获得全兔眼的高质量冷冻切片

摘要

该协议描述了一种获得整个兔眼的高质量冷冻切片的可靠方法。它详细介绍了兔眼的解剖、固定、嵌入和切片程序，这些程序可以很容易地用于任何利用免疫组化在大眼睛中的研究。

摘要

该协议描述了如何在较大的动物（如兔子）中获得高质量的视网膜冷冻切片。摘除后，将眼睛短暂浸入固定剂中。然后，去除角膜和虹膜，将眼睛放置过夜，以便在4°C下进行额外固定。 固定后，将镜片取下。然后将眼睛放入冷冻模型中，并填充嵌入培养基。通过去除晶状体，嵌入介质可以更好地进入玻璃体，并导致更好的视网膜稳定性。重要的是，眼睛应在包埋培养基中孵育过夜，以使眼睛完全浸润整个玻璃体。孵育过夜后，将眼睛冷冻在干冰上并切片。可以获取整个视网膜切片用于免疫组化。标准染色方案可用于研究视网膜组织内抗原的定位。遵守该协议可产生高质量的视网膜冷冻切片，可用于任何利用免疫组织化学的实验。

引言

视网膜由眼睛内的几层特化细胞组成，这些细胞共同将光转化为神经信号。由于视网膜在视力中起着至关重要的作用，因此了解其结构和功能可以为视力丧失的一些最常见原因提供有价值的见解，例如黄斑变性和糖尿病性视网膜病变等。

兔子在视网膜研究中是一种方便的动物模型，因为与其他模型相比，它们具有多种优势。兔子的眼睛在解剖结构上与人类的眼睛相对相似 ^1,2。例如，兔子有一个光感受器密度增加的区域，称为水平视觉条纹，类似于人类的中央凹。其他常用的动物模型，如啮齿动物，没有解剖学上的等效物。此外，与啮齿动物相比，兔子的视网膜脉管系统与人类的视网膜血管系统相当相似。兔子的眼睛也比较大。这使得它们特别适用于涉及玻璃体或视网膜内的药物给药或手术干预的研究，否则在较小的眼睛中可能难以或不可能³.

免疫组织化学 （IHC） 是一种广泛使用的技术，用于研究组织内抗原的定位，在视网膜研究中具有广泛的应用 ^4,5,6。由于视网膜是一个微妙的结构，通过 IHC 获得有用的结果需要仔细的组织处理。视网膜脱离和其他组织....

研究方案

所有程序均按照南加州大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的规定执行并得到其批准。14 （n = 14） 4 至 6 个月大的荷兰带兔用于该协议的开发。雄性和雌性动物均被使用。所有动物的体重在 2.0 到 2.5 公斤之间。所有的动物都是单独饲养的。推荐的材料和设备清单可在 材料表中找到。

1. 准备工作

1. 固定剂制备。
   1. 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 4% 多聚甲醛 （PFA）。每只眼睛至少需要 50 mL 固定剂。
2. 冷冻保护剂的制备。
   1. 在PBS中制备30%体积重量（w / v）蔗糖。放在摇荡器上至少 15 分钟，以确保蔗糖完全溶解。每只眼睛至少需要 50 mL 的冷冻保护剂。
3. 解剖器械的准备。
   1. 收集两把镊子、一把弯曲的剪刀、一把手术刀刀片和一个 100 毫米的解剖皿，并将它们放在解剖显微镜附近。设置示例如图 1A 所示。

2. 初始固定

1. 经结膜摘除术¹¹ 后，立即将眼睛置于冰上至少 50 mL 的....

讨论

在实施上述协议之前，我们在用于 IHC 的兔眼组织处理方面一直面临困难。我们已经从小鼠等较小动物的眼睛中采用了几种方案，但发现这些方案会导致固定不足和组织切片困难。有几个重要的考虑因素可以使兔子视网膜的切片保持一致、高质量。

一个考虑因素是与其他常用的动物模型（如啮齿动物）相比，兔子球体的尺寸较大。由于兔眼的大小与人眼相似，因此可以很容易.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)