תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.

Abstract

סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המצויות באפידרמיס עלי הצמח. ויסות הצמצם הסטומטלי חיוני לא רק לאיזון ספיגת פחמן דו-חמצני לצורך פוטוסינתזה ואיבוד מים טרנספירטיביים, אלא גם להגבלת פלישת חיידקים. בעוד שצמחים סוגרים פיוניות עם זיהוי חיידקים, חיידקים פתוגניים, כגון מזרקי Pseudomonas pv . עגבניה DC3000 (Pto), פתח מחדש את הפיוניות הסגורות כדי לקבל גישה לפנים העלה. בבדיקות קונבנציונליות להערכת תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים, קליפות אפידרמיס עלים, דיסקיות עלים או עלים מנותקים צפים על תרחיף חיידקי, ולאחר מכן נצפו פיוניות תחת מיקרוסקופ ואחריו מדידה ידנית של צמצם סטומטלי. עם זאת, בדיקות אלה מסורבלות ועשויות שלא לשקף תגובות סטומאטליות לפלישה חיידקית טבעית בעלה המחובר לצמח. לאחרונה פותח מכשיר הדמיה נייד שיכול לצפות בפיוניות על ידי צביטת עלה מבלי לנתק אותו מהצמח, יחד עם צינור ניתוח תמונה מבוסס למידה עמוקה שנועד למדוד באופן אוטומטי את הצמצם הסטומטלי מתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר. כאן, בהתבסס על התקדמות טכנית זו, שיטה חדשה להערכת תגובות stomatal לפלישת חיידקים Arabidopsis thaliana מוצג. שיטה זו מורכבת משלושה שלבים פשוטים: חיסון ריסוס של Pto המחקה תהליכי זיהום טבעיים, תצפית ישירה של פיוניות על עלה של צמח מחוסן Pto באמצעות מכשיר הדמיה נייד, ומדידה אוטומטית של צמצם stomatal על ידי צינור ניתוח תמונה. שיטה זו שימשה בהצלחה כדי להדגים סגירה סטומטית ופתיחה מחדש במהלך פלישת Pto בתנאים המחקים באופן הדוק את האינטראקציה הטבעית בין צמחים לחיידקים.

Introduction

סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המוקפות בזוג תאי שמירה על פני השטח של עלים וחלקים אוויריים אחרים של צמחים. בסביבות המשתנות ללא הרף, ויסות הצמצם הסטומטלי הוא מרכזי עבור צמחים כדי לשלוט בספיגת הפחמן הדו-חמצני הנדרשת לפוטוסינתזה על חשבון איבוד מים באמצעות טרנספירציה. לפיכך, כימות הצמצם הסטומטלי סייע להבנת ההסתגלות הסביבתית של הצמח. עם זאת, כימות הצמצם הסטומטלי הוא מטבעו זמן רב ומסורבל מכיוון שהוא דורש עבודה אנושית כדי לזהות ולמדוד נקבוביות סטומטליות בתמונת עלה שצולמה במיקרוסקופ. כדי לעקוף מגבלות אלה, פותחו שיטות שונות כדי להקל על כימות הצמצם הסטומטלי ב- Arabidopsis thaliana, צמח מודל המשמש באופן נרחב לחקר ביולוגיה סטומטית 1,2,3,4,5,6. לדוגמה, ניתן להשתמש בפורומטר כדי למדוד את קצב השעתוק כמדד של מוליכות סטומטלית. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת מידע ישיר על מספר הסטומטלית והצמצם הקובעים את המוליכות הסטומטלית. מחקרים מסוימים השתמשו בטכניקות מיקרוסקופיה קונפוקלית המדגישות נקבוביות סטומאטליות באמצעות סמן אקטין פלואורסצנטי, צבע פלואורסצנטי או אוטופלואורסצנטיות של דופן התא 1,2,3,4,5. בעוד שגישות אלה מקלות על איתור פיוניות, העלות הן של הפעלת מתקן מיקרוסקופיה קונפוקלית והן של הכנת דגימות מיקרוסקופיה יכולה להוות מכשול ליישום שגרתי. בעבודה פורצת דרך של סאי ואחרים, פותח מודל רשת עצבית עמוקה למדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי מתמונות מיקרוסקופיות בשדה בהיר של קליפות אפידרמיס A. thaliana ⁶. עם זאת, חידוש זה אינו פוטר חוקרים מהמשימה של הכנת קליפת אפידרמיס לתצפית מיקרוסקופית. לאחרונה, התגברו על מכשול זה על ידי פיתוח מכשיר הדמיה נייד שיכול לצפות בפיוניות על ידי צביטת עלה של A. thaliana, יחד עם צינור ניתוח תמונה מבוסס למידה עמוקה המודד באופן אוטומטי צמצם סטומטלי מתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר⁷.

סטומטות תורמות לחסינות מולדת של הצמח מפני פתוגנים חיידקיים. המפתח לתגובה חיסונית זו הוא סגירה סטומטית המגבילה את כניסת החיידקים דרך הנקבובית המיקרוסקופית אל פנים העלה, שם פתוגנים חיידקיים מתרבים וגורמים למחלות⁸. סגירה סטומטית נגרמת על ידי זיהוי של דפוסים מולקולריים הקשורים למיקרובים (MAMPs), מולקולות אימונוגניות המשותפות לעתים קרובות לסוג של מיקרובים, על ידי קולטני זיהוי תבניות מקומיות של קרום פלזמה (PRR)⁹. אפיטופ של 22 חומצות אמינו של שוטון חיידקי המכונה flg22 הוא MAMP טיפוסי הגורם לסגירה סטומטית באמצעות זיהויו על ידי PRR FLS2¹⁰. כאמצעי נגד, פתוגנים חיידקיים כגון מזרקי Pseudomonas pv. עגבניה DC3000 (Pto) ו-Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria פיתחו מנגנוני אלימות כדי לפתוח מחדש פיוניות ^9,11,12. תגובות סטומאטליות אלה לפתוגנים חיידקיים נותחו באופן קונבנציונלי בבדיקות שבהן קליפות אפידרמיס עלים, דיסקיות עלים או עלים מנותקים צפים על תרחיף חיידקי, ולאחר מכן נצפו פיוניות תחת מיקרוסקופ ואחריו מדידה ידנית של צמצם סטומטלי. עם זאת, בדיקות אלה מסורבלות ועשויות שלא לשקף תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים טבעית המתרחשת בעלה המחובר לצמח.

כאן, מוצגת שיטה פשוטה לחקור סגירה סטומטית ופתיחה מחדש במהלך פלישת Pto במצב המחקה באופן הדוק את האינטראקציה הטבעית בין צמחים לחיידקים. שיטה זו ממנפת את מכשיר ההדמיה הנייד לתצפית ישירה על פיוניות A. thaliana על עלה המחובר לצמח המחוסן ב-Pto, יחד עם צינור ניתוח התמונה למדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי.

Protocol

1. גידול צמחים

1. כדי לשבור תרדמה, להשהות מחדש זרעי A. thaliana (Col-0) במים deionized לדגור אותם ב 4 ° C במשך 4 ימים בחושך.
2. לזרוע את הזרעים על הקרקע ולגדול בחדר מצויד אור פלורסנט לבן. שמרו על תנאי הגידול הבאים: טמפרטורה של 22°C, עוצמת אור של 6,000 לוקס (כ-100 μmol/m^/m/s) למשך 10 שעות, ולחות יחסית של 60%.
3. בעת הצורך, השקו את הצמחים בדשן נוזלי. יש להימנע מהשקיה משבוע עד יומיים לפני החיסון ולהשקות היטב יום אחד לפני החיסון.

