Osservazione diretta e misurazione automatizzata delle risposte stomatiche a Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 in Arabidopsis thaliana

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo semplice per l'osservazione diretta e la misurazione automatizzata delle risposte stomatiche all'invasione batterica in Arabidopsis thaliana. Questo metodo sfrutta un dispositivo di imaging stomatico portatile, insieme a una pipeline di analisi delle immagini progettata per le immagini delle foglie catturate dal dispositivo.

Abstract

Gli stomi sono pori microscopici che si trovano nell'epidermide fogliare della pianta. La regolazione dell'apertura stomatica è fondamentale non solo per bilanciare l'assorbimento di anidride carbonica per la fotosintesi e la perdita d'acqua traspirante, ma anche per limitare l'invasione batterica. Mentre le piante chiudono gli stomi al riconoscimento di microbi, i batteri patogeni, come Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 (Pto), riaprire gli stomi chiusi per accedere all'interno della foglia. Nei saggi convenzionali per la valutazione delle risposte stomatiche all'invasione batterica, i peeling epidermici delle foglie, i dischi fogliari o le foglie staccate vengono fatti galleggiare su una sospensione batterica, quindi gli stomi vengono osservati al microscopio seguiti dalla misurazione manuale dell'apertura stomatica. Tuttavia, questi saggi sono ingombranti e potrebbero non riflettere le risposte stomatiche all'invasione batterica naturale in una foglia attaccata alla pianta. Recentemente, è stato sviluppato un dispositivo di imaging portatile in grado di osservare gli stomi pizzicando una foglia senza staccarla dalla pianta, insieme a una pipeline di analisi delle immagini basata sul deep learning progettata per misurare automaticamente l'apertura stomatica dalle immagini delle foglie catturate dal dispositivo. Qui, sulla base di questi progressi tecnici, viene introdotto un nuovo metodo per valutare le risposte stomatiche all'invasione batterica in Arabidopsis thaliana . Questo metodo consiste in tre semplici fasi: inoculazione a spruzzo di Pto che imita i processi di infezione naturali, osservazione diretta degli stomi su una foglia della pianta inoculata con presa di forza utilizzando il dispositivo di imaging portatile e misurazione automatizzata dell'apertura stomatica tramite la pipeline di analisi delle immagini. Questo metodo è stato utilizzato con successo per dimostrare la chiusura e la riapertura stomatica durante l'invasione della presa di forza in condizioni che imitano da vicino l'interazione naturale pianta-batterio.

Introduzione

Gli stomi sono pori microscopici circondati da un paio di cellule di guardia sulla superficie delle foglie e di altre parti aeree delle piante. In ambienti in continua evoluzione, la regolazione dell'apertura stomatica è fondamentale per le piante per controllare l'assorbimento di anidride carbonica necessario per la fotosintesi a scapito della perdita d'acqua attraverso la traspirazione. Pertanto, la quantificazione dell'apertura stomatica è stata fondamentale per comprendere l'adattamento ambientale delle piante. Tuttavia, la quantificazione dell'apertura stomatica è intrinsecamente dispendiosa in termini di tempo e ingombrante in quanto richiede il lavoro umano per individuare e misurare i pori stomatici in un'immagine fogliare catturata da un microscopio. Per aggirare queste limitazioni, sono stati sviluppati vari metodi per facilitare la quantificazione dell'apertura stomatica in Arabidopsis thaliana, una pianta modello ampiamente utilizzata per studiare la biologia stomatica 1,2,3,4,5,6. Ad esempio, un porometro può essere utilizzato per misurare il tasso di traspirazione come metrica della conduttanza stomatica. Tuttavia, questo metodo non fornisce informazioni dirette sul numero stomatico e sull'apertura che determinano la conduttanza stomatica. Alcuni studi hanno utilizzato tecniche di microscopia confocale che evidenziano i pori stomatici utilizzando un marcatore di actina fluorescente, un colorante fluorescente o l'autofluorescenza della parete cellulare 1,2,3,4,5. Sebbene questi approcci facilitino il rilevamento degli stomi, il costo sia del funzionamento di una struttura di microscopia confocale che della preparazione dei campioni di microscopia può essere un ostacolo all'applicazione di routine. In un lavoro pionieristico di Sai et al., è stato sviluppato un modello di rete neurale profonda per misurare automaticamente l'apertura stomatica da immagini microscopiche in campo chiaro di peeling epidermici di A. thaliana ⁶. Tuttavia, questa innovazione non esenta i ricercatori dal compito di preparare un peeling epidermico per l'osservazione microscopica. Recentemente, questo ostacolo è stato superato sviluppando un dispositivo di imaging portatile in grado di osservare gli stomi pizzicando una foglia di A. thaliana, insieme a una pipeline di analisi delle immagini basata sul deep learning che misura automaticamente l'apertura stomatica dalle immagini delle foglie catturate dal dispositivo⁷.

Gli stomi contribuiscono all'immunità innata delle piante contro i patogeni batterici. La chiave di questa risposta immunitaria è la chiusura stomatica che limita l'ingresso dei batteri attraverso il poro microscopico all'interno della foglia, dove i patogeni batterici proliferano e causano malattie⁸. La chiusura stomatica è indotta dal riconoscimento di pattern molecolari associati a microbi (MAMP), molecole immunogeniche spesso comuni a una classe di microbi, da parte dei recettori di riconoscimento dei pattern localizzati sulla membrana plasmatica (PRR)⁹. Un epitopo di 22 amminoacidi della flagellina batterica noto come flg22 è un tipico MAMP che induce la chiusura stomatica attraverso il suo riconoscimento da parte del PRR FLS2¹⁰. Come contromisura, patogeni batterici come Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 (presa di forza) e Xanthomonas campestris pv. Le vesciche hanno sviluppato meccanismi di virulenza per riaprire gli stomi ^9,11,12. Queste risposte stomatiche ai patogeni batterici sono state convenzionalmente analizzate in saggi in cui le bucce epidermiche delle foglie, i dischi fogliari o le foglie staccate vengono fatti galleggiare su una sospensione batterica, quindi gli stomi vengono osservati al microscopio seguiti dalla misurazione manuale dell'apertura stomatica. Tuttavia, questi saggi sono ingombranti e potrebbero non riflettere le risposte stomatiche all'invasione batterica naturale che si verificano in una foglia attaccata alla pianta.

Qui, viene presentato un metodo semplice per studiare la chiusura e la riapertura stomatica durante l'invasione della presa di forza in condizioni che imitano da vicino l'interazione naturale pianta-batterio. Questo metodo sfrutta il dispositivo di imaging portatile per l'osservazione diretta degli stomi di A. thaliana su una foglia attaccata alla pianta inoculata con Pto, insieme alla pipeline di analisi delle immagini per la misurazione automatizzata dell'apertura stomatica.

Protocollo

1. Piante in crescita

1. Per interrompere la dormienza, risospendere i semi di A. thaliana (Col-0) in acqua deionizzata e incubarli a 4 °C per 4 giorni al buio.
2. Semina i semi sul terreno e coltiva in una camera dotata di luce fluorescente bianca. Mantenere le seguenti condizioni di crescita: temperatura di 22 °C, intensità luminosa di 6.000 lux (ca. 100 μmol/m²/s) per 10 ore e umidità relativa del 60%.
3. Quando necessario, annaffia le piante con un fertilizzante liquido. Astenersi dall'annaffiare da 1 settimana a 2 giorni prima dell'inoculazione e innaffiare bene 1 giorno prima dell'inoculazione.

2. Preparazione dell'inoculo batterico

1. Striare il Pto da stock di glicerolo su terreno solidificato King's B (KB) (20 g di triptone, 1,5 g di K₂HPO₄ e 15 g di glicerolo per 1 L, 1,5% Agar) con 50 μg/mL di rifampicina e incubare a 28 °C per 2 giorni.
2. Inoculare una singola colonia in 5 mL di terreno liquido KB con rifampicina 50 μg/mL e incubare a 28 °C con agitazione a 200 rpm fino alla fase di crescita logaritmica tardiva.
3. Centrifugare la coltura a 6.000 x g per 2 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di acqua sterile. Ripeti questo passaggio ancora una volta.
4. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 1 mL di tampone di apertura degli stomi (25 mM MES-KOH pH 6,15, 10 mM KCl) e misurare il OD₆₀₀.
5. Diluire la sospensione a OD₆₀₀ 0,2 con tampone di apertura degli stomi contenente lo 0,04% di tensioattivo siliconico.

3. Inoculazione a spruzzo di batteri

1. Da 1 giorno prima dell'inoculazione fino alla fine dell'esperimento, esporre le piante a un'intensità luminosa di circa 10.000 lux (ca. 170 μmol/m²/s).
2. Per garantire che la maggior parte degli stomi sia aperta, tenere le piante su un vassoio coperto con un coperchio trasparente sotto la luce per almeno 3 ore prima dell'inoculazione spray.
3. Rimuovere il coperchio e utilizzare un aerografo per spruzzare il lato abassiale delle foglie con 2,5 ml di sospensione batterica per tre piante su un singolo vaso.
4. Incubare le piante inoculate su un vassoio coperto da un coperchio trasparente per mantenere un'umidità relativa di circa l'85%.
5. Acquisire immagini degli stomi a 1 ora e 3 ore dopo l'inoculazione spray utilizzando il metodo descritto al paragrafo 4.

4. Osservazione diretta degli stomi utilizzando il dispositivo di imaging portatile

NOTA: Il dispositivo portatile per l'imaging stomatico è dotato di una luce LED e di un modulo telecamera e può acquisire 2.592 × 1.944 immagini (altezza × larghezza; pixel) con una risoluzione di circa 0,5 μm/pixel.

1. Collegare il dispositivo portatile di imaging stomatico a un personal computer (PC) dotato di software di acquisizione delle immagini.
2. Rimuovere delicatamente ma completamente le goccioline d'acqua dalle foglie inoculate con un pezzo di carta.
3. Aprire il coperchio superiore del dispositivo, posizionare l'anta sul tavolino e chiudere il coperchio superiore (Figura 1).
4. Regolare la messa a fuoco dell'immagine manipolando la vite di regolazione, quindi fare clic sul pulsante Salva immagine sullo schermo del PC. L'immagine verrà acquisita all'istante. In genere, un'immagine focalizzata contiene circa 10 stomi analizzabili. Per ottenere risultati robusti, acquisisci immagini stomatiche da sei foglie di tre piante diverse (due foglie per pianta).

5. Misurazione manuale dell'apertura stomatica

NOTA: Il software ImageJ può essere scaricato all'indirizzo https://imagej.nih.gov/ij/download.html

1. Aprire un file di immagine in ImageJ.
2. Apri Gestione ROI selezionando Analizza strumenti > > Gestione ROI.
3. Utilizzare lo strumento di selezione Linea retta per disegnare una linea corrispondente alla larghezza di uno stoma (Figura 2) e registrare il ROI facendo clic su Aggiungi in Gestione ROI.
4. Tracciare una linea corrispondente alla lunghezza dello stesso stoma (Figura 2A) e registrare il ROI come descritto al punto 5.3.
5. Fare clic su Misura in Gestione ROI per misurare la larghezza e la lunghezza.
6. Dividere la larghezza per la lunghezza per ottenere l'apertura stomatica (rapporto). Per una quantificazione robusta, utilizzare 60 o più stomi per ogni trattamento e punto temporale. Non scegliere stomi prematuri o oscuri per l'analisi (Figura 2B, C).

6. Misurazione automatizzata dell'apertura stomatica

NOTA: la pipeline di analisi delle immagini viene eseguita in Google Colaboratory, un ambiente eseguibile del linguaggio di programmazione Python cloud. Gli utenti devono disporre di un account Google valido con un Google Drive funzionante, un browser Google Chrome e una connessione Internet stabile come prerequisito.

1. Scarica il notebook di Google Colaboratory da Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) e apri il notebook.
2. Crea una copia locale del taccuino su Google Drive selezionando File > Salva una copia in Drive. Quando viene visualizzata una nuova scheda, chiudere in modo sicuro la scheda del blocco appunti originale.
3. Premere una volta il pulsante Esegui sotto la sezione Impostazione ambientale nel notebook senza aprire i blocchi di celle per importare le librerie richieste.
4. Esegui la sezione Impostazioni directory per creare tre cartelle utilizzate per l'analisi (ad esempio, example_result, inference_results e modello) in Google Drive.
   NOTA: in questo caso, le cartelle denominate example_result, inference_results e model vengono utilizzate come directory padre, memorizzando rispettivamente i risultati dell'inferenza e i modelli sottoposti a training. In questo notebook viene illustrato un esempio di costruzione di directory come procedura rappresentativa. Per modificare il nome, riscrivere il percorso pardir, infdir o modeldir .
5. In base alla sezione Preparazione delle immagini , spostare le immagini acquisite in example_result, raggruppate in titoli di immagini per trattamento o campione (ad esempio, mock_1h_XXXXXX.jpg) per la generazione finale del grafico. Immagini di esempio sono disponibili presso Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
6. Eseguire la parte Download Trained Models per scaricare i file ONNX dei modelli addestrati da Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) e posizionarli nella directory del modello .
7. Eseguire la parte Inferenza e misurazione dell'apertura stomatica per quantificare l'apertura stomatica da singole immagini. Le immagini risultanti con inferenza sovrapposta e il file csv denominato example_result.csv verranno esportati nella directory inference_results.
8. Eseguire la sezione Generazione grafico per creare un grafico relativo al rapporto di apertura stomatica, esportato nella directory inference_results .

Risultati

Dopo l'inoculazione spray di Pto, gli stomi sulle foglie attaccate alle piante inoculate sono stati osservati direttamente dal dispositivo di imaging stomatico portatile. Utilizzando misurazioni manuali e automatizzate, le stesse immagini delle foglie sono state utilizzate per calcolare l'apertura stomatica prendendo rapporti tra larghezza e lunghezza di circa 60 stomi. Le misurazioni manuali e automatizzate hanno indicato costantemente una diminuzione dell'apertura stomatica nelle piante inoculate con presa...

Discussione

Studi precedenti hanno utilizzato peeling epidermici, dischi fogliari o foglie staccate per studiare le risposte stomatiche alle invasioni batteriche ^9,11,12. Al contrario, il metodo proposto in questo studio sfrutta il dispositivo portatile di imaging stomatico per osservare direttamente gli stomi su una foglia attaccata alla pianta dopo l'inoculazione spray di Pto, imitando le condizioni naturali di invasione batteric...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron