Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا طريقة بسيطة للمراقبة المباشرة والقياس الآلي لاستجابات الثغور للغزو البكتيري في Arabidopsis thaliana. تستفيد هذه الطريقة من جهاز تصوير الفم المحمول ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور المصمم لصور الأوراق التي يلتقطها الجهاز.

Abstract

الثغور هي مسام مجهرية توجد في بشرة أوراق النبات. يعد تنظيم فتحة الثغور أمرا محوريا ليس فقط لموازنة امتصاص ثاني أكسيد الكربون لعملية التمثيل الضوئي وفقدان الماء الناتج عن النتح ولكن أيضا للحد من الغزو البكتيري. بينما تغلق النباتات الثغور عند التعرف على الميكروبات ، فإن البكتيريا المسببة للأمراض ، مثل Pseudomonas syringae pv. طماطم DC3000 (Pto) ، أعد فتح الثغور المغلقة للوصول إلى داخل الورقة. في المقايسات التقليدية لتقييم استجابات الثغور للغزو البكتيري ، يتم تعويم قشور البشرة الورقية أو أقراص الأوراق أو الأوراق المنفصلة على تعليق بكتيري ، ثم يتم ملاحظة الثغور تحت المجهر متبوعا بالقياس اليدوي لفتحة الثغور. ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات مرهقة وقد لا تعكس استجابات الثغور للغزو البكتيري الطبيعي في ورقة متصلة بالنبات. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير جهاز تصوير محمول يمكنه مراقبة الثغور عن طريق قرص ورقة دون فصلها عن النبات ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور القائم على التعلم العميق المصمم لقياس فتحة الثغور تلقائيا من صور الأوراق التي يلتقطها الجهاز. هنا ، بناء على هذه التطورات التقنية ، يتم تقديم طريقة جديدة لتقييم استجابات الثغور للغزو البكتيري في Arabidopsis thaliana . تتكون هذه الطريقة من ثلاث خطوات بسيطة: التلقيح بالرش ل Pto الذي يحاكي عمليات العدوى الطبيعية ، والمراقبة المباشرة للثغور على ورقة النبات الملقح ب Pto باستخدام جهاز التصوير المحمول ، والقياس الآلي لفتحة الثغور بواسطة خط أنابيب تحليل الصور. تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لإثبات إغلاق الثغور وإعادة فتحها أثناء غزو Pto في ظل ظروف تحاكي عن كثب التفاعل الطبيعي بين النبات والبكتيريا.

Introduction

الثغور مسام مجهرية محاطة بزوج من الخلايا الحارسة على سطح الأوراق والأجزاء الهوائية الأخرى من النباتات. في ظل البيئات المتغيرة باستمرار ، يعد تنظيم فتحة الثغور أمرا أساسيا للنباتات للتحكم في امتصاص ثاني أكسيد الكربون المطلوب لعملية التمثيل الضوئي على حساب فقدان الماء عن طريق النتح. وبالتالي ، كان القياس الكمي لفتحة الثغور مفيدا لفهم التكيف البيئي للنبات. ومع ذلك ، فإن تحديد فتحة الثغور بطبيعته يستغرق وقتا طويلا ومرهقا لأنه يتطلب عملا بشريا لتحديد وقياس مسام الثغور في صورة ورقة تم التقاطها بواسطة المجهر. للتحايل على هذه القيود ، تم تطوير طرق مختلفة لتسهيل القياس الكمي لفتحة الثغور في Arabidopsis thaliana ، وهو نبات نموذجي يستخدم على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الثغور1،2،3،4،5،6. على سبيل المثال، يمكن استخدام البورومتر لقياس معدل النتح باعتباره مقياسا للتوصيل الثغري. ومع ذلك ، لا توفر هذه الطريقة معلومات مباشرة عن عدد الثغور والفتحة التي تحدد التوصيل الثغري. استخدمت بعض الدراسات تقنيات الفحص المجهري متحد البؤر التي تسلط الضوء على مسام الثغور باستخدام علامة الأكتين الفلورية أو صبغة الفلورسنت أو التألق الذاتيلجدار الخلية 1،2،3،4،5. في حين أن هذه الأساليب تسهل الكشف عن الثغور ، فإن تكلفة كل من تشغيل مرفق الفحص المجهري متحد البؤر وإعداد عينات الفحص المجهري يمكن أن تكون عقبة أمام التطبيق الروتيني. في عمل رائد قام به Sai et al. ، تم تطوير نموذج شبكة عصبية عميقة لقياس فتحة الثغور تلقائيا من الصور المجهرية ذات المجال الساطع لتقشير البشرة A. thaliana 6. ومع ذلك ، فإن هذا الابتكار لا يعفي الباحثين من مهمة إعداد قشر البشرة للمراقبة المجهرية. في الآونة الأخيرة ، تم التغلب على هذه العقبة من خلال تطوير جهاز تصوير محمول يمكنه مراقبة الثغور عن طريق قرص ورقة من A. thaliana ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور القائم على التعلم العميق الذي يقيس تلقائيا فتحة الثغور من صور الأوراق التي تم التقاطها بواسطة الجهاز7.

تساهم الثغور في المناعة الفطرية للنبات ضد مسببات الأمراض البكتيرية. مفتاح هذه الاستجابة المناعية هو إغلاق الثغور الذي يقيد دخول البكتيريا من خلال المسام المجهرية إلى داخل الورقة ، حيث تتكاثر مسببات الأمراض البكتيرية وتسبب الأمراض8. يحدث إغلاق الثغور عند التعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات (MAMPs) ، وهي جزيئات مناعية غالبا ما تكون شائعة في فئة من الميكروبات ، بواسطة مستقبلات التعرف على الأنماط الموضعية بغشاء البلازما (PRRs) 9. حاتمة 22 من الأحماض الأمينية من السوط البكتيري المعروف باسم flg22 هو MAMP نموذجي يحفز إغلاق الثغور من خلال التعرف عليه من قبل PRR FLS210. كإجراء مضاد ، مسببات الأمراض البكتيرية مثل Pseudomonas syringae pv. طماطم DC3000 (Pto) و Xanthomonas campestris الكهروضوئية. طورت الحويصلة آليات الفوعة لإعادة فتح الثغور9،11،12. تم تحليل استجابات الثغور هذه لمسببات الأمراض البكتيرية بشكل تقليدي في المقايسات التي يتم فيها تعويم قشور البشرة أو أقراص الأوراق أو الأوراق المنفصلة على معلق بكتيري ، ثم يتم ملاحظة الثغور تحت المجهر متبوعا بالقياس اليدوي لفتحة الثغور. ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات مرهقة وقد لا تعكس استجابات الثغور للغزو البكتيري الطبيعي الذي يحدث في ورقة متصلة بالنبات.

هنا ، يتم تقديم طريقة بسيطة للتحقيق في إغلاق الثغور وإعادة فتحها أثناء غزو Pto في ظل حالة تحاكي عن كثب التفاعل الطبيعي بين النباتات والبكتيريا. تستفيد هذه الطريقة من جهاز التصوير المحمول للمراقبة المباشرة لثغور A. thaliana على ورقة متصلة بالنبات الملقح ب Pto ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور للقياس الآلي لفتحة الثغور.

Protocol

1. زراعة النباتات

  1. لكسر السكون ، أعد تعليق بذور A. thaliana (Col-0) في ماء منزوع الأيونات واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 4 أيام في الظلام.
  2. زرع البذور على التربة وتنمو في غرفة مجهزة بضوء الفلورسنت الأبيض. حافظ على ظروف النمو التالية: درجة حرارة 22 درجة مئوية ، وشدة ضوء 6000 لوكس (حوالي 100 ميكرومول / م2 / ثانية) لمدة 10 ساعات ، ورطوبة نسبية 60٪.
  3. عند الحاجة ، سقي النباتات بأسمدة سائلة. الامتناع عن الري من 1 أسبوع إلى 2 أيام قبل التلقيح وبئر الماء 1 يوم قبل التلقيح.

2. تحضير اللقاح البكتيري

  1. قم بخط Pto من مخزون الجلسرين على وسط King's B (KB) الصلب (20 جم من التربتون ، 1.5 جم من K2HPO4 ، و 15 جم من الجلسرين ل 1 لتر ، 1.5٪ أجار) مع 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة يومين.
  2. تلقيح مستعمرة واحدة إلى 5 مل من الوسط السائل KB مع 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين واحتضانها عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة حتى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتأخر.
  3. أجهزة الطرد المركزي الثقافة في 6000 × غرام لمدة 2 دقيقة ، وتجاهل المادة الطافية ، وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من الماء المعقم. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  4. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المخزن المؤقت لفتح الثغور (25 mM MES-KOH pH 6.15 ، 10 mM KCl) ، وقم بقياس OD600.
  5. تمييع التعليق إلى OD600 0.2 مع العازلة لفتح الثغور التي تحتوي على 0.04٪ سيليكون الفاعل بالسطح.

3. رذاذ التلقيح من البكتيريا

  1. من يوم واحد قبل التلقيح حتى نهاية التجربة ، قم بتعريض النباتات لشدة ضوء تبلغ حوالي 10000 لوكس (حوالي 170 ميكرومول / م2 / ثانية).
  2. للتأكد من أن معظم الثغور مفتوحة ، احتفظ بالنباتات على صينية مغطاة بغطاء شفاف تحت الضوء لمدة 3 ساعات على الأقل قبل التلقيح بالرش.
  3. قم بإزالة الغطاء واستخدم البخاخة لرش الجانب المحوري من الأوراق ب 2.5 مل من المعلق البكتيري لكل ثلاثة نباتات في وعاء واحد.
  4. احتضان النباتات الملقحة على صينية مغطاة بغطاء شفاف للحفاظ على رطوبة نسبية تبلغ حوالي 85٪.
  5. الحصول على صور للثغور عند 1 ساعة و 3 ساعات بعد التلقيح بالرش باستخدام الطريقة الموضحة في القسم 4.

4. المراقبة المباشرة للثغور باستخدام جهاز التصوير المحمول

ملاحظة: تم تجهيز جهاز تصوير الثغور المحمول بضوء LED ووحدة كاميرا ويمكنه الحصول على 2,592 × 1,944 صورة (ارتفاع × عرض ؛ بكسل) بدقة حوالي 0.5 ميكرومتر / بكسل.

  1. قم بتوصيل جهاز تصوير الثغور المحمول بجهاز كمبيوتر شخصي (PC) مزود ببرنامج الحصول على الصور.
  2. قم بإزالة قطرات الماء برفق ولكن بالكامل من الأوراق الملقحة بقطعة من الورق.
  3. افتح الغطاء العلوي للجهاز ، ضع الورقة على المسرح ، وأغلق الغطاء العلوي (الشكل 1).
  4. اضبط تركيز الصورة عن طريق معالجة برغي الضبط ، ثم انقر فوق الزر حفظ الصورة على شاشة الكمبيوتر. سيتم الحصول على الصورة على الفور. عادة ما تحتوي الصورة المركزة على 10 ثغور قابلة للتحليل تقريبا. للحصول على نتائج قوية ، احصل على صور ثغور من ست أوراق من ثلاثة نباتات مختلفة (ورقتان لكل نبات).

5. القياس اليدوي لفتحة الثغور

ملاحظة: يمكن تنزيل برنامج ImageJ على https://imagej.nih.gov/ij/download.html

  1. افتح ملف صورة في ImageJ.
  2. افتح مدير عائد الاستثمار عن طريق تحديد تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار.
  3. استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لرسم خط يتوافق مع عرض الفغرة (الشكل 2) وتسجيل عائد الاستثمار بالنقر فوق إضافة في مدير عائد الاستثمار.
  4. ارسم خطا يتوافق مع طول نفس الفغرة (الشكل 2 أ) وسجل عائد الاستثمار كما هو موضح في الخطوة 5.3.
  5. انقر على قياس في مدير عائد الاستثمار لقياس العرض والطول.
  6. اقسم العرض على الطول للحصول على فتحة الثغور (النسبة). للحصول على تقدير كمي قوي، استخدم 60 ثغورا أو أكثر لكل علاج ونقطة زمنية. لا تختار الثغور المبكرة أو الغامضة للتحليل (الشكل 2 ب ، ج).

6. القياس الآلي لفتحة الثغور

ملاحظة: يتم تشغيل خط أنابيب تحليل الصور في Google Colaboratory، وهي بيئة قابلة للتنفيذ بلغة برمجة Python سحابية. يجب أن يكون لدى المستخدمين حساب Google صالح مع Google Drive يعمل ومتصفح Google Chrome واتصال إنترنت ثابت كشرط أساسي.

  1. قم بتنزيل دفتر ملاحظات Google Colaboratory من Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) ، وافتح دفتر الملاحظات.
  2. أنشئ نسخة محلية من دفتر الملاحظات إلى Google Drive عن طريق اختيار ملف > حفظ نسخة في Drive. بعد ظهور علامة تبويب جديدة، أغلق علامة تبويب دفتر الملاحظات الأصلي بأمان.
  3. اضغط على الزر تنفيذ مرة واحدة أسفل قسم الإعداد البيئي في دفتر الملاحظات دون فتح كتل الخلايا لاستيراد المكتبات المطلوبة.
  4. نفذ قسم إعدادات الدليل لإنشاء ثلاثة مجلدات تستخدم للتحليل (على سبيل المثال ، example_result و inference_results و model) في Google Drive.
    ملاحظة: في هذه الحالة، يتم استخدام المجلدات المسماة example_result و inference_results و Model كدليل أصلي، وتخزين نتائج الاستدلال والنماذج المدربة، على التوالي. يعرض دفتر الملاحظات هذا مثالا على إنشاء الدليل كإجراء تمثيلي. لتغيير الاسم، أعد كتابة مسار pardir أو infdir أو modeldir .
  5. وفقا لقسم إعداد الصور ، انقل الصور التي تم الحصول عليها إلى example_result ، مجمعة في عناوين الصور حسب المعالجة أو العينة (على سبيل المثال ، mock_1h_XXXXXX.jpg) لإنشاء الرسم البياني النهائي. تتوفر عينات من الصور من Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
  6. قم بإجراء جزء تنزيل النماذج المدربة لتنزيل ملفات ONNX للنماذج المدربة من Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) ووضعها ضمن دليل النموذج .
  7. قم بتشغيل جزء الاستدلال وقياس فتحة الثغور لتحديد فتحة الثغور من الصور الفردية. سيتم تصدير الصور الناتجة ذات الاستدلال المتراكب وملف csv المسمى example_result.csv إلى دليل inference_results.
  8. قم بتنفيذ قسم إنشاء الرسم البياني لإنشاء رسم بياني حول نسبة فتحة الثغور ، وتصديرها إلى دليل inference_results .

النتائج

بعد التلقيح بالرش ل Pto ، تمت ملاحظة الثغور على الأوراق المرتبطة بالنباتات الملقحة مباشرة بواسطة جهاز تصوير الثغور المحمول. باستخدام القياسات اليدوية والآلية ، تم استخدام نفس صور الأوراق لحساب فتحة الثغور عن طريق أخذ نسب العرض إلى الطول حوالي 60 ثغور. أشارت القياسات اليدوية والآلية با?...

Discussion

استخدمت الدراسات السابقة تقشير البشرة أو أقراص الأوراق أو الأوراق المنفصلة للتحقيق في استجابات الثغور للغزوات البكتيرية9،11،12. في المقابل ، فإن الطريقة المقترحة في هذه الدراسة تستفيد من جهاز تصوير الثغور المحمول لمراقبة الثغور مباشرة ع?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

نشكر جميع أعضاء المشروع البحثي ، "الإنشاء المشترك للسمات التكيفية للنبات من خلال تجميع holobiont الميكروب النباتي" ، على المناقشات المثمرة. تم دعم هذا العمل من قبل Grant-in-Aid لمجالات البحث التحويلية (21H05151 و 21H05149 إلى AM و 21H05152 إلى YT) و Grant-in-Aid لتحدي البحث الاستكشافي (22K19178 إلى A. M.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarNakarai tesque01028-85
Airbrush kitsANEST IWATAMX2900Accessory kits for SPRINT JET
BiotronNippon Medical & Chemical InstrumentsLPH-411SPlant Growth Chamber with white fluorescent light
GlycerolWako072-00626
Half traySakata72000113A set of tray and lid
HyponexHyponexNo catalogue number availableDilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image JNatinal Institute of HealthDownload at https://imagej.nih.gov/ij/download.htmlUsed for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4Wako164-04295
KClWako163-03545
KOHWako168-21815For MES-KOH
MESWako343-01621For MES-KOH
Portable stomatal imaging devicePhytometricsOrder at https://www.phytometrics.jp/Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
RifampicinWako185-01003Dissolve in DMSO
Silwet-L77Bio medical scienceBMS-SL7755silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JETANEST IWATAIS-800Airbrush used for spray inoculation
SuperMix ASakata seed72000083Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
TryptoneNakarai tesque35640-95
Vermiculite G20NittaiNo catalogue number availableMix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent lightNECFHF32EX-N-HX-SUsed for Biotron

References

  1. Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291 (2016).
  2. Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
  3. Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
  4. Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576 (2016).
  5. Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).
  6. Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
  7. Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
  8. Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
  9. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
  10. Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
  11. Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
  12. Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
  13. Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
  14. Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
  15. Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved