Direkte Beobachtung und automatisierte Messung der stomatalen Reaktionen auf Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 in Arabidopsis thaliana

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine einfache Methode zur direkten Beobachtung und automatisierten Messung der stomatären Reaktionen auf bakterielle Invasion in Arabidopsis thaliana vor. Diese Methode nutzt ein tragbares stomatales Bildgebungsgerät zusammen mit einer Bildanalyse-Pipeline, die für vom Gerät aufgenommene Blattbilder ausgelegt ist.

Zusammenfassung

Spaltöffnungen sind mikroskopisch kleine Poren in der Epidermis der Pflanzenblätter. Die Regulierung der stomatalen Öffnung ist nicht nur für den Ausgleich der Kohlendioxidaufnahme für die Photosynthese und den transpirativen Wasserverlust von entscheidender Bedeutung, sondern auch für die Begrenzung der bakteriellen Invasion. Während Pflanzen bei der Erkennung von Mikroben Spaltöffnungen schließen, können pathogene Bakterien wie Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 (Zapfwelle), öffnen Sie die geschlossenen Spaltöffnungen wieder, um Zugang zum Flügelinneren zu erhalten. Bei herkömmlichen Assays zur Beurteilung der Stomatareaktionen auf eine bakterielle Invasion werden Blattepidermisschalen, Blattscheiben oder abgelöste Blätter auf Bakteriensuspension geschwommen, und dann werden die Spaltöffnungen unter einem Mikroskop beobachtet, gefolgt von einer manuellen Messung der Stomataöffnung. Diese Assays sind jedoch umständlich und spiegeln möglicherweise nicht die stomatalen Reaktionen auf die natürliche bakterielle Invasion in einem an der Pflanze befestigten Blatt wider. Kürzlich wurde ein tragbares Bildgebungsgerät entwickelt, das Stomata beobachten kann, indem es ein Blatt einklemmt, ohne es von der Pflanze zu lösen, zusammen mit einer Deep-Learning-basierten Bildanalyse-Pipeline, die entwickelt wurde, um die Stomataöffnung aus den vom Gerät aufgenommenen Blattbildern automatisch zu messen. Aufbauend auf diesen technischen Fortschritten wird hier eine neue Methode zur Bewertung der stomatären Reaktionen auf die bakterielle Invasion in Arabidopsis thaliana vorgestellt. Diese Methode besteht aus drei einfachen Schritten: Sprühinokulation von Pto, die natürliche Infektionsprozesse nachahmt, direkte Beobachtung von Spaltöffnungen auf einem Blatt der Pto-inokulierten Pflanze mit dem tragbaren Bildgebungsgerät und automatisierte Messung der Stomataöffnung durch die Bildanalysepipeline. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um den Verschluss und die Wiedereröffnung von Stomata während der Zapfwelleninvasion unter Bedingungen zu demonstrieren, die die natürliche Pflanzen-Bakterien-Interaktion genau nachahmen.

Einleitung

Spaltöffnungen sind mikroskopisch kleine Poren, die von einem Paar Schließzellen auf der Oberfläche von Blättern und anderen oberirdischen Pflanzenteilen umgeben sind. In sich ständig verändernden Umgebungen ist die Regulierung der Stomataöffnung für Pflanzen von zentraler Bedeutung, um die für die Photosynthese erforderliche Kohlendioxidaufnahme auf Kosten des Wasserverlusts durch Transpiration zu steuern. Daher war die Quantifizierung der Stomataöffnung entscheidend für das Verständnis der Anpassung an die Pflanzenumwelt. Die Quantifizierung der Stomataöffnung ist jedoch von Natur aus zeitaufwändig und umständlich, da menschliche Arbeit erforderlich ist, um Stomataporen in einem Blattbild zu erkennen und zu messen, das mit einem Mikroskop aufgenommen wurde. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Quantifizierung der Stomataöffnung in Arabidopsis thaliana zu erleichtern, einer Modellpflanze, die häufig zur Untersuchung der Stomatabiologie verwendet wird ^1,2,3,4,5,6. Beispielsweise kann ein Porometer verwendet werden, um die Transpirationsrate als Metrik für die stomatäre Leitfähigkeit zu messen. Diese Methode liefert jedoch keine direkten Informationen über die Stomatazahl und die Öffnung, die den stomatären Leitwert bestimmen. In einigen Studien wurden konfokale Mikroskopietechniken verwendet, bei denen Stomataporen mit einem fluoreszierenden Aktinmarker, einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer Zellwandautofluoreszenz ^{hervorgehoben wurden} 1,2,3,4,5. Während diese Ansätze den Nachweis von Spaltöffnungen erleichtern, können die Kosten sowohl für den Betrieb einer konfokalen Mikroskopieanlage als auch für die Vorbereitung von Mikroskopieproben ein Hindernis für die Routineanwendung darstellen. In einer bahnbrechenden Arbeit von Sai et al. wurde ein tiefes neuronales Netzwerkmodell entwickelt, um die stomatale Öffnung aus hellfeldmikroskopischen Bildern von A. thaliana-Epidermisschalen automatisch zu messen⁶. Diese Innovation entbindet die Forscher jedoch nicht von der Aufgabe, ein epidermales Peeling für die mikroskopische Beobachtung vorzubereiten. Kürzlich wurde dieses Hindernis durch die Entwicklung eines tragbaren Bildgebungsgeräts überwunden, das Stomata durch Einklemmen eines Blattes von A. thaliana beobachten kann, zusammen mit einer Deep-Learning-basierten Bildanalyse-Pipeline, die automatisch die Stomataöffnung aus Blattbildern misst, die mit dem Gerät aufgenommen wurden⁷.

Spaltöffnungen tragen zur angeborenen Immunität der Pflanze gegen bakterielle Krankheitserreger bei. Der Schlüssel zu dieser Immunantwort ist der Stomataverschluss, der den Eintritt von Bakterien durch die mikroskopisch kleine Pore in das Blattinnere einschränkt, wo sich bakterielle Krankheitserreger vermehren und Krankheiten verursachen⁸. Der Stomataverschluss wird bei der Erkennung von mikrobenassoziierten molekularen Mustern (MAMPs), immunogenen Molekülen, die häufig einer Klasse von Mikroben gemeinsam sind, durch Plasmamembran-lokalisierte Mustererkennungsrezeptoren (PRRs⁾ induziert9. Ein 22-Aminosäuren-Epitop des bakteriellen Flagellins, bekannt als flg22, ist ein typisches MAMP, das durch seine Erkennung durch das PRR FLS2¹⁰ einen Stomataverschluss induziert. Als Gegenmaßnahme können bakterielle Krankheitserreger wie Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 (Zapfwelle) und Xanthomonas campestris pv. Vesitorien haben Virulenzmechanismen entwickelt, um Stomata wieder zu öffnen ^9,11,12. Diese stomatalen Reaktionen auf bakterielle Krankheitserreger wurden konventionell in Assays analysiert, bei denen entweder epidermale Blattschalen, Blattscheiben oder abgelöste Blätter auf der Bakteriensuspension schwimmen und dann die Spaltöffnungen unter einem Mikroskop beobachtet werden, gefolgt von einer manuellen Messung der Stomataöffnung. Diese Assays sind jedoch umständlich und spiegeln möglicherweise nicht die stomatalen Reaktionen auf die natürliche bakterielle Invasion wider, die in einem an der Pflanze befestigten Blatt auftreten.

Hier wird eine einfache Methode vorgestellt, um den Verschluss und die Wiedereröffnung von Stomata während der Zapfwelleninvasion unter Bedingungen zu untersuchen, die die natürliche Pflanzen-Bakterien-Interaktion genau nachahmen. Diese Methode nutzt das tragbare Bildgebungsgerät für die direkte Beobachtung von A. thaliana-Stomata auf einem Blatt, das an der mit Pto inokulierten Pflanze befestigt ist, zusammen mit der Bildanalyse-Pipeline zur automatisierten Messung der Stomata-Öffnung.

Protokoll

1. Pflanzen anbauen

1. Um die Ruhephase zu unterbrechen, suspendieren Sie die Samen von A. thaliana (Col-0) in deionisiertem Wasser und inkubieren Sie sie 4 Tage lang bei 4 °C im Dunkeln.
2. Säen Sie die Samen in die Erde und wachsen Sie in einer Kammer, die mit weißem Leuchtstoffröhrenlicht ausgestattet ist. Halten Sie folgende Wachstumsbedingungen aufrecht: Temperatur von 22 °C, Lichtintensität von 6.000 Lux (ca. 100 μmol/m²/s) für 10 h und relative Luftfeuchtigkeit von 60%.
3. Gießen Sie die Pflanzen bei Bedarf mit einem Flüssigdünger. Von 1 Woche bis 2 Tage vor der Impfung nicht gießen und 1 Tag vor der Impfung gut gießen.

2. Bakterielles Inokulum vorbereiten

1. Streifen Sie Zapfen aus Glycerin-Stamm auf erstarrtem King's B (KB)-Medium (20 g Trypton, 1,5 g K₂HPO₄ und 15 g Glycerin für 1 l, 1,5 % Agar) mit 50 μg/ml Rifampicin und inkubieren Sie 2 Tage lang bei 28 °C.
2. Eine einzelne Kolonie mit 5 ml KB-Flüssigmedium mit 50 μg/ml Rifampicin beimpfen und bei 28 °C mit Schütteln bei 200 U/min bis zur späten logarithmischen Wachstumsphase inkubieren.
3. Zentrifugieren Sie die Kultur 2 Minuten lang bei 6.000 x g , entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml sterilem Wasser. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
4. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Stomata-Öffnungspuffer (25 mM MES-KOH PH 6,15, 10 mM KCl) und messen Sie den OD₆₀₀.
5. Verdünnen Sie die Suspension auf OD₆₀₀ 0,2 mit einem Spaltöffnungspuffer mit 0,04 % Silikontensid.

3. Sprühimpfung von Bakterien

1. Von 1 Tag vor der Inokulation bis zum Ende des Versuchs werden die Pflanzen einer Lichtintensität von ca. 10.000 Lux (ca. 170 μmol/m²/s) ausgesetzt.
2. Um sicherzustellen, dass die meisten Spaltöffnungen offen sind, bewahren Sie die Pflanzen vor der Sprühimpfung mindestens 3 h lang auf einer mit einem transparenten Deckel abgedeckten Schale unter dem Licht auf.
3. Nehmen Sie den Deckel ab und besprühen Sie mit einer Airbrush die abaxiale Seite der Blätter mit 2,5 ml Bakteriensuspension pro drei Pflanzen auf einem einzigen Topf.
4. Inkubieren Sie die inokulierten Pflanzen auf einer Schale, die mit einem transparenten Deckel bedeckt ist, um eine relative Luftfeuchtigkeit von etwa 85% aufrechtzuerhalten.
5. Erfassen Sie Bilder der Spaltöffnungen 1 h und 3 h nach der Sprühimpfung mit der in Abschnitt 4 beschriebenen Methode.

4. Direkte Beobachtung der Spaltöffnungen mit dem tragbaren Bildgebungsgerät

HINWEIS: Das tragbare Stomata-Bildgebungsgerät ist mit einer LED-Leuchte und einem Kameramodul ausgestattet und kann 2.592 × 1.944 (Höhe × Breite; Pixel) Bilder mit einer Auflösung von ca. 0,5 μm/Pixel aufnehmen.

1. Schließen Sie das tragbare stomatale Bildgebungsgerät an einen PC an, der mit einer Bilderfassungssoftware ausgestattet ist.
2. Entfernen Sie vorsichtig aber vollständig Wassertropfen von den beimpften Blättern mit einem Stück Papier.
3. Öffnen Sie die obere Abdeckung des Geräts, legen Sie das Blatt auf die Bühne, und schließen Sie die obere Abdeckung (Abbildung 1).
4. Stellen Sie den Fokus des Bildes ein, indem Sie die Einstellschraube betätigen, und klicken Sie dann auf der Schaltfläche Bild speichern auf dem PC-Bildschirm. Das Bild wird sofort erfasst. Typischerweise enthält ein fokussiertes Bild etwa 10 analysierbare Spaltöffnungen. Um robuste Ergebnisse zu erhalten, nehmen Sie Stomatabilder von sechs Blättern von drei verschiedenen Pflanzen auf (zwei Blätter pro Pflanze).

5. Manuelle Messung der Stomataöffnung

HINWEIS: Die ImageJ-Software kann unter heruntergeladen werden https://imagej.nih.gov/ij/download.html

1. Öffnen Sie eine Bilddatei im ImageJ.
2. Öffnen Sie den ROI-Manager, indem Sie > Tools analysieren > ROI-Manager auswählen.
3. Zeichnen Sie mit dem Auswahlwerkzeug "Geradlinig" eine Linie, die der Breite eines Stomas entspricht (Abbildung 2), und registrieren Sie den ROI, indem Sie im ROI-Manager auf "Hinzufügen" klicken.
4. Zeichnen Sie eine Linie, die der Länge desselben Stomas entspricht (Abbildung 2A), und registrieren Sie den ROI wie in Schritt 5.3 beschrieben.
5. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen, um die Breite und Länge zu messen.
6. Teilen Sie die Breite durch die Länge, um die Stomataöffnung (Verhältnis) zu erhalten. Verwenden Sie für eine robuste Quantifizierung 60 oder mehr Stomata für jede Behandlung und jeden Zeitpunkt. Wählen Sie keine vorzeitigen oder obskuren Spaltöffnungen für die Analyse (Abbildung 2B, C).

6. Automatisierte Messung der Stomataöffnung

HINWEIS: Die Bildanalyse-Pipeline wird in Google Colaboratory ausgeführt, einer ausführbaren Cloud-Umgebung für die Programmiersprache Python. Benutzer müssen über ein gültiges Google-Konto mit einem funktionierenden Google Drive- und Google Chrome-Browser und eine stabile Internetverbindung verfügen.

1. Laden Sie das Google Colaboratory-Notebook von Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) herunter und öffnen Sie das Notebook.
2. Erstellen Sie eine lokale Kopie des Notizbuchs in Google Drive, indem Sie Datei > Kopie in Drive speichern auswählen. Nachdem eine neue Registerkarte angezeigt wird, schließen Sie die Registerkarte des ursprünglichen Notizbuchs sicher.
3. Drücken Sie die Schaltfläche Ausführen einmal unter dem Abschnitt Umgebungseinstellungen im Notebook, ohne die Zellenblöcke zu öffnen, um die erforderlichen Bibliotheken zu importieren.
4. Führen Sie den Abschnitt Verzeichniseinstellungen aus, um drei Ordner zu erstellen, die für die Analyse verwendet werden (z. B. example_result, inference_results und Modell) in Google Drive.
   HINWEIS: In diesem Fall werden die Ordner example_result, inference_results und model als übergeordnetes Verzeichnis verwendet, in dem Rückschlussergebnisse bzw. trainierte Modelle gespeichert werden. Dieses Notizbuch zeigt ein Beispiel für die Verzeichniskonstruktion als repräsentative Prozedur. Um den Namen zu ändern, schreiben Sie den Pardir-, Infdir- oder Modeldir-Pfad neu.
5. Verschieben Sie die aufgenommenen Bilder gemäß dem Abschnitt Vorbereitung der Bilder nach example_result, gruppiert in Bildtiteln nach Behandlung oder Probe (z. B. mock_1h_XXXXXX.jpg) für die endgültige Diagrammerstellung. Beispielbilder sind bei Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) erhältlich.
6. Führen Sie den Teil Trainierte Modelle herunterladen aus, um die ONNX-Dateien der trainierten Modelle von Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) herunterzuladen und im Modellverzeichnis abzulegen.
7. Führen Sie den Teil Inferenz und Messung der Stomata-Apertur aus, um die Stomata-Apertur aus einzelnen Bildern zu quantifizieren. Die Ergebnisbilder mit überlagerter Inferenz und die CSV-Datei mit dem Namen example_result.csv werden in das inference_results Verzeichnis exportiert.
8. Führen Sie den Abschnitt Diagrammgenerierung aus, um ein Diagramm über das stomatale Öffnungsverhältnis zu erstellen, das in das Verzeichnis inference_results exportiert wird.

Ergebnisse

Nach der Sprühinokulation von Pto wurden Stomata auf Blättern, die an den inokulierten Pflanzen befestigt waren, direkt mit dem tragbaren stomatalen Bildgebungsgerät beobachtet. Unter Verwendung manueller und automatisierter Messungen wurden dieselben Blattbilder verwendet, um die Stomataöffnung zu berechnen, indem das Verhältnis von Breite zu Länge von etwa 60 Spaltöffnungen genommen wurde. Manuelle und automatisierte Messungen zeigten durchweg eine Abnahme der Stomataöffnung bei Pto-geimpften Pflanzen ...

Diskussion

Frühere Studien verwendeten epidermale Schalen, Blattscheiben oder abgelöste Blätter, um stomatale Reaktionen auf bakterielle Invasionen zu untersuchen ^9,11,12. Im Gegensatz dazu nutzt die in dieser Studie vorgeschlagene Methode das tragbare stomatale Bildgebungsgerät, um Stomata auf einem an der Pflanze befestigten Blatt nach der Sprühimpfung von Pto direkt zu beobachten und die natürlichen Bedingungen der bakter...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron