Прямое наблюдение и автоматизированное измерение ответов устьиц на синегнойную палочку pv. помидор DC3000 в Arabidopsis thaliana

Резюме

Здесь мы представляем простой метод прямого наблюдения и автоматизированного измерения устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana. В этом методе используется портативное устройство визуализации устьиц вместе с конвейером анализа изображений, предназначенным для изображений листьев, полученных устройством.

Аннотация

Устьица – это микроскопические поры, находящиеся в эпидермисе листьев растений. Регуляция устьичной апертуры имеет решающее значение не только для балансировки поглощения углекислого газа для фотосинтеза и транспирационной потери воды, но и для ограничения бактериальной инвазии. В то время как растения закрывают устьица при распознавании микробов, патогенные бактерии, такие как Pseudomonas syringae pv. помидор DC3000 (PTO), снова откройте закрытые устьица, чтобы получить доступ к внутренней части листа. В традиционных анализах для оценки реакции устьиц на бактериальную инвазию эпидермальные оболочки листьев, листовые диски или отделившиеся листья плавают на бактериальной суспензии, а затем устьица наблюдают под микроскопом с последующим ручным измерением устьичного отверстия. Однако эти анализы громоздки и могут не отражать устьичные реакции на естественную бактериальную инвазию в листе, прикрепленном к растению. Недавно было разработано портативное устройство визуализации, которое может наблюдать за устьицами, прищипывая лист, не отрывая его от растения, вместе с конвейером анализа изображений на основе глубокого обучения, предназначенным для автоматического измерения апертуры устьиц по изображениям листьев, полученным устройством. Здесь, основываясь на этих технических достижениях, представлен новый метод оценки устьичных реакций на бактериальную инвазию у Arabidopsis thaliana . Этот метод состоит из трех простых этапов: распылительная инокуляция Pto , имитирующая естественные инфекционные процессы, непосредственное наблюдение устьиц на листе растения, инокулированного Pto, с помощью портативного устройства визуализации и автоматизированное измерение апертуры устьиц с помощью конвейера анализа изображений. Этот метод был успешно использован для демонстрации закрытия и повторного открытия устьиц во время инвазии Pto в условиях, которые близко имитируют естественное взаимодействие растений и бактерий.

Введение

Устьица представляют собой микроскопические поры, окруженные парой защитных клеток на поверхности листьев и других надземных частей растений. В постоянно меняющихся условиях регулирование устьичного отверстия является центральным для растений, чтобы контролировать поглощение углекислого газа, необходимого для фотосинтеза, за счет потери воды через транспирацию. Таким образом, количественная оценка устьичного отверстия сыграла важную роль в понимании адаптации растений к окружающей среде. Тем не менее, количественная оценка устьичной апертуры по своей сути является трудоемкой и громоздкой, поскольку требует человеческого труда, чтобы обнаружить и измерить устьичные пор....

протокол

1. Выращивание растений

1. Чтобы выйти из состояния покоя, повторно суспендируйте семена A. thaliana (Col-0) в деионизированной воде и инкубируйте их при 4 °C в течение 4 дней в темноте.
2. Посейте семена на почву и выращивайте в камере, оборудованной белым флуоресцентным светом. Поддерживайте следующие условия роста: температура 22 °C, интенсивность света 6 000 люкс (около 100 мкмоль/^м2/с) в течение 10 часов и относительная влажность воздуха 60%.
3. При необходимости поливайте растения жидким удобрением. Воздержитесь от полива от 1 недели до 2 дней до прививки и хорошо полейте за 1 день до прививки.

....

Результаты

После распылительной инокуляции Pto устьица на листьях, прикрепленных к инокулированным растениям, непосредственно наблюдались с помощью портативного устройства визуализации устьиц. Используя ручные и автоматизированные измерения, одни и те же изображения листьев были использо?.......

Обсуждение

В предыдущих исследованиях использовали эпидермальные корки, листовые диски или отделившиеся листья для изучения устьичных реакций на бактериальные инвазии ^9,11,12. В отличие от этого, метод, предложенный в этом исследовании, использует.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron