الحصول على عمليات تجميد عالية الجودة لعين الأرنب الكاملة

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة للحصول على عمليات تجميد عالية الجودة لعيون الأرانب الكاملة. إنه يفصل تشريح عين الأرنب ، والتثبيت ، والتضمين ، وإجراءات التقسيم ، والتي يمكن تكييفها بسهولة لاستخدامها في أي دراسة تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية في عيون أكبر.

Abstract

يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على عمليات تجميد شبكية عالية الجودة في الكبيرة ، مثل الأرانب. بعد الاستئصال ، تغمر العين لفترة وجيزة في المثبت. بعد ذلك ، تتم إزالة القرنية والقزحية وتترك العين طوال الليل لتثبيت إضافي عند 4 درجات مئوية. بعد التثبيت ، تتم إزالة العدسة. ثم توضع العين في cryomold وتملأ بوسط التضمين. عن طريق إزالة العدسة ، يتمتع وسيط التضمين بوصول أفضل إلى الجسم الزجاجي ويؤدي إلى استقرار أفضل للشبكية. الأهم من ذلك ، يجب تحضين العين في وسط التضمين طوال الليل للسماح بالتسلل الكامل في جميع أنحاء الجسم الزجاجي. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يتم تجميد العين على الثلج الجاف وتقسيمها. يمكن الحصول على أقسام شبكية كاملة لاستخدامها في الكيمياء الهيستولوجية المناعية. يمكن استخدام بروتوكولات التلوين القياسية لدراسة توطين المستضدات داخل أنسجة الشبكية. يؤدي الالتزام بهذا البروتوكول إلى عمليات تجميد شبكية عالية الجودة يمكن استخدامها في أي تجربة تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية.

Introduction

تتكون شبكية العين من عدة طبقات من الخلايا المتخصصة داخل العين التي تعمل معا على تحويل الضوء إلى إشارات عصبية. نظرا لأن شبكية العين تلعب دورا مهما في الرؤية ، فإن فهم هيكلها ووظيفتها يمكن أن يوفر رؤى قيمة لبعض الأسباب الأكثر شيوعا لفقدان البصر مثل الضمور البقعي واعتلال الشبكية السكري ، من بين أمور أخرى.

تعمل الأرانب كنموذج حيواني مناسب في أبحاث الشبكية لأنها توفر العديد من المزايا مقارنة بالنماذج الأخرى. عيون الأرنب متشابهة نسبيا في علم التشريح مع عيون الإنسان ^1,2. على سبيل المثال ، الأرانب لديها مساحة من كثافة مستقبلات الضوء المتزايدة ، والمعروفة باسم الخط البصري الأفقي ، والتي تشبه....

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة جنوب كاليفورنيا. تم استخدام أربعة عشر (ن = 14) أرنب هولندي أحزمة تتراوح أعمارهم بين 4 و 6 أشهر في تطوير هذا البروتوكول. تم استخدام كل من من الذكور والإناث. تزن جميع ما بين 2.0 و 2.5 كجم. تم إيواء جميع بشكل فردي. يمكن العثور على قائمة بالمواد والمعدات الموصى بها في جدول المواد.

1. التحضير

1. إعداد المثبت.
   1. تحضير 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). كحد أدنى ، مطلوب 50 مل من المثبت لكل عين.
2. إعداد عامل الحماية بالتبريد.
   1. تحضير 30٪ من الوزن من حيث الح....

النتائج

بعد معالجة الأنسجة ، يمكن استخدام بروتوكول التألق المناعي القياسي للتحقيق في أي عدد من العمليات البيولوجية داخل شبكية العين. يوضح الشكل 3A-C صورا مضان تمثيلية لقسم شبكية تم الحصول عليه عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. تم تلطيخ قسم الشبكية بالمناعة وفقا ل?.......

Discussion

قبل تنفيذ البروتوكول أعلاه ، واجهنا باستمرار صعوبات في معالجة أنسجة عيون الأرانب للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية. لقد قمنا بتكييف العديد من البروتوكولات من عيون الصغيرة مثل الفئران ، لكننا وجدنا أنها تؤدي إلى عدم كفاية التثبيت وصعوبة تقسيم الأنسجة. هناك العديد من الاعتبارات المهمة ا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)