A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.
סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המצויות באפידרמיס עלי הצמח. ויסות הצמצם הסטומטלי חיוני לא רק לאיזון ספיגת פחמן דו-חמצני לצורך פוטוסינתזה ואיבוד מים טרנספירטיביים, אלא גם להגבלת פלישת חיידקים. בעוד שצמחים סוגרים פיוניות עם זיהוי חיידקים, חיידקים פתוגניים, כגון מזרקי Pseudomonas pv . עגבניה DC3000 (Pto), פתח מחדש את הפיוניות הסגורות כדי לקבל גישה לפנים העלה. בבדיקות קונבנציונליות להערכת תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים, קליפות אפידרמיס עלים, דיסקיות עלים או עלים מנותקים צפים על תרחיף חיידקי, ולאחר מכן נצפו פיוניות תחת מיקרוסקופ ואחריו מדידה ידנית של צמצם סטומטלי. עם זאת, בדיקות אלה מסורבלות ועשויות שלא לשקף תגובות סטומאטליות לפלישה חיידקית טבעית בעלה המחובר לצמח. לאחרונה פותח מכשיר הדמיה נייד שיכול לצפות בפיוניות על ידי צביטת עלה מבלי לנתק אותו מהצמח, יחד עם צינור ניתוח תמונה מבוסס למידה עמוקה שנועד למדוד באופן אוטומטי את הצמצם הסטומטלי מתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר. כאן, בהתבסס על התקדמות טכנית זו, שיטה חדשה להערכת תגובות stomatal לפלישת חיידקים Arabidopsis thaliana מוצג. שיטה זו מורכבת משלושה שלבים פשוטים: חיסון ריסוס של Pto המחקה תהליכי זיהום טבעיים, תצפית ישירה של פיוניות על עלה של צמח מחוסן Pto באמצעות מכשיר הדמיה נייד, ומדידה אוטומטית של צמצם stomatal על ידי צינור ניתוח תמונה. שיטה זו שימשה בהצלחה כדי להדגים סגירה סטומטית ופתיחה מחדש במהלך פלישת Pto בתנאים המחקים באופן הדוק את האינטראקציה הטבעית בין צמחים לחיידקים.
סטומטות הן נקבוביות מיקרוסקופיות המוקפות בזוג תאי שמירה על פני השטח של עלים וחלקים אוויריים אחרים של צמחים. בסביבות המשתנות ללא הרף, ויסות הצמצם הסטומטלי הוא מרכזי עבור צמחים כדי לשלוט בספיגת הפחמן הדו-חמצני הנדרשת לפוטוסינתזה על חשבון איבוד מים באמצעות טרנספירציה. לפיכך, כימות הצמצם הסטומטלי סייע להבנת ההסתגלות הסביבתית של הצמח. עם זאת, כימות הצמצם הסטומטלי הוא מטבעו זמן רב ומסורבל מכיוון שהוא דורש עבודה אנושית כדי לזהות ולמדוד נקבוביות סטומטליות בתמונת עלה שצולמה במיקרוסקופ. כדי לעקוף מגבלות אלה, פותחו שיטות שונות כדי להקל על כימות הצמצם הסטומטלי ב- Arabidopsis thaliana, צמח מודל המשמש באופן נרחב לחקר ביולוגיה סטומטית 1,2,....
1. גידול צמחים
2. הכנת חיסון חיידקי
לאחר חיסון ריסוס של Pto, פיוניות על עלים המחוברים לצמחים המחוסנים נצפו ישירות על ידי מכשיר הדמיה סטומטלי נייד. באמצעות מדידות ידניות ואוטומטיות, אותן תמונות עלים שימשו לחישוב צמצם סטומטלי על ידי לקיחת יחסים של רוחב לאורך של כ -60 פיוניות. מדידות ידניות ואוטומטיות הצביעו באופן עקבי על יר?.......
מחקרים קודמים השתמשו בקליפות אפידרמיס, דיסקיות עלים או עלים מנותקים כדי לחקור תגובות סטומאטליות לפלישות חיידקים 9,11,12. לעומת זאת, השיטה המוצעת במחקר זה ממנפת את מכשיר הדימות הסטומטלי הנייד כדי לצפות ישירות בפיוניות על עלה המחובר לצמח לאח?.......
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
אנו מודים לכל חברי פרויקט המחקר, "יצירה משותפת של תכונות אדפטיביות צמחיות באמצעות הרכבה של הולוביונט צמחי-מיקרובי", על דיונים פוריים. עבודה זו נתמכה על ידי Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 ו-21H05149 עד A.M. ו-21H05152 ל-Y.T.) ו-Grant-in-Aid for Challenge Exploratory Research (22K19178 to A. M).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
Glycerol | Wako | 072-00626 | |
Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
KCl | Wako | 163-03545 | |
KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved