Direkte Beobachtung und automatisierte Messung der stomatalen Reaktionen auf Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 in Arabidopsis thaliana

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine einfache Methode zur direkten Beobachtung und automatisierten Messung der stomatären Reaktionen auf bakterielle Invasion in Arabidopsis thaliana vor. Diese Methode nutzt ein tragbares stomatales Bildgebungsgerät zusammen mit einer Bildanalyse-Pipeline, die für vom Gerät aufgenommene Blattbilder ausgelegt ist.

Zusammenfassung

Spaltöffnungen sind mikroskopisch kleine Poren in der Epidermis der Pflanzenblätter. Die Regulierung der stomatalen Öffnung ist nicht nur für den Ausgleich der Kohlendioxidaufnahme für die Photosynthese und den transpirativen Wasserverlust von entscheidender Bedeutung, sondern auch für die Begrenzung der bakteriellen Invasion. Während Pflanzen bei der Erkennung von Mikroben Spaltöffnungen schließen, können pathogene Bakterien wie Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 (Zapfwelle), öffnen Sie die geschlossenen Spaltöffnungen wieder, um Zugang zum Flügelinneren zu erhalten. Bei herkömmlichen Assays zur Beurteilung der Stomatareaktionen auf eine bakterielle Invasion werden Blattepidermisschalen, Blattscheiben oder abgelöste Blätter auf Bakteriensuspension geschwommen, und dann werden die Spaltöffnungen unter einem Mikroskop beobachtet, gefolgt von einer manuellen Messung der Stomataöffnung. Diese Assays sind jedoch umständlich und spiegeln möglicherweise nicht die stomatalen Reaktionen auf die natürliche bakterielle Invasion in einem an der Pflanze befestigten Blatt wider. Kürzlich wurde ein tragbares Bildgebungsgerät entwickelt, das Stomata beobachten kann, indem es ein Blatt einklemmt, ohne es von der Pflanze zu lösen, zusammen mit einer Deep-Learning-basierten Bildanalyse-Pipeline, die entwickelt wurde, um die Stomataöffnung aus den vom Gerät aufgenommenen Blattbildern automatisch zu messen. Aufbauend auf diesen technischen Fortschritten wird hier eine neue Methode zur Bewertung der stomatären Reaktionen auf die bakterielle Invasion in Arabidopsis thaliana vorgestellt. Diese Methode besteht aus drei einfachen Schritten: Sprühinokulation von Pto, die natürliche Infektionsprozesse nachahmt, direkte Beobachtung von Spaltöffnungen auf einem Blatt der Pto-inokulierten Pflanze mit dem tragbaren Bildgebungsgerät und automatisierte Messung der Stomataöffnung durch die Bildanalysepipeline. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um den Verschluss und die Wiedereröffnung von Stomata während der Zapfwelleninvasion unter Bedingungen zu demonstrieren, die die natürliche Pflanzen-Bakterien-Interaktion genau nachahmen.

Einleitung

Spaltöffnungen sind mikroskopisch kleine Poren, die von einem Paar Schließzellen auf der Oberfläche von Blättern und anderen oberirdischen Pflanzenteilen umgeben sind. In sich ständig verändernden Umgebungen ist die Regulierung der Stomataöffnung für Pflanzen von zentraler Bedeutung, um die für die Photosynthese erforderliche Kohlendioxidaufnahme auf Kosten des Wasserverlusts durch Transpiration zu steuern. Daher war die Quantifizierung der Stomataöffnung entscheidend für das Verständnis der Anpassung an die Pflanzenumwelt. Die Quantifizierung der Stomataöffnung ist jedoch von Natur aus zeitaufwändig und umständlich, da menschliche Arbeit erforderlich ist, um Stomatap....

Protokoll

1. Pflanzen anbauen

1. Um die Ruhephase zu unterbrechen, suspendieren Sie die Samen von A. thaliana (Col-0) in deionisiertem Wasser und inkubieren Sie sie 4 Tage lang bei 4 °C im Dunkeln.
2. Säen Sie die Samen in die Erde und wachsen Sie in einer Kammer, die mit weißem Leuchtstoffröhrenlicht ausgestattet ist. Halten Sie folgende Wachstumsbedingungen aufrecht: Temperatur von 22 °C, Lichtintensität von 6.000 Lux (ca. 100 μmol/m²/s) für 10 h und relative Luftfeuchtigkeit von 60%.
3. Gießen Sie die Pflanzen bei Bedarf mit einem Flüssigdünger. Von 1 Woche bis 2 Tage vor der Impfung nicht gießen und 1 Tag vor der Imp....

Diskussion

Frühere Studien verwendeten epidermale Schalen, Blattscheiben oder abgelöste Blätter, um stomatale Reaktionen auf bakterielle Invasionen zu untersuchen ^9,11,12. Im Gegensatz dazu nutzt die in dieser Studie vorgeschlagene Methode das tragbare stomatale Bildgebungsgerät, um Stomata auf einem an der Pflanze befestigten Blatt nach der Sprühimpfung von Pto direkt zu beobachten und die natürlichen Bedingungen der bakter.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron