Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем простой метод прямого наблюдения и автоматизированного измерения устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana. В этом методе используется портативное устройство визуализации устьиц вместе с конвейером анализа изображений, предназначенным для изображений листьев, полученных устройством.

Аннотация

Устьица – это микроскопические поры, находящиеся в эпидермисе листьев растений. Регуляция устьичной апертуры имеет решающее значение не только для балансировки поглощения углекислого газа для фотосинтеза и транспирационной потери воды, но и для ограничения бактериальной инвазии. В то время как растения закрывают устьица при распознавании микробов, патогенные бактерии, такие как Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 (PTO), снова откройте закрытые устьица, чтобы получить доступ к внутренней части листа. В традиционных анализах для оценки реакции устьиц на бактериальную инвазию эпидермальные оболочки листьев, листовые диски или отделившиеся листья плавают на бактериальной суспензии, а затем устьица наблюдают под микроскопом с последующим ручным измерением устьичного отверстия. Однако эти анализы громоздки и могут не отражать устьичные реакции на естественную бактериальную инвазию в листе, прикрепленном к растению. Недавно было разработано портативное устройство визуализации, которое может наблюдать за устьицами, прищипывая лист, не отрывая его от растения, вместе с конвейером анализа изображений на основе глубокого обучения, предназначенным для автоматического измерения апертуры устьиц по изображениям листьев, полученным устройством. Здесь, основываясь на этих технических достижениях, представлен новый метод оценки устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana . Этот метод состоит из трех простых этапов: распылительная инокуляция Pto , имитирующая естественные инфекционные процессы, непосредственное наблюдение устьиц на листе растения, инокулированного Pto, с помощью портативного устройства визуализации и автоматизированное измерение апертуры устьиц с помощью конвейера анализа изображений. Этот метод был успешно использован для демонстрации закрытия и повторного открытия устьиц во время инвазии Pto в условиях, которые близко имитируют естественное взаимодействие растений и бактерий.

Введение

Устьица представляют собой микроскопические поры, окруженные парой защитных клеток на поверхности листьев и других надземных частей растений. В постоянно меняющихся условиях регулирование устьичного отверстия является центральным для растений, чтобы контролировать поглощение углекислого газа, необходимого для фотосинтеза, за счет потери воды через транспирацию. Таким образом, количественная оценка устьичного отверстия сыграла важную роль в понимании адаптации растений к окружающей среде. Тем не менее, количественная оценка устьичной апертуры по своей сути является трудоемкой и громоздкой, поскольку требует человеческого труда, чтобы обнаружить и измерить устьичные пор....

протокол

1. Выращивание растений

  1. Чтобы выйти из состояния покоя, повторно суспендируйте семена A. thaliana (Col-0) в деионизированной воде и инкубируйте их при 4 °C в течение 4 дней в темноте.
  2. Посейте семена на почву и выращивайте в камере, оборудованной белым флуоресцентным светом. Поддерживайте следующие условия роста: температура 22 °C, интенсивность света 6 000 люкс (около 100 мкмоль/м2/с) в течение 10 часов и относительная влажность воздуха 60%.
  3. При необходимости поливайте растения жидким удобрением. Воздержитесь от полива от 1 недели до 2 дней до прививки и хорошо полейте за 1 день до прививки.
....

Результаты

После распылительной инокуляции Pto устьица на листьях, прикрепленных к инокулированным растениям, непосредственно наблюдались с помощью портативного устройства визуализации устьиц. Используя ручные и автоматизированные измерения, одни и те же изображения листьев были использо?.......

Обсуждение

В предыдущих исследованиях использовали эпидермальные корки, листовые диски или отделившиеся листья для изучения устьичных реакций на бактериальные инвазии 9,11,12. В отличие от этого, метод, предложенный в этом исследовании, использует.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Благодарности

Благодарим всех участников исследовательского проекта «Совместное создание адаптивных признаков растений через сборку растительно-микробного голобионта» за плодотворные дискуссии. Эта работа была поддержана Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 и 21H05149 to A.M. и 21H05152 to Y.T.) и Grant-in-Aid for Challenge Exploratory Research (22K19178 to A.M.).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarNakarai tesque01028-85
Airbrush kitsANEST IWATAMX2900Accessory kits for SPRINT JET
BiotronNippon Medical & Chemical InstrumentsLPH-411SPlant Growth Chamber with white fluorescent light
GlycerolWako072-00626
Half traySakata72000113A set of tray and lid
HyponexHyponexNo catalogue number availableDilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image JNatinal Institute of HealthDownload at https://imagej.nih.gov/ij/download.htmlUsed for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4Wako164-04295
KClWako163-03545
KOHWako168-21815For MES-KOH
MESWako343-01621For MES-KOH
Portable stomatal imaging devicePhytometricsOrder at https://www.phytometrics.jp/Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
RifampicinWako185-01003Dissolve in DMSO
Silwet-L77Bio medical scienceBMS-SL7755silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JETANEST IWATAIS-800Airbrush used for spray inoculation
SuperMix ASakata seed72000083Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
TryptoneNakarai tesque35640-95
Vermiculite G20NittaiNo catalogue number availableMix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent lightNECFHF32EX-N-HX-SUsed for Biotron

Ссылки

  1. Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291 (2016).
  2. Bourdais, G., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены