直接观察和自动测量对丁香假单胞菌 pv 的气孔反应。番茄拟南芥中的DC3000

摘要

在这里，我们提出了一种简单的方法，用于直接观察和自动测量 拟南芥对细菌入侵的气孔反应。该方法利用便携式气孔成像设备，以及专为设备捕获的叶片图像而设计的图像分析管道。

摘要

气孔是在植物叶片表皮中发现的微小孔隙。气孔的调节不仅对于平衡光合作用和蒸腾水分损失的二氧化碳吸收至关重要，而且对于限制细菌入侵也至关重要。当植物在识别微生物时关闭气孔，致病细菌，如 丁香假单胞菌 pv。 番茄 DC3000 （Pto），重新打开闭合的气孔以进入叶片内部。在评估气孔对细菌入侵反应的常规测定中，将叶表皮皮、叶盘或分离的叶漂浮在细菌悬浮液上，然后在显微镜下观察气孔，然后手动测量气孔孔径。然而，这些测定很麻烦，可能无法反映附着在植物上的叶子对自然细菌入侵的气孔反应。最近，开发了一种便携式成像设备，可以通过捏住叶子而不将其从植物上分离来观察气孔，以及基于深度学习的图像分析管道，旨在从设备捕获的叶子图像中自动测量气孔孔径。在这里，在这些技术进步的基础上，介绍了一种评估 拟南芥 细菌入侵的气孔反应的新方法。该方法包括三个简单的步骤：模拟自然感染过程的 Pto 喷雾接种，使用便携式成像设备直接观察 Pto接种植物叶子上的气孔，以及通过图像分析管道自动测量气孔径。该方法成功地用于在 Pto 侵袭期间在密切模拟天然植物-细菌相互作用的条件下气孔关闭和重新开放。

引言

气孔是植物叶子和其他地上部分表面被一对保卫细胞包围的微观孔隙。在不断变化的环境中，气孔的调节是植物控制光合作用所需的二氧化碳吸收的核心，而代价是通过蒸腾作用流失水分。因此，气孔孔径的量化有助于了解植物的环境适应性。然而，量化气孔本质上是耗时和繁琐的，因为它需要人工来发现和测量显微镜捕获的叶片图像中的气孔。为了规避这些限制，已经开发了各种方法来促进拟南芥气孔的量化，拟南芥是一种广泛用于研究气孔生物学的模式植物1,2,3,4,5,6。例如，孔径计可用于测量蒸腾速率，作为气孔导度的指标。然而，该方法不能提供关于确定气孔导率的气孔数和孔径的直接信息。一些研究使用共聚焦显微镜技术，使用荧光肌动蛋白标记物、荧光染料或细胞壁自发荧光^{1、2、3、4、}

研究方案

1. 种植植物

1. 为了打破休眠，将 拟南芥 （Col-0）种子重悬于去离子水中，并在4°C下在黑暗中孵育4天。
2. 将种子播种在土壤上，并在装有白色荧光灯的房间中生长。保持以下生长条件：温度为22°C，光强度为6,000勒克斯（约100μmol /^{m 2} / s）10小时，相对湿度为60%。
3. 需要时，用液体肥料给植物浇水。接种前 1 周至 2 天不要浇水，接种前 1 天浇水。

2.制备细菌接种物

1. 在凝固的King's B（KB）培养基（20g胰蛋白胨，1.5gK₂HPO_4和15g甘油的1L，1.5%琼脂）上从甘油储备中提取条纹Pto与50μg/ mL利福平，并在28°C下孵育2天。
2. 将单个菌落接种至含有50μg/ mL利福平的5mLKB液体培养基中，并在28°C下以200rpm振荡孵育至对数生长后期。
3. 以 6,000 x g 离心培养物 2 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 无菌水中。再次重复此步骤。
4. 除去上清液，将沉淀重悬于1mL气孔开口缓冲液（25mM MES-KOH pH 6.15,10mM KCl）中，并测量OD_600<....

讨论

以前的研究使用表皮剥离、叶盘或分离的叶子来研究气孔对细菌入侵的反应 ^9,11,12。相比之下，本研究提出的方法利用便携式气孔成像设备直接观察喷洒接种Pto后附着在植物上的叶子上的气孔，模拟细菌入侵的自然条件。此外，由于该方法不涉及破坏性的样品制备过程，例如叶片脱落、叶盘切除和表皮剥离，因此可以避?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron