Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte von ganzem Kaninchenauge

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Gewinnung hochwertiger Kryoschnitte ganzer Kaninchenaugen. Es beschreibt Verfahren zur Dissektion, Fixierung, Einbettung und Sektion von Kaninchenaugen, die leicht für den Einsatz in jeder Studie angepasst werden können, bei der die Immunhistochemie bei größeren Augen eingesetzt wird.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie man hochwertige Netzhautkryosektionen bei größeren Tieren, wie z. B. Kaninchen, erhält. Nach der Enukleation wird das Auge kurz in das Fixiermittel getaucht. Dann werden die Hornhaut und die Iris entfernt und das Auge über Nacht bei 4 °C fixiert. Nach der Fixierung wird die Linse entfernt. Das Auge wird dann in eine Kryoform gelegt und mit einem Einbettmedium gefüllt. Durch das Entfernen der Linse hat das Einbettmedium einen besseren Zugang zum Glaskörper und führt zu einer besseren Netzhautstabilität. Wichtig ist, dass das Auge über Nacht in Einbettmedium inkubiert wird, um eine vollständige Infiltration im gesamten Glaskörper zu ermöglichen. Nach der Inkubation über Nacht wird das Auge auf Trockeneis eingefroren und in Stücke geschnitten. Ganze Netzhautschnitte können für die Verwendung in der Immunhistochemie gewonnen werden. Standard-Färbeprotokolle können verwendet werden, um die Lokalisation von Antigenen im Netzhautgewebe zu untersuchen. Die Einhaltung dieses Protokolls führt zu qualitativ hochwertigen Netzhautkryosektionen, die in jedem immunhistochemischen Experiment verwendet werden können.

Einleitung

Die Netzhaut besteht aus mehreren Schichten spezialisierter Zellen im Auge, die zusammen Licht in neuronale Signale umwandeln. Da die Netzhaut eine entscheidende Rolle für das Sehvermögen spielt, kann das Verständnis ihrer Struktur und Funktion wertvolle Einblicke in einige der häufigsten Ursachen für Sehverlust liefern, wie z. B. Makuladegeneration und diabetische Retinopathie.

Kaninchen dienen als praktisches Tiermodell in der Netzhautforschung, da sie im Vergleich zu anderen Modellen mehrere Vorteile bieten. Kaninchenaugen sind in ihrer Anatomie den menschlichen Augen relativ ähnlich ^1,2. Kaninchen haben zum Beispiel einen Bereich mit erhöhter Photorezeptordichte, der als horizontaler visueller Streifen bekannt ist und der der Fovea beim Menschen entspricht. Andere häufig verwendete Tiermodelle, wie z. B. Nagetiere, haben keine anatomische Entsprechung. Darüber hinaus ist das retinale Gefäßsystem bei Kaninchen im Vergleich zu Nagetieren dem des Menschen ziemlich ähnlich. Kaninchenaugen sind auch relativ groß. Dies macht sie besonders geeignet für Studien, die die Verabreichung von Medikamenten oder chirurgische Eingriffe in den Glaskörper oder die Netzhaut beinhalten, die sonst bei einem kleineren Auge schwierig oder unmöglich sein könnten³.

Die Immunhistochemie (IHC) ist eine weit verbreitete Technik zur Untersuchung der Lokalisierung von Antigenen in einem Gewebe und findet breite Anwendung in der Netzhautforschung ^4,5,6. Da es sich bei der Netzhaut um eine empfindliche Struktur handelt, ist eine sorgfältige Gewebeaufbereitung erforderlich, um brauchbare Ergebnisse mit IHC zu erzielen. Netzhautablösungen und andere Gewebeartefakte wie Netzhautbrüche oder -falten treten häufig während der Verarbeitung auf und können die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen. Die erfolgreiche Verarbeitung hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Gewebemanipulation, der Art und Dauer der Fixierung, der Art des Einbettungsmediums und der Schnitttechniken 7,8,9,10. Trotz der Vorteile der Verwendung von Kaninchen als Tiermodell in der Netzhautforschung gibt es nur sehr wenige Protokolle, die eine erfolgreiche Gewebeverarbeitung der Kaninchennetzhaut beschreiben. In dieser Arbeit wird eine zuverlässige Methode zur Gewinnung hochwertiger Netzhautschnitte aus ganzen Kaninchenaugen für den Einsatz in der IHC beschrieben.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Southern California durchgeführt und von diesem genehmigt. Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden vierzehn (n = 14) Holländische Gürtelkaninchen im Alter zwischen 4 und 6 Monaten verwendet. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Tiere verwendet. Alle Tiere wogen zwischen 2,0 und 2,5 kg. Alle Tiere wurden einzeln untergebracht. Eine Liste der empfohlenen Materialien und Geräte finden Sie in der Werkstofftabelle.

1. Vorbereitung

1. Fixiermittel Vorbereitung.
   1. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Pro Auge sind mindestens 50 ml Fixiermittel erforderlich.
2. Zubereitung von Kryoprotektiven.
   1. Bereiten Sie 30 % Massenprozent Saccharose in PBS vor. Mindestens 15 Minuten auf einen Shaker legen, um sicherzustellen, dass sich die Saccharose vollständig aufgelöst hat. Pro Auge sind mindestens 50 ml Kryoprotektivum erforderlich.
3. Vorbereitung des Präparierinstruments.
   1. Sammeln Sie zwei Paar Pinzetten, eine gebogene Schere, eine Skalpellklinge und eine 100-mm-Sezierschale und platzieren Sie sie in der Nähe eines Seziermikroskops. Ein Beispiel für eine Einrichtung ist in Abbildung 1A dargestellt.

2. Anfängliche Fixierung

1. Nach der transkonjunktivalen Enukleation¹¹ ist das Auge sofort in mindestens 50 ml 4 % PFA in PBS auf Eis zu legen. Stellen Sie sicher, dass das Auge vollständig untergetaucht ist. Wenn sich Luftblasen auf der Außenseite des Auges ansammeln, entfernen Sie diese durch leichtes Schütteln.

3. Entfernung von Hornhaut und Iris

1. Entfernen Sie nach 15 Minuten das Auge von 4% PFA in PBS und legen Sie es in eine 100-mm-Präparierschale unter einem Präpariermikroskop. Füllen Sie die Schale mit PBS, um ein Austrocknen des Auges zu verhindern.
2. Entferne die Hornhaut.
   1. Beginnen Sie mit einem Schnitt mit einer chirurgischen Klinge 1 mm vor dem Limbus, parallel zur Irisebene, um ein versehentliches Durchstechen der darunter liegenden Strukturen zu vermeiden (Abbildung 1B).
   2. Führen Sie eine gebogene Schere in den ersten Schnitt ein und schneiden Sie weiter umfangs, während Sie 1 mm vom Limbus entfernt bleiben. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Auge während des Schneidens zu stabilisieren (Abbildung 1C).
   3. Sobald der umlaufende Schnitt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Hornhaut mit einer Pinzette und wischen Sie überschüssiges PBS vorsichtig mit einem Labortuch ab. Legen Sie die Hornhaut zur Kryoprotektion in eine 30%ige Saccharoselösung bei Raumtemperatur (RT) oder entsorgen Sie sie. Die Kryoprotektion ist abgeschlossen, wenn die Hornhaut absinkt, was in der Regel weniger als 1 Stunde dauert.
3. Entfernen Sie die Iris.
   1. Beginnen Sie damit, einen ersten Schnitt mit einer gebogenen Schere durch die Iris zu machen. Trennen Sie die Iris vollständig vom restlichen Gewebe, indem Sie ähnlich wie bei der Hornhautentfernung umfangsmäßig schneiden (Abbildung 1D).
   2. Sobald der umlaufende Schnitt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Iris mit einer Pinzette und wischen Sie überschüssiges PBS vorsichtig mit einem Labortuch ab. Legen Sie die Iris zur Kryoprotektion in eine 30%ige Saccharoselösung bei RT oder entsorgen Sie sie wie oben. Die Kryoprotektion ist abgeschlossen, wenn die Iris absinkt, was in der Regel weniger als 30 Minuten dauert.

4. Abschluss der Fixierung

1. Nachdem die Hornhaut und die Iris entfernt wurden, legen Sie das Auge in mindestens 50 ml frisch zubereitetes 4%iges PFA in PBS und legen Sie es auf einen Shaker, um es sanft zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass das Auge während der Bewegung untergetaucht bleibt.
2. Halten Sie das Auge über Nacht in 4 % PFA in PBS bei 4 °C.
   HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass 4 % PFA bei Verwendung zwischen 16 h und 24 h bei 4 °C zu einer hervorragenden IHC-Färbung führen, wobei längere Fixierungsdauern zu einer erhöhten unspezifischen Hintergrundfärbung und Epitopmaskierung führen.

5. Entfernen der Linse

1. Entfernen Sie am nächsten Morgen das Auge von 4% PFA in PBS und legen Sie es in eine 100-mm-Präparierstale unter ein Präpariermikroskop. Füllen Sie die Schale mit PBS, um ein Austrocknen des Auges zu verhindern.
2. Entfernen Sie das Objektiv.
   1. Beginnen Sie damit, die vordere Linsenkapsel vorsichtig mit einer Pinzette zu greifen.
      HINWEIS: Seien Sie äußerst vorsichtig, nicht mit der Pinzette gewaltsam auf die Linse zu drücken oder zu ziehen, da dies zu einer Netzhautablösung führen kann.
   2. Führen Sie die Schere vorsichtig in die hintere Kammer ein, wobei die Klingen nach hinten entlang der Linse gebogen sind. Machen Sie mit einer gebogenen Schere einen ersten Schnitt durch die Linsenzonulen.
      HINWEIS: Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie mit der Schere nicht gewaltsam auf die Zonulen drücken oder ziehen, da dies zu einer Netzhautablösung führen kann (Abbildung 1E).
   3. Machen Sie weiterhin kleine Schnitte durch die Linsenzonulen in einem umlaufenden Muster. Machen Sie drei bis fünf Schnitte pro Stundenstunde.
   4. Um zu überprüfen, ob die Linse vom restlichen Gewebe getrennt ist, fassen Sie die vordere Linsenkapsel vorsichtig mit einer Pinzette und versuchen Sie, sie vorsichtig anzuheben. Wenn sich die Linse nicht sofort anhebt, versuchen Sie nicht, mehr zu ziehen, da dies zu einer Netzhautablösung führen kann. Machen Sie stattdessen weitere Schnitte durch die verbleibenden Linsenzonulen und versuchen Sie es erneut.
   5. Sobald die Linse vom Rest des Gewebes getrennt ist, legen Sie sie zur Kryoprotektion in 30%ige Saccharoselösung bei RT oder entsorgen Sie sie wie oben. Die Kryoprotektion ist abgeschlossen, wenn die Linse einsinkt, was in der Regel einige Stunden dauert.
3. Legen Sie das Auge zur Kryoprotektion in mindestens 50 ml 30%ige Saccharose in PBS bei 4 °C. Die Kryoprotektion ist abgeschlossen, wenn das Auge sinkt, was in der Regel 24-48 Stunden dauert. Um die Kryoprotektion zu beschleunigen, tauschen Sie die ursprüngliche Saccharoselösung nach 8-12 h gegen eine frische aus und/oder halten Sie das Auge in Saccharoselösung bei RT.

6. Einbettung

1. Sobald die Kryoprotektion abgeschlossen ist, entfernen Sie das Auge aus der 30%igen Saccharoselösung und legen Sie es in eine 100-mm-Sezierschale unter ein Präpariermikroskop. Drehe das Auge vorsichtig nach unten, um überschüssige Saccharoselösung aus dem inneren Teil des Auges zu entfernen.
   HINWEIS: Versuchen Sie nicht, überschüssige Lösung mit einem Labortuch aus dem inneren Teil des Auges zu entfernen, da das Tuch am Glaskörper haften bleiben und zu einer Netzhautablösung führen kann.
2. Wischen Sie mit dem Auge nach unten überschüssige Saccharoselösung vorsichtig mit einem Tuch vom äußeren Teil des Auges ab.
3. Füllen Sie eine Einweg-Einbettungsform mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) bis zu einer Tiefe von 0,5-1,0 cm.
   HINWEIS: Diese Basis stellt sicher, dass das Auge den Boden der Form nicht berührt, was die spätere Kryosektion beeinträchtigt.
4. Platzieren Sie das Auge mit dem Gesicht nach oben in der Einweg-Einbettungsform. Füllen Sie den inneren Teil des Auges langsam mit OCT und achten Sie besonders darauf, Blasenbildung im Auge zu vermeiden. Wenn sich Blasen bilden, entfernen Sie diese vorsichtig oder schieben Sie sie mit einer Pinzette an den Rand der Form.
5. Füllen Sie die Einweg-Einbettform mit OCT. Stellen Sie sicher, dass das Auge vollständig in OCT eingetaucht ist und nicht die Innenflächen der Form berührt oder der Luft ausgesetzt ist. Wickeln Sie die Einweg-Einbettform, die das Auge enthält, in OCT in Parafilm ein. Über Nacht bei 4 °C aufstellen.
   HINWEIS: Unserer Erfahrung nach erlauben kürzere Inkubationszeiten es der OCT nicht, den Glaskörper vollständig zu infiltrieren. Infolgedessen verbleibt oft eine Schicht Saccharose zwischen der Netzhaut und der OCT. In diesem Fall löst sich die Netzhaut während der Kryosektion oft vom restlichen Gewebe ab oder reißt sich vollständig ab, da gefrorene Saccharose wahrscheinlich weniger strukturelle Unterstützung bietet als gefrorene OCT, was es schwierig oder sogar unmöglich macht, qualitativ hochwertige Schnitte zu erhalten.
6. Am nächsten Morgen legen Sie die Einbettungsform, die das Auge in OCT enthält, in eine 100-mm-Präparierschale unter einem Präpariermikroskop. Vergewissern Sie sich, dass die hintere Hyaloidmembran von der inneren Netzhaut nach oben angehoben erscheint.
   HINWEIS: Dieses Anheben nach oben kann die Sicht auf die Netzhaut verdecken, wodurch die Ausrichtung schwer zu bestimmen ist.
7. Um die Ausrichtung des Auges besser bestimmen zu können, fassen Sie die hintere Hyaloidmembran vorsichtig nach vorne und versuchen Sie, sie mit einer Pinzette abzuziehen, um die darunter liegende Netzhaut während der OCT freizulegen.
   HINWEIS: Gelegentlich kann der Hyaloidkanal sichtbar sein, der am Sehnervenkopf ansetzt und zur Orientierung verwendet werden kann, da sich der Sehnervenkopf im oberen Teil der Netzhaut befindet (Abbildung 2A). Es ist nicht notwendig, die hintere hyaloide Membran vollständig zu entfernen, da die OCT bereits in den Glaskörper eingedrungen ist, um die innere Netzhaut auszukleiden, und eine verbleibende Membran die Kryosektion nicht beeinträchtigt (Abbildung 2B). Die hintere Hyaloidmembran sollte nur zur Orientierung entfernt werden, falls erforderlich. Weitere Optionen zur Bestimmung der Orientierung sind das Platzieren einer Naht oder einer anderen Art von Markierung vor der Enukleation.
8. Übertragen Sie das Auge in eine neue Einbettungsform mit neuem OCT, das bis zu einer Tiefe von 0,5-1,0 cm gefüllt ist, und füllen Sie es dann mit neuem OCT wie in den Schritten 6.3-6.5, um sicherzustellen, dass das endgültige Einbettmedium frei von Schmutz und/oder anderen Unvollkommenheiten ist, die sich möglicherweise über Nacht angesammelt haben. Wenn möglich, entfernen Sie OCT vorsichtig mit einem Tuch auch von der Innenseite des Auges, obwohl dies nicht erforderlich ist.
9. Beschriften Sie die Form zur Orientierung (Abbildung 2C). Wenn Sie das Auge in der Kryoform mit dem Auge nach oben ausrichten, wird sichergestellt, dass die OCT die innere Netzhaut auskleidet. Der Hyaloidkanal, der am Kopf des Sehnervs ansetzt, ist ein wichtiger Orientierungspunkt für die Bestimmung des oberen Teils des Auges (Abbildung 2A).
10. Legen Sie die beschriftete Einbettungsform, die das Auge in OCT enthält, auf Trockeneis. Stellen Sie sicher, dass das Auge keine der Innenflächen der Einbettungsform berührt oder der Luft ausgesetzt ist. Stellen Sie sicher, dass die Form das Trockeneis direkt berührt, um den Gefrierprozess zu beschleunigen (Abbildung 2D).
11. Bringen Sie das eingebettete Auge in einen -80 °C-Gefrierschrank oder direkt in den Kryostaten, um es zu schneiden (Abbildung 2E).

7. Kryosektion

1. Montieren Sie den Block mit dem oberen Teil des Auges nach oben und dem unteren Teil des Auges nach unten, wobei die verbleibende Hornhaut und Iris nach rechts (wie in Abbildung 2E) oder links (nicht gezeigt) zeigt. Alternativ können Sie den Block je nach Wunsch in einer anderen Ausrichtung montieren. Brechen Sie bei Bedarf die Form, um den Block zu mobilisieren, indem Sie vorsichtig jede Seite der Form einzeln abbrechen und den Block direkt markieren, um die Ausrichtung des Auges nicht zu verlieren.
2. Lassen Sie den Block 30-60 Minuten lang an die Temperatur im Kryostaten anpassen. -20 °C sind ein guter Ausgangspunkt.
3. Platzieren Sie nach der Montage eine frische Klinge im gewünschten Winkel, in der Regel parallel zur vertikalen Achse des Auges.
4. Stellen Sie die Profildicke wie gewünscht ein: 10-20 μm dicke Profile sind ein guter Ausgangspunkt. Ein Beispiel für einen 14 μm dicken Querschnitt ist in Abbildung 3A-C dargestellt.
   1. Beginnen Sie langsam und kontrolliert mit dem Durchschneiden des Blocks. Stellen Sie sicher, dass die Klinge den Block parallel zur vertikalen Achse des Auges schneidet. Wenn nicht, passen Sie den Winkel, in dem die Klinge den Block oder die Tischausrichtung berührt, entsprechend an.
   2. Verhindern Sie beim Schneiden des Blocks mit einer Bürste die Faltenbildung oder das Kräuseln des Abschnitts. Drehen Sie die Partie schnell um und üben Sie mit einer langhaarigen Bürste sanften Druck nach unten aus, um die Partie abzuflachen und Faltenbildung oder Kräuseln zu minimieren. Forme einen separaten Pinsel mit einer spitzen Spitze, um die Manipulation des Abschnitts zu erleichtern.
5. Befestigen Sie den Abschnitt an einem geladenen Objektträger, indem Sie den Objektträger langsam nach unten in Richtung des Objektträgers bewegen. Verhindern Sie, dass sich das Profil während der Befestigung auf sich selbst faltet oder sich anderweitig verformt, indem Sie den Glasschieber vorsichtig über das Profil rollen.
   HINWEIS: Bewegen Sie die Folie nicht direkt über den Abschnitt und drücken Sie sie nicht gegen den Abschnitt, da dies den Abschnitt beschädigen oder verzerren kann.
6. Lassen Sie die Objektträger über Nacht trocknen, bevor Sie sie in einen -80 °C-Gefrierschrank umfüllen oder direkt mit einem Standard-Immunfluoreszenzprotokoll fortfahren.

Ergebnisse

Nach der Gewebeverarbeitung kann ein Standard-Immunfluoreszenzprotokoll verwendet werden, um eine beliebige Anzahl biologischer Prozesse in der Netzhaut zu untersuchen. Abbildung 3A-C zeigt repräsentative Fluoreszenzbilder eines Netzhautschnitts, die mittels konfokaler Mikroskopie aufgenommen wurden. Der Netzhautschnitt wurde nach einem zuvor beschriebenen Protokoll^{immungefärbt 12}.

Die in

Diskussion

Vor der Implementierung des oben genannten Protokolls hatten wir immer wieder Schwierigkeiten bei der Gewebeverarbeitung von Kaninchenaugen für IHC. Wir hatten mehrere Protokolle aus den Augen kleinerer Tiere, wie z. B. Mäuse, angepasst, stellten aber fest, dass diese zu einer unzureichenden Fixierung und Schwierigkeiten bei der Gewebeschnittung führten. Es gibt mehrere wichtige Überlegungen, die konsistente, qualitativ hochwertige Schnitte der Netzhaut des Kaninchens ermöglichen.

Eine Ü...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)