2. הכנת חיסון חיידקי

1. פס Pto ממלאי גליצרול על מדיום King's B (KB) מוצק (20 גרם טריפטון, 1.5 גרם K₂HPO_4, ו 15 גרם גליצרול עבור 1 ליטר, 1.5% אגר) עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ריפמפיצין ולדגור ב 28 ° C במשך יומיים.
2. יש לחסן מושבה בודדת עד 5 מ"ל של מדיום נוזלי KB עם ריפמפיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל ולדגור ב-28°C עם ניעור ב-200 סל"ד עד לשלב הצמיחה הלוגריתמי המאוחר.
3. צנטריפוגו את התרבית ב 6,000 x גרם במשך 2 דקות, להשליך את supernatant, ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של מים סטריליים. חזור על שלב זה פעם נוספת.
4. הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה ב- 1 מ"ל של חיץ פתיחת הפיוניות (25 mM MES-KOH pH 6.15, 10 mM KCl), ומדוד את OD₆₀₀.
5. דללו את המתלה ל-OD₆₀₀ 0.2 עם חיץ פתיחת פיוניות המכיל 0.04% סיליקון פעילי שטח.

3. חיסון ריסוס של חיידקים

1. מיום אחד לפני החיסון ועד סוף הניסוי, יש לחשוף את הצמחים לעוצמת אור של כ-10,000 לוקס (כ-170 מיקרומול/מ"ר²/שנייה).
2. כדי להבטיח שרוב הפיוניות פתוחות, יש לשמור את הצמחים על מגש מכוסה במכסה שקוף מתחת לאור לפחות 3 שעות לפני החיסון בריסוס.
3. הסירו את המכסה והשתמשו במברשת אוויר כדי לרסס את הצד האבקסיאלי של העלים בתרחיף חיידקי של 2.5 מ"ל לכל שלושה צמחים על עציץ אחד.
4. דגרו על הצמחים המחוסנים על מגש מכוסה במכסה שקוף כדי לשמור על לחות יחסית של כ-85%.
5. רכוש תמונות של פיוניות בשעה אחת ושלוש שעות לאחר חיסון בתרסיס בשיטה המתוארת בסעיף 4.

4. תצפית ישירה על הפיוניות באמצעות מכשיר הדימות הנייד

הערה: התקן ההדמיה הסטומטלית הנייד מצויד באור LED ובמודול מצלמה ויכול לרכוש 2,592 תמונות × 1,944 (גובה × רוחב; פיקסלים) ברזולוציה של כ- 0.5 מיקרומטר לפיקסל.

1. חבר את התקן ההדמיה הסטומטלית הנייד למחשב אישי (PC) המצויד בתוכנה לרכישת תמונה.
2. מוציאים בעדינות אך לחלוטין טיפות מים מהעלים המחוסנים בעזרת פיסת נייר.
3. פתחו את הכיסוי העליון של המכשיר, הניחו את העלה על הבמה וסגרו את הכיסוי העליון (איור 1).
4. כוונן את מוקד התמונה על-ידי מניפולציה של בורג הכוונן, ולאחר מכן לחץ על הלחצן שמור תמונה במסך המחשב. התמונה תירכש באופן מיידי. בדרך כלל, תמונה ממוקדת מכילה כ-10 פיוניות הניתנות לניתוח. כדי לקבל תוצאות חזקות, רכשו תמונות סטומטליות משישה עלים של שלושה צמחים שונים (שני עלים לכל צמח).

5. מדידה ידנית של צמצם סטומטלי

הערה: ניתן להוריד את תוכנת ImageJ בכתובת https://imagej.nih.gov/ij/download.html

1. פתח קובץ תמונה ב- ImageJ.
2. פתח את מנהל החזר ההשקעה על-ידי בחירה באפשרות נתח כלי > > מנהל החזר ההשקעה.
3. השתמש בכלי בחירת הקו הישר כדי לצייר קו המתאים לרוחב הסטומה (איור 2) ולרשום את החזר ההשקעה על-ידי לחיצה על הוסף במנהל החזר ההשקעה.
4. צייר קו המתאים לאורך אותה סטומה (איור 2A) ורשום את החזר ההשקעה כמתואר בשלב 5.3.
5. לחץ על מדידה במנהל החזר ההשקעה כדי למדוד את הרוחב והאורך.
6. חלק את הרוחב באורך כדי לקבל את הצמצם הסטומטלי (יחס). לכימות חזק, השתמש ב- 60 פיוניות או יותר עבור כל טיפול ונקודת זמן. אל תבחרו פיוניות מוקדמות או מעורפלות לניתוח (איור 2B, C).

6. מדידה אוטומטית של צמצם סטומטלי

הערה: צינור ניתוח התמונות פועל ב- Google Colaboratory, סביבת הפעלה של שפת תכנות Python בענן. למשתמשים חייב להיות חשבון Google חוקי עם כונן Google פעיל, דפדפן Google Chrome וחיבור אינטרנט יציב כתנאי מוקדם.

1. הורד את המחשב הנייד Google Colaboratory מ-Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) ופתח את המחברת.
2. צור עותק מקומי של המחשב הנייד ב-Google Drive על ידי לחיצה על קובץ > שמירת עותק ב-Drive. לאחר הופעת כרטיסיה חדשה, סגור בבטחה את הכרטיסיה של המחברת המקורית.
3. לחץ על לחצן הפעל פעם אחת מתחת למקטע הגדרת סביבה במחברת מבלי לפתוח את בלוקי התאים כדי לייבא את הספריות הדרושות.
4. הפעילו את המקטע 'הגדרות ספרייה ' כדי ליצור שלוש תיקיות המשמשות לניתוח (למשל, example_result, inference_results ודגם) ב-Google Drive.
   הערה: במקרה זה, התיקיות הנקראות example_result, inference_results ו - model משמשות כספריית הורים, המאחסנות תוצאות הסקה ומודלים מאומנים, בהתאמה. מחברת זו מציגה דוגמה לבניית ספריות כהליך מייצג. כדי לשנות את השם, כתוב מחדש את הנתיב pardir, infdir או modeldir .
5. על פי החלק הכנת התמונות , העבר את התמונות שנרכשו ל- example_result, מקובצות בכותרות תמונות לפי טיפול או מדגם (למשל, mock_1h_XXXXXX.jpg) עבור יצירת הגרף הסופי. תמונות לדוגמה זמינות באתר Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
6. בצע את החלק הורד מודלים מאומנים כדי להוריד את קבצי ONNX של הדגמים המאומנים מ- Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) ולמקם אותם תחת ספריית הדגמים .
7. הפעל את החלק Inference and Measurement of Stomatal Aperture כדי לכמת את הצמצם הסטומטלי מתמונות בודדות. תמונות התוצאה עם הסקה שכבת-על וקובץ csv בשם example_result.csv ייוצאו לספריית inference_results.
8. הפעילו את המקטע 'יצירת תרשימים ' ליצירת גרף על יחס הצמצם הסטומטי, המיוצא לספריית inference_results .

תוצאות

לאחר חיסון ריסוס של Pto, פיוניות על עלים המחוברים לצמחים המחוסנים נצפו ישירות על ידי מכשיר הדמיה סטומטלי נייד. באמצעות מדידות ידניות ואוטומטיות, אותן תמונות עלים שימשו לחישוב צמצם סטומטלי על ידי לקיחת יחסים של רוחב לאורך של כ -60 פיוניות. מדידות ידניות ואוטומטיות הצביעו באופן עקבי על יר?...

Discussion

מחקרים קודמים השתמשו בקליפות אפידרמיס, דיסקיות עלים או עלים מנותקים כדי לחקור תגובות סטומאטליות לפלישות חיידקים ^9,11,12. לעומת זאת, השיטה המוצעת במחקר זה ממנפת את מכשיר הדימות הסטומטלי הנייד כדי לצפות ישירות בפיוניות על עלה המחובר לצמח לאח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron