Whole Rabbit Eye의 고품질 냉동 절개 획득

요약

이 프로토콜은 전체 토끼 눈의 고품질 냉동 절개를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 토끼 눈 절제술, 고정, 포매 및 절편 절차에 대해 자세히 설명하며, 이는 큰 눈에 면역조직화학을 활용하는 모든 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.

초록

이 프로토콜은 토끼와 같은 대형 동물에서 고품질 망막 동결 절개를 얻는 방법을 설명합니다. 적출 후, 눈은 잠시 고정제에 담뱉니다. 그런 다음 각막과 홍채를 제거하고 눈을 하룻밤 동안 방치하여 4 °C에서 추가로 고정합니다. 고정 후 렌즈를 제거합니다. 그런 다음 눈을 빙결 금형에 넣고 매립 매체로 채웁니다. 수정체를 제거함으로써 매립 매체가 유리체에 더 잘 접근할 수 있고 망막 안정성이 향상됩니다. 중요한 것은 유리체 전체에 완전히 침투할 수 있도록 눈을 밤새 매립 배지에서 배양해야 한다는 것입니다. 하룻밤 동안 배양한 후 눈을 드라이아이스에 얼려 절편합니다. 면역조직화학(immunohistochemistry)에 사용하기 위해 전체 망막 절편을 얻을 수 있습니다. 표준 염색 프로토콜은 망막 조직 내 항원의 국소화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 준수하면 면역조직화학을 활용하는 모든 실험에 사용할 수 있는 고품질 망막 동결 절제술을 얻을 수 있습니다.

서문

망막은 눈 안에 있는 여러 층의 특수 세포로 구성되어 있으며, 이 세포들이 함께 작용하여 빛을 신경 신호로 변환합니다. 망막은 시력에 중요한 역할을 하기 때문에 망막의 구조와 기능을 이해하면 황반변성 및 당뇨병성 망막병증과 같은 시력 상실의 가장 흔한 원인에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

토끼는 다른 모델에 비해 몇 가지 이점을 제공하기 때문에 망막 연구에서 편리한 동물 모델 역할을 합니다. 토끼 눈은 해부학적으로 인간의 눈과 비교적 유사합니다 ^1,2. 예를 들어, 토끼는 수평 시각 줄무늬(horizontal visual streak)로 알려진 광수용체 밀도가 증가한 영역을 가지고 있으며, 이는 인간의 중심와(fovea)와 유사합니다. 설치류와 같이 일반적으로 사용되는 다른 동물 모델에는 해부학적 등가물이 없습니다. 또한 설치류와 비교했을 때 토끼의 망막 혈관 구조는 인간의 망막 혈관 구조와 상당히 유사합니다. 토끼 눈도 비교적 큽니다. 따라서 작은 눈에서는 어렵거나 불가능할 수 있는 유리체 또는 망막 내 약물 투여 또는 외과적 개입과 관련된 연구에 특히 적합합니다³.

프로토콜

모든 절차는 University of Southern California의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행되었으며 이를 승인받았습니다. 생후 4개월에서 6개월 사이의 네덜란드 허리띠 토끼 14마리(n = 14)가 이 프로토콜의 개발에 사용되었습니다. 수컷과 암컷 동물이 모두 사용되었습니다. 모든 동물의 무게는 2.0kg에서 2.5kg 사이였습니다. 모든 동물들은 단독으로 수용되었다. 권장되는 재료 및 장비 목록은 재료 표에서 찾을 수 있습니다.

1. 준비

1. 정착제 제제.
   1. 인산염 완충 식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다. 눈당 최소 50mL의 정착제가 필요합니다.
2. 냉동 보호제 준비.
   1. PBS에서 30% 중량(w/v) 자당을 준비합니다. 자당이 완전히 녹을 수 있도록 최소 15분 동안 셰이커에 올려 놓습니다. 눈당 최소 50mL의 동결 보호제가 필요합니다.
3. 해부 기구 준비.
   1. 집게 두 쌍, 구부러진 가위 한 쌍, 메스 칼날 한 쌍, 100mm 해부 접시를 모아 해부....

토론

위의 프로토콜을 구현하기 전에 우리는 IHC를 위해 토끼 눈의 조직 처리에 지속적으로 어려움을 겪었습니다. 우리는 생쥐와 같은 작은 동물의 눈에서 몇 가지 프로토콜을 적용했지만 이러한 프로토콜이 부적절한 고정과 조직 절개의 어려움으로 이어진다는 것을 발견했습니다. 토끼 망막의 일관되고 고품질의 절편을 가능하게 하는 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다.

한 가.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)