A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة للحصول على عمليات تجميد عالية الجودة لعيون الأرانب الكاملة. إنه يفصل تشريح عين الأرنب ، والتثبيت ، والتضمين ، وإجراءات التقسيم ، والتي يمكن تكييفها بسهولة لاستخدامها في أي دراسة تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية في عيون أكبر.

Abstract

يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على عمليات تجميد شبكية عالية الجودة في الكبيرة ، مثل الأرانب. بعد الاستئصال ، تغمر العين لفترة وجيزة في المثبت. بعد ذلك ، تتم إزالة القرنية والقزحية وتترك العين طوال الليل لتثبيت إضافي عند 4 درجات مئوية. بعد التثبيت ، تتم إزالة العدسة. ثم توضع العين في cryomold وتملأ بوسط التضمين. عن طريق إزالة العدسة ، يتمتع وسيط التضمين بوصول أفضل إلى الجسم الزجاجي ويؤدي إلى استقرار أفضل للشبكية. الأهم من ذلك ، يجب تحضين العين في وسط التضمين طوال الليل للسماح بالتسلل الكامل في جميع أنحاء الجسم الزجاجي. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يتم تجميد العين على الثلج الجاف وتقسيمها. يمكن الحصول على أقسام شبكية كاملة لاستخدامها في الكيمياء الهيستولوجية المناعية. يمكن استخدام بروتوكولات التلوين القياسية لدراسة توطين المستضدات داخل أنسجة الشبكية. يؤدي الالتزام بهذا البروتوكول إلى عمليات تجميد شبكية عالية الجودة يمكن استخدامها في أي تجربة تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية.

Introduction

تتكون شبكية العين من عدة طبقات من الخلايا المتخصصة داخل العين التي تعمل معا على تحويل الضوء إلى إشارات عصبية. نظرا لأن شبكية العين تلعب دورا مهما في الرؤية ، فإن فهم هيكلها ووظيفتها يمكن أن يوفر رؤى قيمة لبعض الأسباب الأكثر شيوعا لفقدان البصر مثل الضمور البقعي واعتلال الشبكية السكري ، من بين أمور أخرى.

تعمل الأرانب كنموذج حيواني مناسب في أبحاث الشبكية لأنها توفر العديد من المزايا مقارنة بالنماذج الأخرى. عيون الأرنب متشابهة نسبيا في علم التشريح مع عيون الإنسان 1,2. على سبيل المثال ، الأرانب لديها مساحة من كثافة مستقبلات الضوء المتزايدة ، والمعروفة باسم الخط البصري الأفقي ، والتي تشبه....

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة جنوب كاليفورنيا. تم استخدام أربعة عشر (ن = 14) أرنب هولندي أحزمة تتراوح أعمارهم بين 4 و 6 أشهر في تطوير هذا البروتوكول. تم استخدام كل من من الذكور والإناث. تزن جميع ما بين 2.0 و 2.5 كجم. تم إيواء جميع بشكل فردي. يمكن العثور على قائمة بالمواد والمعدات الموصى بها في جدول المواد.

1. التحضير

  1. إعداد المثبت.
    1. تحضير 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). كحد أدنى ، مطلوب 50 مل من المثبت لكل عين.
  2. إعداد عامل الحماية بالتبريد.
    1. تحضير 30٪ من الوزن من حيث الح....

النتائج

بعد معالجة الأنسجة ، يمكن استخدام بروتوكول التألق المناعي القياسي للتحقيق في أي عدد من العمليات البيولوجية داخل شبكية العين. يوضح الشكل 3A-C صورا مضان تمثيلية لقسم شبكية تم الحصول عليه عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. تم تلطيخ قسم الشبكية بالمناعة وفقا ل?.......

Discussion

قبل تنفيذ البروتوكول أعلاه ، واجهنا باستمرار صعوبات في معالجة أنسجة عيون الأرانب للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية. لقد قمنا بتكييف العديد من البروتوكولات من عيون الصغيرة مثل الفئران ، لكننا وجدنا أنها تؤدي إلى عدم كفاية التثبيت وصعوبة تقسيم الأنسجة. هناك العديد من الاعتبارات المهمة ا?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

شكرا لروزانا كالديرون ودومينيك شيلر وروزا سييرا على المشورة الفنية. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منحة غير مقيدة لقسم طب العيون في كلية الطب بجامعة جنوب كاليفورنيا كيك من البحث لمنع العمى (AN) ، المعاهد الوطنية للصحة K08EY030924 (AN) ، وقف لاس مادريناس في العلاجات التجريبية لطب العيون (AN) ، بحث لمنع العمى جائزة التطوير الوظيفي (AN) ، مؤسسة فرسان الهيكل للعيون (AN) ، ومؤسسة إدوارد ن. وديلا إل ثوم التذكارية (AN، KG).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm culture dishCorning353025Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tubeGenesee Scientific28-106For fixation and cryoprotection (step 1)
CryostatLeicaCM1850For cryosectioning (step 7)
Curved scissorsFine Science Tools91500-09Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPIFisher ScientificD3571Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscopeZeissStemi 2000-CUsed for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488Fisher ScientificA-11055Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555Fisher ScientificA-31570Diluted 1:1,000 in blocking buffer
ForcepsFine Science Tools91150-20Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide CoverVWR48404-453For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2R&D SystemsAF2018Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat bladesLeica Microsystems Inc.14035838926For cryosectioning (step 7)
KimwipeFisher Scientific06-666-AUsed to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65Novus BioNB100-355SSDiluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur SucroseMillipore167117Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solutionElectron Microscopy Sciences15713Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)Polysciences, Inc.18646AUsed as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1xCorning21-030-CVUsed in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15Feather08-916-5DUsed for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Used as embedding media (step 6)

References

  1. Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research. American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).
  2. Davis, F. A.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved