Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte von ganzem Kaninchenauge

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte ganzer Kaninchenaugen. Es beschreibt Verfahren zur Dissektion, Fixierung, Einbettung und Sektion von Kaninchenaugen, die leicht für den Einsatz in jeder Studie angepasst werden können, bei der die Immunhistochemie bei größeren Augen eingesetzt wird.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie man hochwertige Netzhautkryosektionen bei größeren Tieren, wie z. B. Kaninchen, erhält. Nach der Enukleation wird das Auge kurz in das Fixiermittel getaucht. Dann werden die Hornhaut und die Iris entfernt und das Auge über Nacht bei 4 °C fixiert. Nach der Fixierung wird die Linse entfernt. Das Auge wird dann in eine Kryoform gelegt und mit einem Einbettmedium gefüllt. Durch das Entfernen der Linse hat das Einbettmedium einen besseren Zugang zum Glaskörper und führt zu einer besseren Netzhautstabilität. Wichtig ist, dass das Auge über Nacht in Einbettmedium inkubiert wird, um eine vollständige Infiltration im gesamten Glaskörper zu ermöglichen. Nach der Inkubation über Nacht wird das Auge auf Trockeneis eingefroren und in Stücke geschnitten. Ganze Netzhautschnitte können für die Verwendung in der Immunhistochemie gewonnen werden. Standard-Färbeprotokolle können verwendet werden, um die Lokalisation von Antigenen im Netzhautgewebe zu untersuchen. Die Einhaltung dieses Protokolls führt zu qualitativ hochwertigen Netzhautkryosektionen, die in jedem immunhistochemischen Experiment verwendet werden können.

Einleitung

Die Netzhaut besteht aus mehreren Schichten spezialisierter Zellen im Auge, die zusammen Licht in neuronale Signale umwandeln. Da die Netzhaut eine entscheidende Rolle für das Sehvermögen spielt, kann das Verständnis ihrer Struktur und Funktion wertvolle Einblicke in einige der häufigsten Ursachen für Sehverlust liefern, wie z. B. Makuladegeneration und diabetische Retinopathie.

Kaninchen dienen als praktisches Tiermodell in der Netzhautforschung, da sie im Vergleich zu anderen Modellen mehrere Vorteile bieten. Kaninchenaugen sind in ihrer Anatomie den menschlichen Augen relativ ähnlich ^1,2

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Southern California durchgeführt und von diesem genehmigt. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden vierzehn (n = 14) Holländische Gürtelkaninchen im Alter zwischen 4 und 6 Monaten verwendet. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Tiere verwendet. Alle Tiere wogen zwischen 2,0 und 2,5 kg. Alle Tiere wurden einzeln untergebracht. Eine Liste der empfohlenen Materialien und Geräte finden Sie in der Werkstofftabelle.

1. Vorbereitung

1. Fixiermittel Vorbereitung.
   1. Bereite....

Diskussion

Vor der Implementierung des oben genannten Protokolls hatten wir immer wieder Schwierigkeiten bei der Gewebeverarbeitung von Kaninchenaugen für IHC. Wir hatten mehrere Protokolle aus den Augen kleinerer Tiere, wie z. B. Mäuse, angepasst, stellten aber fest, dass diese zu einer unzureichenden Fixierung und Schwierigkeiten bei der Gewebeschnittung führten. Es gibt mehrere wichtige Überlegungen, die konsistente, qualitativ hochwertige Schnitte der Netzhaut des Kaninchens ermöglichen.

Eine Ü.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)