die potenzielle Regenerationsfähigkeit der Leber zu untersuchen und günstige klinische Ergebnisse zu erzielen.

Zusammenfassung

Die Hepatektomie wird weithin als die primäre Behandlung von Lebermalignomen angesehen. Dennoch ist postoperatives Leberversagen nach wie vor eine der Hauptursachen für perioperative Mortalität, was sich stark auf die Ergebnisse der Patienten auswirkt. In einer robusten Leberumgebung muss der zukünftige Leberrest (FLR) 25 % überschreiten, bei Leberzirrhose steigt dieser Bedarf auf über 40 %. Die Unzulänglichkeit der FLR ist derzeit ein großes Hindernis im Verlauf der Leberchirurgie.

Traditionelle Methoden zur Verbesserung der FLR-Hypertrophie konzentrieren sich hauptsächlich auf die Pfortaderembolisation (PVE), deren Wirksamkeit jedoch erheblich eingeschränkt ist. In den letzten Jahren gab es zahlreiche Berichte über eine neuartige biphasische Hepatektomiemethode, die eine hepatische Partitionierung und eine Pfortaderligatur beinhaltet, die als assoziierende Leberpartition und Pfortaderligation für die stufenweise Hepatektomie (ALPPS) bekannt ist. ALPPS übertrifft PVE bei der effizienten und erheblichen Induktion der FLR-Hypertrophie. Die detaillierten Mechanismen, die die ALPPS-gestützte Leberregeneration antreiben, sind jedoch nicht vollständig verstanden. Daher ist die Replikation von ALPPS in Tiermodellen von entscheidender Bedeutung, um die molekularen Mechanismen der Leberregeneration gründlich zu untersuchen und wertvolle theoretische und praktische Erkenntnisse zu gewinnen.

Einleitung

Die Leber verfügt über ein beachtliches regeneratives Potenzial, das sich schnell vermehrt und innerhalb von nur 3 Monaten nach der Resektion bei verschiedenen Leberbeschwerden den Stoffwechselbedarf wiederherstellt¹. Die Notwendigkeit, die Vollständigkeit der Tumorränder zu bestimmen, erfordert jedoch die Unvermeidlichkeit einer expansiven Leberexzision. Daher ist die Sicherstellung eines ausreichenden Volumens des partizipatorischen Lebermilieus, das als Future Liver Remnant (FLR) bekannt ist, von größter Bedeutung². ALPPS war in den letzten Jahrzehnten eine bahnbrechende Technik in der Leberchirurgie, die speziell auf Patienten mit unzureichendem Leberrestvolumen nach einer Tumorresektion zugeschnitten war und als einer der vielversprechendsten Durchbrüche im Bereich der hepatischen onkologischen Chirurgie angekündigt wurde³.

Bei der Entwicklung von ALPPS-Tiermodellen wurden bemerkenswerte Fortschritte erzielt. Ein ideales Modell erfordert typischerweise einen unabhängigen Blutzufluss (Pfortader und Leberarterie) und -abfluss (Lebervene) im erhaltenen Leberlappen und eine klare Trennung zwischen dem erhaltenen und dem zu resezierenden Leberlappen, um eine Kollateralzirkulation zu verhindern⁴. Obwohl ALPPS die schnelle Leberregeneration im verbleibenden Lebergewebe stimuliert, sind die spezifischen Mechanismen dieses Prozesses noch unklar.

Derzeit werden ALPPS-Modelle in drei Typen eingeteilt: große Tiermodelle (z. B. Schweine und Schafe), mittelgroße Modelle (z. B. Kaninchen und Nagetiere) und kleine Modelle (z. B. Mäuse)⁵. Die Verwendung von Mäusen mit ihrer schnellen Züchtung und der einfachen genetischen Veränderung ist besonders effektiv für eingehende Untersuchungen der Regenerationsmechanismen der Leber⁶. Darüber hinaus ähnelt die Leberstruktur von Mäusen, insbesondere ihre mittlere Lebervene, stark der des Menschen, was sie sehr gut für die Entwicklung von ALPPS-Modellen geeignet macht.

Es ist wichtig zu beachten, dass die meisten Patienten mit hepatozellulärem Karzinom in der klinischen Praxis eine zugrunde liegende Lebererkrankung haben, im Gegensatz zu den gesunden Lebermodellen, die typischerweise in Studien verwendet werden⁷. Daher kann die Verwendung von Mäusen, die mit Leberfibrose oder Virusinfektionen präkonditioniert sind, die chirurgischen Reaktionen und die postoperative Leberregeneration, die bei Patienten mit verschiedenen Lebererkrankungen beobachtet werden, genauer simulieren⁸. Dieser Ansatz könnte neue therapeutische Ziele von klinischer Relevanz aufzeigen.

Bisher ist es einigen renommierten Forschungsgruppen, wie jenen der Universität Zürich und der Universität Tokio, gelungen, murine ALPPS-Modelle^{zu entwickeln 9,10}. Die Erstellung eines standardisierten Mausmodells unter kontrollierten Bedingungen könnte unser Verständnis der nach ALPPS-Verfahren beobachteten schnellen Leberregeneration verbessern.

Protokoll

Alle Experimente in diesem Protokoll wurden von den Veterinärbehörden des Volkskrankenhauses der Provinz Jiangxi genehmigt (Nummer 70/2022). Darüber hinaus wurden alle Versuchsschritte unter strikter Einhaltung des Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt.

1. Beginn der Operation

HINWEIS: Männliche C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 20-22 g wurden in einem gut belüfteten Käfig untergebracht, der in einer erregerfreien Standardumgebung mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h/12 h gehalten wurde. Die Tiere erhielten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser bei einer kontrollierten Umgebungstemperatur von 22 ± 1 °C. Die Operation wurde in einem speziellen mikrochirurgischen Raum mit einem Operationsmikroskop durchgeführt (Abbildung 1). Die Mäuse in der Scheingruppe wurden nur per Laparotomie operiert, es wurde jedoch keine Operation an der Leber durchgeführt. In der PVL-Gruppe wurde ein Teil der Pfortaderäste ligiert, in der ALPPS-Gruppe wurde der mittlere Leberlappen auf Basis der Pfortaderligatur (PVL) durchtrennt.

1. Setzen Sie die Mäuse einer präoperativen Fastenphase von 4-6 Stunden aus.
   HINWEIS: Fasten ist erforderlich, da Essen bei Mäusen eine Magenvorwölbung verursacht, zu einem schlechten Operationsfeld führt und anfällig für versehentliche Schäden an der Magenwand ist.
2. Ordnen Sie sterile chirurgische Instrumente an, einschließlich Mikrozangen, Scheren, Bauchretraktoren und vorbereitete 8-0 Portalvenenligaturnähte, auf einem Beistelltisch. Intraoperative Materialien, bestehend aus steriler Gaze und Wattebällchen, in 37 °C Kochsalzlösung einweichen.
3. Zur Induktion werden die Tiere 30 s lang 5 % v/v Isofluran ausgesetzt, gefolgt von einer Erhaltungsanästhesie mit 3 Vol.-% Isofluran, bis ein tiefer Anästhesiezustand erreicht ist. Untersuchen Sie den Zehenkneifreflex, um den Grad der Anästhesie zu bestimmen. Injizieren Sie Medetomidin in einer Dosis von 5 mg/kg während der Induktionsphase subkutan.
4. Tragen Sie eine Salbe auf die Augen der Tiere auf und injizieren Sie 1 ml Ringer-Laktatlösung, gemischt mit 5% iger Glukose, subkutan, wobei die Dosis gleichmäßig auf den Unterbauch auf jeder Seite aufgeteilt wird.
5. Rasieren Sie die Bauchregion sorgfältig mit einer kleinen Tierhaarschere, die einen 2 cm breiten lateralen Bereich vom Processus xiphoideus bis zur Genitalregion umfasst.
6. Desinfizieren Sie die Operationsstelle 3 Mal gründlich mit abwechselnden Runden Povidon-Jod und Alkohol.
7. Machen Sie mit einem chirurgischen Skalpell einen Schnitt von 2,5 bis 3,0 cm in der Mittellinie auf der Haut und öffnen Sie anschließend mit einer chirurgischen Schere die Bauchhöhle vorsichtig.
8. Verwenden Sie den Bauchretraktor, um den Schnitt zu erweitern, und erleichtern Sie so die sanfte Traktion des Zwölffingerdarms und eines Dünndarmsegments mit sterilen, feuchten Wattestäbchen. Decken Sie diese Strukturen mit der vorbereiteten sterilen Gaze ab und legen Sie gleichzeitig das hepatische Segment der Pfortader frei.

2. Pfortaderligatur (PVL)

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Aktionen während des gesamten Vorgangs sanft sind. Verwende angefeuchtete Wattebällchen, wenn du Lebergewebe manipulierst.

1. Ziehen Sie das Bauchfell und den Darmtrakt ab und stellen Sie sicher, dass die Pfortader vollständig freigelegt ist.
2. Während Sie die Hauptpfortader freilegen, fahren Sie fort, indem Sie ihre Äste mit langsamen, absichtlichen Vorwärts- und Spreizbewegungen umkreisen.
3. Identifizieren Sie nacheinander die verschiedenen Äste der Pfortader in der folgenden Reihenfolge: (1) den rechten hinteren Ast, (2) den kombinierten linken lateralen und linken Medianast und (3) den Schwanzast (Abbildung 2A).

3. Dissektion des rechten hinteren Astes der Pfortaderäste

1. Bei der Durchquerung des hepatischen Hilums über die Hauptpfortader ist ein auffälliger Ast des rechten Hinterlappens zu beobachten, der sichtbar geworden ist.
2. Verwenden Sie angefeuchtete Wattebällchen als Walkmittel und trennen Sie den Mittellappen der Leber und den rechten Hinterlappen, um mögliche Verletzungen zu vermeiden.
3. Achten Sie darauf, entlang der Glisson-Kapsel (dem Bauchfell, das sich über die Oberfläche der Leber erstreckt) zu präparieren und ziehen Sie eine 1,5 cm lange Seide um die Pfortaderäste.
4. Ligattieren Sie den rechten hinteren Ast der Pfortader mit 8-0 Seidennaht. Ein zuverlässiger Indikator für eine erfolgreiche Pfortaderligatur ist die sichtbare Blässe der Leber.

4. Dissektion des linken lateralen und linken medialen Astes der Pfortader

1. Der linke laterale Lappen (LLL) und der linke Mediallappen (LML) teilen sich eine gemeinsame Hauptpfortader. Achten Sie darauf, jeden möglichen Zwischenraum zwischen der LLL und dem Schwanzlappen zu präparieren.
   HINWEIS: Die Ligatur der LLL- und LML-Äste der Pfortader ist bei diesem chirurgischen Modell am schwierigsten, da die Mikrozange den Raum um die Pfortader durchqueren muss und eine Leberschädigung vermieden wird.
2. Führen Sie die Mikrozange durch den Eingang in Schritt 4.1 ein und bewegen Sie die Hand langsam, da bereits der geringste Widerstand die mögliche Nähe zur Leber oder zu den Blutgefäßen erahnen lässt.
3. Wenn ein Widerstand zu spüren ist, stellen Sie die Mikrozange leicht ein, um sich nach vorne und durch die Oberfläche der Glisson-Kapsel des rechten medialen Lappens (RML) zu bewegen (Abbildung 3C).
4. Setzen Sie das vorbereitete 8-0 ein Seidennaht zum Binden um die Pfortader der LLL und LML-Äste. Achten Sie auf eine auffällige ischämische Abgrenzung innerhalb des Lebermittellappens, während der linke Lappen bei der Ligatur der Pfortaderäste eine Blässe annimmt.

5. Dissektion des Schwanzastes der Pfortaderäste

1. Präpariere den Schwanzlappen und fülle mit einem Wattestäbchen den möglichen Raum zwischen der Hauptpfortader und dem Schwanzlappen.
2. Schälen Sie das Peritoneum der Schwanzlappen ab, um die Pfortaderäste des Lappens sichtbar zu machen.
3. Verwenden Sie eine Naht anstelle einer Bindenaht, um den Schwanzast zu ligieren, und stellen Sie sicher, dass der Nadelweg den Schwanzast der Pfortader angemessen umschließt.
   HINWEIS: Die Schwierigkeit bei der Ligatur des Schwanzastes der Pfortader besteht darin, dass die Pfortader des Schwanzlappens das Lebergewebe einkapselt und sich in der Nähe der Hauptpfortader befindet. Empfohlen wird eine Einstichtiefe der Nadel von 1 mm.

6. Lebertransektion und Cholezystektomie

1. Beobachten Sie eine deutliche Demarkationslinie im mittleren Leberlappen und führen Sie die Durchtrennung entlang dieser Linie durch (Abbildung 2B).
2. Verwende einen Elektrokauterstift, um eine 0,5 mm lange vorgeschnittene Linie entlang der Demarkationslinie zu erstellen.
3. Verwenden Sie eine Mikrozange und einen Elektrokauterstift, um das Lebergewebe zu schneiden, und tragen Sie Wattestäbchen auf, um die Blutung zu stoppen.
   HINWEIS: Die Schwierigkeit bei der Durchtrennung besteht darin, die Tiefe zu beherrschen. Ziel ist es, die Leber so nah wie möglich an der Hohlvene zu spalten. Intraoperative Blutungen sind schwer zu vermeiden und erfordern wiederholtes Üben, um die Tiefe der Durchtrennung zu beherrschen. Heißbrennen, Wattestäbchen und Gelatineschwämme können verwendet werden, um die Blutstillung zu unterstützen.
4. Entfernen Sie zuletzt die Gallenblase, da dies während der gesamten Operation einen guten Zugpunkt bietet.
5. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um kontrollierten Druck auf die Blutstillung auszuüben, und wenn die Blutung anhält, wird die untere Hohlvene verletzt und die Wirkung der Nahtreparatur ist schlecht. das Tier ohne zu zögern einzuschläfern.

7. Letzte Schritte der Operation

1. Stellen Sie sicher, dass der Dünndarm vor dem Verschluss sorgfältig in der Bauchhöhle platziert wird.
2. Verschließen Sie das Peritoneum und die Bauchdecke sicher mit 6-0 resorbierbaren Nähten und die Haut mit 4-0 resorbierbaren Nähten.
3. Desinfizieren Sie die Hautoberfläche erneut, um eine optimale Sauberkeit zu gewährleisten.
4. Verabreichen Sie subkutan 1 ml Kochsalzlösung und Fentanyl 0,02 mg/kg plus Meloxicam 4 mg/kg an der Inzisionsstelle, um postoperative Schmerzen zu lindern und zusätzlichen intraoperativen Flüssigkeitsverlust zu beheben.
5. Legen Sie das Tier auf eine erwärmte Oberfläche, um das natürliche Erwachen zu erleichtern, und überwachen Sie die Blutversorgung der Extremitäten. Bringen Sie sie anschließend einzeln in Käfigen unter, damit sie weiterhin beobachtet werden können, während sie wieder zu Bewusstsein kommen.
6. Injizieren Sie Medetomidin nach der Genesung subkutan in einer Dosis von 4 mg/kg und setzen Sie die Behandlung 24 Stunden postoperativ fort.

8. Intraoperative Messung der Leberregeneration und der Leberfunktion

1. Euthanasieren Sie die Mäuse und entnehmen Sie Leber- und Blutproben im Abstand von 1, 2, 3 und 7 Tagen nach der Operation.
2. Durchführung von HE-Färbung und Leberfunktionstest und Untersuchung von Entzündungsmarkern im Serum, wodurch die Auswirkungen der Modellkonstruktion zusätzlich validiert werden können.
3. Dokumentieren Sie die täglichen Schwankungen des Körpergewichts und des FLR/BW-Verhältnisses (Körpergewicht) der Mäuse über einen Zeitraum von 1 Woche nach dem chirurgischen Eingriff.

Ergebnisse

Im Gegensatz zur PVL (Protokollschritte 2, 3, 4 und 5) zeigten die Mäuse, die dem chirurgischen Eingriff des ALPPS (Schritte 2, 3, 4, 5 und 6) unterzogen wurden, eine erhöhte Neigung zur zellulären Proliferation. Abbildung 2 zeigt die ischämische Abgrenzung des mittleren Leberlappens nach der Pfortaderligatur sowie das Gesichtsfeld während der Leberdurchtrennung, was eine wichtige Unterscheidung zwischen ALPPS und PVL darstellt. Bemerkenswert ist, dass ...

Diskussion

Diese Studie stellt ein Protokoll für die Anfangsphase der ALPPS-Operation bei Mäusen vor, das eine partielle Ligatur der Pfortader und eine Teilung des Leberlappens medianus umfasst. Diese Methode ahmt das humane ALPPS-Verfahren sehr nach, wobei die einzigartige lobuläre Struktur der Mausleber und die duale portalvenöse Versorgung des Medianlappens einen deutlichen Blutfluss nach der Operation gewährleisten¹¹. Bemerkenswert ist, dass das ALPPS-Verfahren aus ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% glucose injection (500 mL)	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20003666	Efficient, cheap,Easy to access
anaesthesia machine	RWD (www.rwdls.com)	R500	low price and valuable quality. It is suitable for operations with beginners
C57 BL/6	The Jackson Lab	22349-2023	Stability of strains
isoflurane	KCSW (kcsw.szqisoubao.com)	H19980141	durable, cost-effective
meloxicam	Boehringer-Ingelheim	H20020217	Durable and efficient
microforceps	maydeal	60018920	Durable and efficient
microinstrument	CH microsurgical instrument factory	HC-A804-1	durable, cost-effective
sodium lactate ringer	Shapuaisi pharma (http://www.zjspas.com/)	H20193277	Efficient, cheap, easy to access
suture line	CH microsurgical instrument factory	6-0/8-0	high performance-price ratio
topical antibodies	chenxin pharmacology (www.cisen-pharma.com)	H20020217	Effectively avoid incision infection