A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.

Abstract

סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המצויות באפידרמיס עלי הצמח. ויסות הצמצם הסטומטלי חיוני לא רק לאיזון ספיגת פחמן דו-חמצני לצורך פוטוסינתזה ואיבוד מים טרנספירטיביים, אלא גם להגבלת פלישת חיידקים. בעוד שצמחים סוגרים פיוניות עם זיהוי חיידקים, חיידקים פתוגניים, כגון מזרקי Pseudomonas pv . עגבניה DC3000 (Pto), פתח מחדש את הפיוניות הסגורות כדי לקבל גישה לפנים העלה. בבדיקות קונבנציונליות להערכת תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים, קליפות אפידרמיס עלים, דיסקיות עלים או עלים מנותקים צפים על תרחיף חיידקי, ולאחר מכן נצפו פיוניות תחת מיקרוסקופ ואחריו מדידה ידנית של צמצם סטומטלי. עם זאת, בדיקות אלה מסורבלות ועשויות שלא לשקף תגובות סטומאטליות לפלישה חיידקית טבעית בעלה המחובר לצמח. לאחרונה פותח מכשיר הדמיה נייד שיכול לצפות בפיוניות על ידי צביטת עלה מבלי לנתק אותו מהצמח, יחד עם צינור ניתוח תמונה מבוסס למידה עמוקה שנועד למדוד באופן אוטומטי את הצמצם הסטומטלי מתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר. כאן, בהתבסס על התקדמות טכנית זו, שיטה חדשה להערכת תגובות stomatal לפלישת חיידקים Arabidopsis thaliana מוצג. שיטה זו מורכבת משלושה שלבים פשוטים: חיסון ריסוס של Pto המחקה תהליכי זיהום טבעיים, תצפית ישירה של פיוניות על עלה של צמח מחוסן Pto באמצעות מכשיר הדמיה נייד, ומדידה אוטומטית של צמצם stomatal על ידי צינור ניתוח תמונה. שיטה זו שימשה בהצלחה כדי להדגים סגירה סטומטית ופתיחה מחדש במהלך פלישת Pto בתנאים המחקים באופן הדוק את האינטראקציה הטבעית בין צמחים לחיידקים.

Introduction

סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המוקפות בזוג תאי שמירה על פני השטח של עלים וחלקים אוויריים אחרים של צמחים. בסביבות המשתנות ללא הרף, ויסות הצמצם הסטומטלי הוא מרכזי עבור צמחים כדי לשלוט בספיגת הפחמן הדו-חמצני הנדרשת לפוטוסינתזה על חשבון איבוד מים באמצעות טרנספירציה. לפיכך, כימות הצמצם הסטומטלי סייע להבנת ההסתגלות הסביבתית של הצמח. עם זאת, כימות הצמצם הסטומטלי הוא מטבעו זמן רב ומסורבל מכיוון שהוא דורש עבודה אנושית כדי לזהות ולמדוד נקבוביות סטומטליות בתמונת עלה שצולמה במיקרוסקופ. כדי לעקוף מגבלות אלה, פותחו שיטות שונות כדי להקל על כימות הצמצם הסטומטלי ב- Arabidopsis thaliana, צמח מודל המשמש באופן נרחב לחקר ביולוגיה סטומטית 1,2,....

Protocol

1. גידול צמחים

  1. כדי לשבור תרדמה, להשהות מחדש זרעי A. thaliana (Col-0) במים deionized לדגור אותם ב 4 ° C במשך 4 ימים בחושך.
  2. לזרוע את הזרעים על הקרקע ולגדול בחדר מצויד אור פלורסנט לבן. שמרו על תנאי הגידול הבאים: טמפרטורה של 22°C, עוצמת אור של 6,000 לוקס (כ-100 μmol/m/m/s) למשך 10 שעות, ולחות יחסית של 60%.
  3. בעת הצורך, השקו את הצמחים בדשן נוזלי. יש להימנע מהשקיה משבוע עד יומיים לפני החיסון ולהשקות היטב יום אחד לפני החיסון.

2. הכנת חיסון חיידקי

  1. פס Pto ממלאי גליצרול על מדיום King's B (KB) מוצק (20 גרם טריפטון, 1.5 גרם K2HPO4,....

תוצאות

לאחר חיסון ריסוס של Pto, פיוניות על עלים המחוברים לצמחים המחוסנים נצפו ישירות על ידי מכשיר הדמיה סטומטלי נייד. באמצעות מדידות ידניות ואוטומטיות, אותן תמונות עלים שימשו לחישוב צמצם סטומטלי על ידי לקיחת יחסים של רוחב לאורך של כ -60 פיוניות. מדידות ידניות ואוטומטיות הצביעו באופן עקבי על יר?.......

Discussion

מחקרים קודמים השתמשו בקליפות אפידרמיס, דיסקיות עלים או עלים מנותקים כדי לחקור תגובות סטומאטליות לפלישות חיידקים 9,11,12. לעומת זאת, השיטה המוצעת במחקר זה ממנפת את מכשיר הדימות הסטומטלי הנייד כדי לצפות ישירות בפיוניות על עלה המחובר לצמח לאח?.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

אנו מודים לכל חברי פרויקט המחקר, "יצירה משותפת של תכונות אדפטיביות צמחיות באמצעות הרכבה של הולוביונט צמחי-מיקרובי", על דיונים פוריים. עבודה זו נתמכה על ידי Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 ו-21H05149 עד A.M. ו-21H05152 ל-Y.T.) ו-Grant-in-Aid for Challenge Exploratory Research (22K19178 to A. M).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarNakarai tesque01028-85
Airbrush kitsANEST IWATAMX2900Accessory kits for SPRINT JET
BiotronNippon Medical & Chemical InstrumentsLPH-411SPlant Growth Chamber with white fluorescent light
GlycerolWako072-00626
Half traySakata72000113A set of tray and lid
HyponexHyponexNo catalogue number availableDilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image JNatinal Institute of HealthDownload at https://imagej.nih.gov/ij/download.htmlUsed for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4Wako164-04295
KClWako163-03545
KOHWako168-21815For MES-KOH
MESWako343-01621For MES-KOH
Portable stomatal imaging devicePhytometricsOrder at https://www.phytometrics.jp/Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
RifampicinWako185-01003Dissolve in DMSO
Silwet-L77Bio medical scienceBMS-SL7755silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JETANEST IWATAIS-800Airbrush used for spray inoculation
SuperMix ASakata seed72000083Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
TryptoneNakarai tesque35640-95
Vermiculite G20NittaiNo catalogue number availableMix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent lightNECFHF32EX-N-HX-SUsed for Biotron

References

  1. Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291 (2016).
  2. Bourdais, G., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved