Прямое наблюдение и автоматизированное измерение ответов устьиц на синегнойную палочку pv. помидор DC3000 в Arabidopsis thaliana

Резюме

Здесь мы представляем простой метод прямого наблюдения и автоматизированного измерения устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana. В этом методе используется портативное устройство визуализации устьиц вместе с конвейером анализа изображений, предназначенным для изображений листьев, полученных устройством.

Аннотация

Устьица – это микроскопические поры, находящиеся в эпидермисе листьев растений. Регуляция устьичной апертуры имеет решающее значение не только для балансировки поглощения углекислого газа для фотосинтеза и транспирационной потери воды, но и для ограничения бактериальной инвазии. В то время как растения закрывают устьица при распознавании микробов, патогенные бактерии, такие как Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 (PTO), снова откройте закрытые устьица, чтобы получить доступ к внутренней части листа. В традиционных анализах для оценки реакции устьиц на бактериальную инвазию эпидермальные оболочки листьев, листовые диски или отделившиеся листья плавают на бактериальной суспензии, а затем устьица наблюдают под микроскопом с последующим ручным измерением устьичного отверстия. Однако эти анализы громоздки и могут не отражать устьичные реакции на естественную бактериальную инвазию в листе, прикрепленном к растению. Недавно было разработано портативное устройство визуализации, которое может наблюдать за устьицами, прищипывая лист, не отрывая его от растения, вместе с конвейером анализа изображений на основе глубокого обучения, предназначенным для автоматического измерения апертуры устьиц по изображениям листьев, полученным устройством. Здесь, основываясь на этих технических достижениях, представлен новый метод оценки устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana . Этот метод состоит из трех простых этапов: распылительная инокуляция Pto , имитирующая естественные инфекционные процессы, непосредственное наблюдение устьиц на листе растения, инокулированного Pto, с помощью портативного устройства визуализации и автоматизированное измерение апертуры устьиц с помощью конвейера анализа изображений. Этот метод был успешно использован для демонстрации закрытия и повторного открытия устьиц во время инвазии Pto в условиях, которые близко имитируют естественное взаимодействие растений и бактерий.

Введение

Устьица представляют собой микроскопические поры, окруженные парой защитных клеток на поверхности листьев и других надземных частей растений. В постоянно меняющихся условиях регулирование устьичного отверстия является центральным для растений, чтобы контролировать поглощение углекислого газа, необходимого для фотосинтеза, за счет потери воды через транспирацию. Таким образом, количественная оценка устьичного отверстия сыграла важную роль в понимании адаптации растений к окружающей среде. Тем не менее, количественная оценка устьичной апертуры по своей сути является трудоемкой и громоздкой, поскольку требует человеческого труда, чтобы обнаружить и измерить устьичные поры на изображении листа, полученном микроскопом. Чтобы обойти эти ограничения, были разработаны различные методы, облегчающие количественную оценку устьичных апертур у Arabidopsis thaliana, модельного растения, широко используемого для изучения биологии устьиц 1,2,3,4,5,6. Например, порометр может быть использован для измерения скорости транспирации в качестве показателя устьичной проводимости. Однако этот метод не дает прямой информации о устьичном числе и апертуре, определяющих устьичную проводимость. В некоторых исследованиях использовались методы конфокальной микроскопии, выделяющие устьичные поры с использованием флуоресцентного актинового маркера, флуоресцентного красителя или автофлуоресценции клеточной стенки 1,2,3,4,5. Несмотря на то, что эти подходы облегчают обнаружение устьиц, затраты как на эксплуатацию установки конфокальной микроскопии, так и на подготовку образцов для микроскопии могут стать препятствием для рутинного применения. В новаторской работе Sai et al. была разработана модель глубокой нейронной сети для автоматического измерения апертуры устьиц по светлопольным микроскопическим изображениям эпидермальных пилингов A. thaliana ⁶. Тем не менее, это новшество не освобождает исследователей от задачи подготовки эпидермального пилинга для микроскопического наблюдения. Недавно это препятствие было преодолено путем разработки портативного устройства визуализации, которое может наблюдать за устьицами, прищипывая лист A. thaliana, вместе с конвейером анализа изображений на основе глубокого обучения, который автоматически измеряет апертуру устьиц по изображениям листьев, полученным устройством⁷.

Устьица способствуют формированию у растений врожденного иммунитета против бактериальных патогенов. Ключом к этому иммунному ответу является закрытие устьиц, которое ограничивает проникновение бактерий через микроскопические поры внутрь листа, где бактериальные патогены размножаются и вызывают заболевания⁸. Смыкание устьиц индуцируется при распознавании микробассоциированных молекулярных паттернов (MAMP), иммуногенных молекул, которые часто являются общими для класса микробов, рецепторами распознавания образов, локализованными на плазматической мембране (PRR)⁹. 22-аминокислотный эпитоп бактериального флагеллина, известный как flg22, является типичным MAMP, который индуцирует закрытие устьиц путем его распознавания PRR FLS2¹⁰. В качестве контрмеры бактериальные патогены, такие как Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 (Pto) и Xanthomonas campestris pv. Везикатории развили механизмы вирулентности для повторного открытия устьиц ^9,11,12. Эти устьичные реакции на бактериальные патогены были традиционно проанализированы в тестах, в которых либо эпидермальная корка листьев, либо листовые диски, либо отделившиеся листья плавают на бактериальной суспензии, а затем устьица наблюдаются под микроскопом с последующим ручным измерением устьичного отверстия. Однако эти анализы громоздки и могут не отражать устьичные реакции на естественную бактериальную инвазию, которая происходит в листе, прикрепленном к растению.

В данной работе представлен простой метод исследования закрытия и открытия устьиц во время инвазии ВОМ в условиях, максимально приближенных к естественному взаимодействию растений и бактерий. В этом методе используется портативное устройство визуализации для непосредственного наблюдения устьиц A. thaliana на листе, прикрепленном к растению, инокулированному Pto, вместе с конвейером анализа изображений для автоматического измерения апертуры устьиц.

протокол

1. Выращивание растений

1. Чтобы выйти из состояния покоя, повторно суспендируйте семена A. thaliana (Col-0) в деионизированной воде и инкубируйте их при 4 °C в течение 4 дней в темноте.
2. Посейте семена на почву и выращивайте в камере, оборудованной белым флуоресцентным светом. Поддерживайте следующие условия роста: температура 22 °C, интенсивность света 6 000 люкс (около 100 мкмоль/^м2/с) в течение 10 часов и относительная влажность воздуха 60%.
3. При необходимости поливайте растения жидким удобрением. Воздержитесь от полива от 1 недели до 2 дней до прививки и хорошо полейте за 1 день до прививки.

2. Подготовка бактериального посевного материала

1. Промыть ПОМ из глицеринового запаса на затвердевшей среде King's B (KB) (20 г триптона, 1,5 г_К2ХПО4 и 15 г глицерина на 1 л, 1,5% агар) с 50 мкг/мл рифампицина и инкубировать при 28 °C в течение 2 дней.
2. Инокулируют одну колонию до 5 мл жидкой среды KB рифампицином в дозе 50 мкг/мл и инкубируют при 28 °C при встряхивании при 200 об/мин до поздней логарифмической фазы роста.
3. Центрифужируют культуру при 6 000 x g в течение 2 мин, выбрасывают надосадочную жидкость и повторно суспендируют гранулы в 1 мл стерильной воды. Повторите этот шаг еще раз.
4. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 1 мл буфера для открытия устьиц (25 мМ MES-KOH pH 6,15, 10 мМ KCl) и измерьте наружный диаметр₆₀₀.
5. Разбавляют суспензию до OD₆₀₀ 0,2 с буфером вскрытия устьиц, содержащим 0,04% силиконового поверхностно-активного вещества.

3. Аэрозольная инокуляция бактерий

1. За 1 день до инокуляции и до конца эксперимента подвергайте растения воздействию света интенсивностью около 10 000 люкс (около 170 мкмоль/^м2/с).
2. Чтобы большинство устьиц были открыты, перед опрыскиванием подержите растения на подносе, накрытом прозрачной крышкой, под светом не менее 3 ч.
3. Снимите крышку и с помощью аэрографа опрыскайте абаксиальную сторону листьев 2,5 мл бактериальной суспензии на три растения в одном горшке.
4. Инкубируйте привитые растения на подносе, накрытом прозрачной крышкой, чтобы поддерживать относительную влажность около 85%.
5. Получают изображения устьиц через 1 ч и 3 ч после распыления с помощью метода, описанного в разделе 4.

4. Непосредственное наблюдение за устьицами с помощью портативного устройства визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Портативное устройство визуализации устьиц оснащено светодиодной подсветкой и модулем камеры и может получать 2 592 × 1 944 (высота × ширина; пиксели) изображения с разрешением около 0,5 мкм/пиксель.

1. Подключите портативное устройство для визуализации устьиц к персональному компьютеру (ПК), оснащенному программным обеспечением для получения изображений.
2. Аккуратно, но полностью удалите капли воды с привитых листьев с помощью листа бумаги.
3. Откройте верхнюю крышку устройства, поместите створку на предметный столик и закройте верхнюю крышку (рис. 1).
4. Отрегулируйте фокус изображения, манипулируя регуляторным винтом, затем нажмите кнопку «Сохранить изображение » на экране ПК. Изображение будет получено мгновенно. Как правило, сфокусированное изображение содержит около 10 устьиц, поддающихся анализу. Чтобы получить надежные результаты, получите изображения устьиц шести листьев трех разных растений (по два листа на растение).

5. Ручное измерение устьичной апертуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение ImageJ можно загрузить по адресу https://imagej.nih.gov/ij/download.html

1. Откройте файл изображения в ImageJ.
2. Откройте диспетчер ROI, выбрав Analyze > Tools > ROI Manager.
3. С помощью инструмента Straight-Line (Прямолинейная линия ) нарисуйте линию, соответствующую ширине стомы (рис. 2), и зарегистрируйте ROI, нажав кнопку Add в ROI Manager.
4. Начертите линию, соответствующую длине той же стомы (рис. 2A), и зарегистрируйте ROI, как описано в шаге 5.3.
5. Нажмите кнопку Измерить в диспетчере окупаемости инвестиций, чтобы измерить ширину и длину.
6. Разделите ширину на длину, чтобы получить устьичную апертуру (соотношение). Для надежного количественного определения используйте 60 или более устьиц для каждого периода лечения и времени. Не следует выбирать для анализа преждевременные или неясные устьица (рис. 2Б, В).

6. Автоматизированное измерение устьичного отверстия

ПРИМЕЧАНИЕ: Конвейер анализа изображений выполняется в Google Colaboratory, облачной исполняемой среде на языке программирования Python. Пользователи должны иметь действующую учетную запись Google с работающим Google Диском, браузером Google Chrome и стабильным подключением к Интернету в качестве обязательного требования.

1. Загрузите блокнот Google Colaboratory с сайта Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) и откройте записную книжку.
2. Создайте локальную копию записной книжки на Google Диске, выбрав Файл > Сохранить копию на Диске. После того, как появится новая вкладка, безопасно закройте вкладку исходной записной книжки.
3. Нажмите кнопку «Выполнить » один раз под разделом «Настройка среды » в блокноте, не разворачивая блоки ячеек, чтобы импортировать необходимые библиотеки.
4. Выполните раздел Настройки каталога , чтобы создать три папки, используемые для анализа (например, example_result, inference_results и модель) на Google Диске.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае папки с именами example_result, inference_results и model используются в качестве родительского каталога, в котором хранятся результаты вывода и обученные модели соответственно. В этой записной книжке показан пример построения каталога в качестве репрезентативной процедуры. Чтобы изменить имя, перепишите путь pardir, infdir или modeldir .
5. В соответствии с разделом «Подготовка изображений » переместите полученные изображения в example_result, сгруппированные в названиях изображений по обработке или образцу (например, mock_1h_XXXXXX.jpg) для окончательной генерации графика. Примеры изображений доступны на сайте Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
6. Выполните часть Скачать обученные модели , чтобы скачать файлы ONNX обученных моделей из Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) и поместить их в каталог моделей .
7. Запустите часть Вывод и измерение устьичной апертуры , чтобы количественно оценить устьичную апертуру по отдельным изображениям. Результирующие изображения с наложенным выводом и csv-файл с именем example_result.csv будут экспортированы в каталог inference_results.
8. Выполните раздел Создание графика , чтобы создать график о апертуре устьиц, экспортированный в каталог inference_results .

Результаты

После распылительной инокуляции Pto устьица на листьях, прикрепленных к инокулированным растениям, непосредственно наблюдались с помощью портативного устройства визуализации устьиц. Используя ручные и автоматизированные измерения, одни и те же изображения листьев были использо?...

Обсуждение

В предыдущих исследованиях использовали эпидермальные корки, листовые диски или отделившиеся листья для изучения устьичных реакций на бактериальные инвазии ^9,11,12. В отличие от этого, метод, предложенный в этом исследовании, использует...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron