الحصول على عمليات تجميد عالية الجودة لعين الأرنب الكاملة

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة للحصول على عمليات تجميد عالية الجودة لعيون الأرانب الكاملة. إنه يفصل تشريح عين الأرنب ، والتثبيت ، والتضمين ، وإجراءات التقسيم ، والتي يمكن تكييفها بسهولة لاستخدامها في أي دراسة تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية في عيون أكبر.

Abstract

يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على عمليات تجميد شبكية عالية الجودة في الكبيرة ، مثل الأرانب. بعد الاستئصال ، تغمر العين لفترة وجيزة في المثبت. بعد ذلك ، تتم إزالة القرنية والقزحية وتترك العين طوال الليل لتثبيت إضافي عند 4 درجات مئوية. بعد التثبيت ، تتم إزالة العدسة. ثم توضع العين في cryomold وتملأ بوسط التضمين. عن طريق إزالة العدسة ، يتمتع وسيط التضمين بوصول أفضل إلى الجسم الزجاجي ويؤدي إلى استقرار أفضل للشبكية. الأهم من ذلك ، يجب تحضين العين في وسط التضمين طوال الليل للسماح بالتسلل الكامل في جميع أنحاء الجسم الزجاجي. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يتم تجميد العين على الثلج الجاف وتقسيمها. يمكن الحصول على أقسام شبكية كاملة لاستخدامها في الكيمياء الهيستولوجية المناعية. يمكن استخدام بروتوكولات التلوين القياسية لدراسة توطين المستضدات داخل أنسجة الشبكية. يؤدي الالتزام بهذا البروتوكول إلى عمليات تجميد شبكية عالية الجودة يمكن استخدامها في أي تجربة تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية.

Introduction

تتكون شبكية العين من عدة طبقات من الخلايا المتخصصة داخل العين التي تعمل معا على تحويل الضوء إلى إشارات عصبية. نظرا لأن شبكية العين تلعب دورا مهما في الرؤية ، فإن فهم هيكلها ووظيفتها يمكن أن يوفر رؤى قيمة لبعض الأسباب الأكثر شيوعا لفقدان البصر مثل الضمور البقعي واعتلال الشبكية السكري ، من بين أمور أخرى.

تعمل الأرانب كنموذج حيواني مناسب في أبحاث الشبكية لأنها توفر العديد من المزايا مقارنة بالنماذج الأخرى. عيون الأرنب متشابهة نسبيا في علم التشريح مع عيون الإنسان ^1,2. على سبيل المثال ، الأرانب لديها مساحة من كثافة مستقبلات الضوء المتزايدة ، والمعروفة باسم الخط البصري الأفقي ، والتي تشبه النقرة في البشر. النماذج الحيوانية الأخرى شائعة الاستخدام ، مثل القوارض ، ليس لها مكافئ تشريحي. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع القوارض ، فإن الأوعية الدموية في شبكية العين في الأرانب تشبه إلى حد ما تلك الموجودة في البشر. عيون الأرنب كبيرة نسبيا أيضا. هذا يجعلها مناسبة بشكل خاص للدراسات التي تنطوي على إعطاء الدواء أو التدخل الجراحي داخل الجسم الزجاجي أو شبكية العين التي قد تكون صعبة أو مستحيلة في عين أصغر³.

الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة توطين المستضدات داخل الأنسجة ولها تطبيقات واسعة في أبحاث الشبكية^4،5،6. نظرا لأن شبكية العين عبارة عن بنية دقيقة ، فإن الحصول على نتائج مفيدة عبر IHC يتطلب معالجة دقيقة للأنسجة. يحدث انفصال الشبكية وقطع الأنسجة الأخرى مثل فواصل الشبكية أو طياتها بشكل شائع أثناء المعالجة وقد تتداخل مع تفسير النتائج. تعتمد المعالجة الناجحة على مجموعة متنوعة من العوامل ، بما في ذلك معالجة الأنسجة ، ونوع التثبيت ومدته ، ونوع وسائط التضمين ، وتقنيات التقسيم^7،8،9،10. على الرغم من مزايا استخدام الأرانب كنموذج حيواني في أبحاث الشبكية ، يوجد عدد قليل جدا من البروتوكولات التي تصف المعالجة الناجحة لأنسجة شبكية العين. تصف هذه الورقة طريقة موثوقة للحصول على أقسام شبكية عالية الجودة من عيون الأرنب الكاملة لاستخدامها في IHC.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة جنوب كاليفورنيا. تم استخدام أربعة عشر (ن = 14) أرنب هولندي أحزمة تتراوح أعمارهم بين 4 و 6 أشهر في تطوير هذا البروتوكول. تم استخدام كل من من الذكور والإناث. تزن جميع ما بين 2.0 و 2.5 كجم. تم إيواء جميع بشكل فردي. يمكن العثور على قائمة بالمواد والمعدات الموصى بها في جدول المواد.

1. التحضير

1. إعداد المثبت.
   1. تحضير 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). كحد أدنى ، مطلوب 50 مل من المثبت لكل عين.
2. إعداد عامل الحماية بالتبريد.
   1. تحضير 30٪ من الوزن من حيث الحجم (وزن / حجم) السكروز في برنامج تلفزيوني. ضعه على شاكر لمدة 15 دقيقة على الأقل للتأكد من إذابة السكروز تماما. كحد أدنى ، مطلوب 50 مل من عامل الحماية من البرد لكل عين.
3. إعداد أداة تشريح.
   1. اجمع زوجين من الملقط ، ومقصا واحدا من المقص المنحني ، وشفرة مشرط واحدة ، وطبق تشريح 100 مم وضعه بالقرب من مجهر التشريح. يظهر مثال على الإعداد في الشكل 1 أ.

2. التثبيت الأولي

1. بعد الاستئصال عبر الملتحمة¹¹ ، ضع العين على الفور في 50 مل على الأقل من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني على الجليد. تأكد من أن العين مغمورة بالكامل. إذا تجمعت فقاعات الهواء على السطح الخارجي للعين ، فقم بإزالتها عن طريق رجها برفق.

3. إزالة القرنية والقزحية

1. بعد 15 دقيقة ، أخرج العين من 4٪ PFA في PBS وضعها في طبق تشريح 100 مم تحت مجهر تشريح. املأ الطبق ب PBS لمنع جفاف العين.
2. إزالة القرنية.
   1. ابدأ بإنشاء شق بشفرة جراحية 1 مم أمام الحافة ، موازية لمستوى القزحية لتجنب ثقب الهياكل الأساسية عن طريق الخطأ (الشكل 1 ب).
   2. أدخل المقص المنحني في الشق الأولي واستمر في القطع بشكل محيطي مع البقاء على بعد 1 مم من الليمو. استخدم الملقط لتثبيت العين أثناء القطع (الشكل 1 ج).
   3. بمجرد اكتمال القطع المحيطي ، قم بإزالة القرنية بالملقط وامسح برفق PBS الزائد بمسح المختبر. ضع القرنية في محلول سكروز 30٪ في درجة حرارة الغرفة (RT) للحماية من البرد أو التخلص منها. تكتمل الحماية من التبريد عندما تغرق القرنية ، والتي تستغرق عادة أقل من 1 ساعة.
3. إزالة القزحية.
   1. ابدأ بعمل قطع أولي بمقص منحني عبر القزحية. افصل القزحية تماما عن بقية الأنسجة عن طريق قطع مشابه محيطيا لإزالة القرنية (الشكل 1 د).
   2. بمجرد اكتمال القطع المحيطي ، قم بإزالة القزحية بالملقط وامسح برفق PBS الزائد بمسح المختبر. ضع القزحية في محلول السكروز بنسبة 30٪ في RT للحماية من البرد أو تخلص منها على النحو الوارد أعلاه. تكتمل الحماية من التبريد عندما تغرق القزحية ، والتي تستغرق عادة أقل من 30 دقيقة.

4. الانتهاء من التثبيت

1. مع إزالة القرنية والقزحية ، ضع العين في 50 مل على الأقل من 4٪ PFA المحضرة حديثا في برنامج تلفزيوني وضعها على شاكر للتحريك اللطيف. تأكد من بقاء العين مغمورة أثناء الهياج.
2. ابق العين في 4٪ PFA في PBS عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
   ملاحظة: لقد وجدنا أن 4٪ PFA ينتج عنه تلطيخ ممتاز للIHC إذا تم استخدامه بين 16 ساعة و 24 ساعة عند 4 درجات مئوية ، مع فترات تثبيت أطول مما يؤدي إلى زيادة تلطيخ الخلفية غير المحدد وإخفاء الحاتم.

5. إزالة العدسة

1. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة العين من 4٪ PFA في PBS وضعها في طبق تشريح 100 مم تحت مجهر تشريح. املأ الطبق ب PBS لمنع جفاف العين.
2. قم بإزالة العدسة.
   1. ابدأ بإمساك كبسولة العدسة الأمامية بعناية بالملقط.
      ملاحظة: كن حذرا للغاية حتى لا تدفع أو تسحب العدسة بقوة بالملقط لأن هذا يمكن أن يخلق انفصال الشبكية.
   2. أدخل المقص بعناية في الحجرة الخلفية مع انحناء الشفرات خلفيا على طول العدسة. قم بعمل قطع أولي من خلال منطقة العدسة بمقص منحني.
      ملاحظة: كن حذرا للغاية حتى لا تدفع أو تسحب المناطق بقوة بالمقص لأن ذلك يمكن أن يؤدي إلى انفصال الشبكية (الشكل 1E).
   3. استمر في إجراء جروح صغيرة من خلال منطقة العدسة في نمط محيطي. قم بإجراء ثلاث إلى خمس تخفيضات في الساعة على مدار الساعة.
   4. للتحقق مما إذا كانت العدسة منفصلة عن بقية الأنسجة ، أمسك كبسولة العدسة الأمامية برفق بالملقط وحاول رفعها برفق. إذا لم ترفع العدسة على الفور ، فلا تحاول سحب المزيد لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى انفصال الشبكية. بدلا من ذلك ، قم بإجراء المزيد من التخفيضات من خلال مناطق العدسة المتبقية وإعادة المحاولة.
   5. بمجرد فصلها عن بقية الأنسجة ، ضع العدسة في محلول السكروز بنسبة 30٪ في RT للحماية من البرد أو تخلص منها على النحو الوارد أعلاه. تكتمل الحماية من التبريد عندما تغرق العدسة ، والتي تستغرق عادة بضع ساعات.
3. ضع العين في 50 مل على الأقل من السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية للحماية من التبريد. تكتمل الحماية من التبريد عندما تغرق العين ، والتي تستغرق عادة 24-48 ساعة. لتسريع الحماية من التبريد، استبدل محلول السكروز الأولي بمحلول جديد بعد 8-12 ساعة و / أو راقب العين في محلول السكروز في RT.

6. التضمين

1. بمجرد اكتمال الحماية بالتبريد ، قم بإزالة العين من محلول السكروز بنسبة 30٪ وضعه في طبق تشريح 100 مم تحت مجهر تشريح. اقلب العين بحذر بحيث تكون متجهة لأسفل لإزالة محلول السكروز الزائد من الجزء الداخلي من العين.
   ملاحظة: لا تحاول إزالة المحلول الزائد من الجزء الداخلي من العين بمسح المختبر لأن المنديل يمكن أن يلتصق بالجسم الزجاجي ويؤدي إلى انفصال الشبكية.
2. مع توجيه العين لأسفل، امسح محلول السكروز الزائد برفق من الجزء الخارجي من العين باستخدام منديل.
3. املأ قالب تضمين يمكن التخلص منه بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) على عمق 0.5-1.0 سم.
   ملاحظة: تضمن هذه القاعدة أن العين لن تلمس الجزء السفلي من القالب ، مما يتداخل مع التشريح بالتبريد لاحقا.
4. ضع العين في قالب التضمين القابل للتصرف متجها لأعلى. املأ الجزء الداخلي من العين ببطء باستخدام OCT مع توخي الحذر بشكل خاص لتجنب تكوين الفقاعات داخل العين. إذا تشكلت الفقاعات ، فقم بإزالتها بعناية أو ادفعها إلى حافة القالب باستخدام الملقط.
5. قم بإنهاء ملء قالب التضمين القابل للتصرف باستخدام OCT. تأكد من أن العين مغمورة تماما في OCT ولا تلمس الأسطح الداخلية للقالب أو تتعرض للهواء. لف قالب التضمين القابل للتصرف الذي يحتوي على العين في OCT في parafilm. عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
   ملاحظة: في تجربتنا ، لا تسمح فترات الحضانة الأقصر ل OCT بالتسلل تماما إلى الجسم الزجاجي. نتيجة لذلك ، غالبا ما تبقى طبقة من السكروز بين شبكية العين و OCT. عندما يحدث هذا ، غالبا ما تنفصل شبكية العين أو تتمزق تماما عن بقية الأنسجة أثناء القطع بالتبريد حيث من المحتمل أن يوفر السكروز المجمد دعما هيكليا أقل من OCT المجمد ، مما يجعل الحصول على أقسام عالية الجودة أمرا صعبا أو حتى مستحيلا.
6. في صباح اليوم التالي ، ضع قالب التضمين الذي يحتوي على العين في OCT في طبق تشريح 100 مم تحت مجهر تشريح. تأكد من أن غشاء الهيالويد الخلفي يظهر مرفوعا لأعلى من الشبكية الداخلية.
   ملاحظة: قد يحجب هذا الرفع التصاعدي رؤية شبكية العين ، مما يجعل من الصعب تحديد الاتجاه.
7. لتحديد اتجاه العين بشكل أفضل ، أمسك بعناية غشاء الهيالويد الخلفي من الأمام وحاول تقشيره بالملقط لكشف الشبكية الأساسية أثناء وجوده في OCT.
   ملاحظة: في بعض الأحيان ، قد تكون قناة الهيالويد مرئية ، والتي ترتبط برأس العصب البصري ويمكن استخدامها لأغراض التوجيه لأن رأس العصب البصري يقع في الجزء العلوي من شبكية العين (الشكل 2 أ). ليس من الضروري إزالة غشاء الهيالويد الخلفي تماما لأن OCT قد تسلل بالفعل إلى الجسم الزجاجي لتبطين الشبكية الداخلية وأي غشاء متبقي لن يؤثر على التقسيم بالتبريد (الشكل 2 ب). يجب إزالة غشاء الهيالويد الخلفي فقط للتوجيه ، إذا لزم الأمر. تشمل الخيارات الأخرى لتحديد الاتجاه وضع خياطة أو نوع آخر من العلامات قبل الاستئصال.
8. انقل العين إلى قالب تضمين جديد مع OCT جديد مملوء بعمق 0.5-1.0 سم ثم املأه ب OCT جديد كما في الخطوات 6.3-6.5 للتأكد من أن وسيط التضمين النهائي خال من الحطام و / أو العيوب الأخرى التي قد تكون تراكمت بين عشية وضحاها. إذا أمكن ، قم بإزالة OCT برفق بمسح من داخل العين أيضا ، على الرغم من أن هذا ليس ضروريا.
9. قم بتسمية القالب لأغراض التوجيه (الشكل 2C). يضمن توجيه العين بحيث تكون العين متجهة لأعلى في قالب التبريد أن OCT سوف يبطن الشبكية الداخلية. تعد قناة الهيالويد ، التي تتصل برأس العصب البصري ، معلما مهما لتحديد الجزء العلوي من العين (الشكل 2 أ).
10. ضع قالب التضمين المسمى الذي يحتوي على العين في OCT فوق الثلج الجاف. تأكد من أن العين لا تلمس أيا من الأسطح الداخلية لقالب التضمين أو تتعرض للهواء. تأكد من أن القالب يلامس الثلج الجاف مباشرة لتسريع عملية التجميد (الشكل 2 د).
11. انقل العين المدمجة إلى مجمد -80 درجة مئوية أو مباشرة إلى المبردات للتقسيم (الشكل 2E).

7. التقسيم بالتبريد

1. قم بتركيب الكتلة بحيث يكون الجزء العلوي من العين متجها بشكل علوي والجزء السفلي من العين مواجها للأسفل ، مع مواجهة القرنية والقزحية المتبقية لليمين (كما في الشكل 2E) أو اليسار (غير موضح). بدلا من ذلك ، قم بتركيب الكتلة باتجاه مختلف ، حسب الرغبة. إذا لزم الأمر ، قم بكسر القالب لتعبئة الكتلة عن طريق قطع كل جانب من جوانب القالب بعناية واحدا تلو الآخر ووضع علامة على الكتلة مباشرة حتى لا تفقد اتجاه العين.
2. اترك الكتلة تتوازن مع درجة الحرارة داخل cryostat لمدة 30-60 دقيقة ؛ -20 درجة مئوية هي نقطة انطلاق جيدة.
3. بمجرد تركيبها ، ضع شفرة جديدة في الزاوية المطلوبة ، وعادة ما تكون موازية للمحور الرأسي للعين.
4. اضبط سمك المقطع حسب الرغبة: المقاطع بسمك 10-20 ميكرومتر هي نقطة انطلاق جيدة. يوضح الشكل 3A-C مثالا على مقطع بسمك 14 ميكرومتر.
   1. بطريقة بطيئة ومضبوطة ، ابدأ في التقسيم من خلال الكتلة. تأكد من أن الشفرة تقطع الكتلة الموازية للمحور الرأسي للعين. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط الزاوية التي تلامس بها الشفرة اتجاه الكتلة أو المرحلة وفقا لذلك.
   2. أثناء تقسيم الكتلة ، امنع تجعد أو تجعد القسم بفرشاة. اقلب القسم بسرعة واضغط برفق لأسفل باستخدام فرشاة ذات شعر طويل لتسطيح القسم وتقليل التجاعيد أو التجعيد. صمم فرشاة منفصلة بطرف مدبب للمساعدة في التلاعب بالقسم.
5. قم بتوصيل القسم بشريحة زجاجية مشحونة عن طريق تحريك الشريحة ببطء بحيث تتجه لأسفل نحو القسم. امنع القسم من الطي على نفسه أو تشويه نفسه بطريقة أخرى أثناء التثبيت عن طريق لف الشريحة الزجاجية برفق فوق القسم.
   ملاحظة: لا تقم بتمرير الشريحة مباشرة فوق القسم أو الضغط عليها مقابل القسم لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف القسم أو تشويهه.
6. اترك الشرائح تجف طوال الليل قبل نقلها إلى الفريزر -80 درجة مئوية أو الانتقال مباشرة إلى بروتوكول التألق المناعي القياسي.

النتائج

بعد معالجة الأنسجة ، يمكن استخدام بروتوكول التألق المناعي القياسي للتحقيق في أي عدد من العمليات البيولوجية داخل شبكية العين. يوضح الشكل 3A-C صورا مضان تمثيلية لقسم شبكية تم الحصول عليه عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. تم تلطيخ قسم الشبكية بالمناعة وفقا ل?...

Discussion

قبل تنفيذ البروتوكول أعلاه ، واجهنا باستمرار صعوبات في معالجة أنسجة عيون الأرانب للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية. لقد قمنا بتكييف العديد من البروتوكولات من عيون الصغيرة مثل الفئران ، لكننا وجدنا أنها تؤدي إلى عدم كفاية التثبيت وصعوبة تقسيم الأنسجة. هناك العديد من الاعتبارات المهمة ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)