Obtention de cryosections de haute qualité d’œil de lapin entier

Résumé

Ce protocole décrit une méthode fiable pour obtenir des cryosections de haute qualité d’yeux de lapin entiers. Il détaille les procédures de dissection, de fixation, d’intégration et de sectionnement de l’œil de lapin, qui peuvent être facilement adaptées pour être utilisées dans toute étude utilisant l’immunohistochimie dans des yeux plus grands.

Résumé

Ce protocole décrit comment obtenir des cryosections rétiniennes de haute qualité chez des animaux de grande taille, tels que les lapins. Après l’énucléation, l’œil est brièvement immergé dans le fixateur. Ensuite, la cornée et l’iris sont retirés et l’œil est laissé toute la nuit pour une fixation supplémentaire à 4 °C. Après la fixation, l’objectif est retiré. L’œil est ensuite placé dans un cryomoule et rempli d’un milieu d’enrobage. En retirant le cristallin, le milieu d’enrobage a un meilleur accès au vitré et conduit à une meilleure stabilité rétinienne. Il est important que l’œil soit incubé dans un milieu d’enrobage pendant la nuit pour permettre une infiltration complète dans tout le vitré. Après une nuit d’incubation, l’œil est congelé sur de la glace sèche et sectionné. Des coupes rétiniennes entières peuvent être obtenues pour une utilisation en immunohistochimie. Des protocoles de coloration standard peuvent être utilisés pour étudier la localisation des antigènes dans le tissu rétinien. Le respect de ce protocole permet d’obtenir des cryosections rétiniennes de haute qualité qui peuvent être utilisées dans toute expérience utilisant l’immunohistochimie.

Introduction

La rétine est composée de plusieurs couches de cellules spécialisées dans l’œil qui, ensemble, convertissent la lumière en signaux neuronaux. Parce que la rétine joue un rôle essentiel dans la vision, la compréhension de sa structure et de sa fonction peut fournir des informations précieuses sur certaines des causes les plus courantes de perte de vision, telles que la dégénérescence maculaire et la rétinopathie diabétique, entre autres.

Les lapins servent de modèle animal pratique dans la recherche rétinienne car ils offrent plusieurs avantages par rapport aux autres modèles. L’anatomie des yeux de lapin est relativement similaire à celle des yeux humains ^1,2. Par exemple, les lapins ont une zone de densité accrue de photorécepteurs, connue sous le nom de traînée visuelle horizontale, qui est analogue à la fovéa chez les humains. D’autres modèles animaux couramment utilisés, tels que les rongeurs, n’ont pas d’équivalent anatomique. De plus, par rapport aux rongeurs, le système vasculaire rétinien chez le lapin est assez similaire à celui de l’homme. Les yeux de lapin sont également relativement grands. Cela les rend particulièrement adaptés aux études qui impliquent l’administration de médicaments ou une intervention chirurgicale dans le vitré ou la rétine, ce qui pourrait autrement être difficile ou impossible dans un œil plus petit³.

L’immunohistochimie (IHC) est une technique largement utilisée pour étudier la localisation des antigènes dans un tissu et a de nombreuses applications dans la recherche rétinienne ^4,5,6. La rétine étant une structure délicate, l’obtention de résultats utiles via l’IHC nécessite un traitement minutieux des tissus. Le décollement de la rétine et d’autres artefacts tissulaires tels que les fractures ou les plis rétiniens se produisent fréquemment pendant le traitement et peuvent interférer avec l’interprétation des résultats. Le succès du traitement dépend de divers facteurs, notamment de la manipulation des tissus, du type et de la durée de la fixation, du type de support d’enrobage et des techniques de sectionnement 7,8,9,10. Malgré les avantages de l’utilisation de lapins comme modèle animal dans la recherche rétinienne, il existe très peu de protocoles décrivant le traitement tissulaire réussi de la rétine de lapin. Cet article décrit une méthode fiable pour obtenir des coupes rétiniennes de haute qualité à partir d’yeux de lapin entiers pour une utilisation en IHC.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie du Sud. Quatorze (n = 14) lapins à ceinture hollandaise âgés de 4 à 6 mois ont été utilisés dans l’élaboration de ce protocole. Des animaux mâles et femelles ont été utilisés. Tous les animaux pesaient entre 2,0 et 2,5 kg. Tous les animaux étaient logés individuellement. Une liste des matériaux et équipements recommandés se trouve dans la Table des matériaux.

1. Préparation

1. Préparation fixative.
   1. Préparez du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Au moins 50 ml de fixateur sont nécessaires par œil.
2. Préparation d’un agent cryoprotecteur.
   1. Préparez 30 % de saccharose en poids par volume (p/v) dans du PBS. Placer sur un shaker pendant au moins 15 minutes pour s’assurer que le saccharose est complètement dissous. Au minimum, 50 ml d’agent cryoprotecteur sont nécessaires par œil.
3. Préparation de l’instrument de dissection.
   1. Rassemblez deux paires de pinces, une paire de ciseaux incurvés, une lame de scalpel et une boîte de dissection de 100 mm et placez-les près d’un microscope de dissection. Un exemple de configuration est illustré à la figure 1A.

2. Fixation initiale

1. Après l’énucléation transconjonctivale¹¹, placer immédiatement l’œil dans au moins 50 mL de PFA à 4 % dans du PBS sur de la glace. Assurez-vous que l’œil est complètement immergé. Si des bulles d’air s’accumulent sur la surface externe de l’œil, retirez-les en secouant doucement.

3. Élimination de la cornée et de l’iris

1. Après 15 min, retirez l’œil de 4 % de PFA dans du PBS et placez-le dans une boîte de dissection de 100 mm sous un microscope à dissection. Remplissez le plat de PBS pour éviter que l’œil ne se dessèche.
2. Retirez la cornée.
   1. Commencez par créer une incision avec une lame chirurgicale de 1 mm en avant du limbe, parallèle au plan de l’iris pour éviter de percer accidentellement les structures sous-jacentes (Figure 1B).
   2. Insérez des ciseaux incurvés dans l’incision initiale et continuez à couper circonférentiellement tout en restant à 1 mm du limbe. Utilisez une pince pour stabiliser l’œil pendant la coupe (Figure 1C).
   3. Une fois la coupe circonférentielle terminée, retirez la cornée à l’aide d’une pince et essuyez doucement l’excès de PBS avec une lingette de laboratoire. Placez la cornée dans une solution de saccharose à 30 % à température ambiante (RT) pour la cryoprotection ou jetez-la. La cryoprotection est complète lorsque la cornée s’enfonce, ce qui prend généralement moins de 1 h.
3. Retirez l’iris.
   1. Commencez par faire une première coupe avec des ciseaux incurvés à travers l’iris. Séparez complètement l’iris du reste du tissu en coupant circonférentiellement comme si vous enleviez la cornée (figure 1D).
   2. Une fois la coupe circonférentielle terminée, retirez l’iris à l’aide d’une pince et essuyez doucement l’excès de PBS avec une lingette de laboratoire. Placez l’iris dans une solution de saccharose à 30 % à RT pour la cryoprotection ou jetez-le comme ci-dessus. La cryoprotection est complète lorsque l’iris coule, ce qui prend généralement moins de 30 min.

4. Achèvement de la fixation

1. Une fois la cornée et l’iris enlevés, placez l’œil dans au moins 50 ml de PFA à 4 % fraîchement préparé dans du PBS et placez-le sur un agitateur pour une agitation douce. Assurez-vous que l’œil reste immergé pendant l’agitation.
2. Garder l’œil dans 4 % de PFA dans le PBS à 4 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : Nous avons constaté qu’un PFA de 4 % entraîne une excellente coloration IHC s’il est utilisé entre 16 h et 24 h à 4 °C, avec des durées de fixation plus longues entraînant une augmentation de la coloration de fond non spécifique et du masquage des épitopes.

5. Retrait de l’objectif

1. Le lendemain matin, retirez l’œil de la PFA à 4 % dans le PBS et placez-le dans une boîte de dissection de 100 mm sous un microscope à dissection. Remplissez le plat de PBS pour éviter que l’œil ne se dessèche.
2. Retirez l’objectif.
   1. Commencez par saisir soigneusement la capsule antérieure du cristallin à l’aide d’une pince.
      REMARQUE : Faites extrêmement attention à ne pas pousser ou tirer avec force sur la lentille avec la pince car cela peut créer un décollement de la rétine.
   2. Insérez soigneusement les ciseaux dans la chambre postérieure avec les lames incurvées vers l’arrière le long de la lentille. Faites une première coupe à travers les zones de l’objectif avec des ciseaux incurvés.
      REMARQUE : Faites extrêmement attention de ne pas pousser ou tirer avec force sur les zonules avec les ciseaux, car cela peut créer un décollement de la rétine (Figure 1E).
   3. Continuez à faire de petites entailles à travers les zonules du cristallin selon un motif circonférentiel. Faites trois à cinq coupes par heure d’horloge.
   4. Pour vérifier si le cristallin est séparé du reste du tissu, saisissez doucement la capsule antérieure du cristallin avec une pince et essayez de la soulever doucement. Si le cristallin ne se soulève pas immédiatement, n’essayez pas de tirer davantage car cela peut créer un décollement de la rétine. Au lieu de cela, faites d’autres coupes à travers les zones restantes de l’objectif et réessayez.
   5. Une fois séparé du reste du tissu, placez le cristallin dans une solution de saccharose à 30% à RT pour la cryoprotection ou jetez-le comme ci-dessus. La cryoprotection est complète lorsque l’objectif coule, ce qui prend généralement quelques heures.
3. Placez l’œil dans au moins 50 ml de saccharose à 30 % de PBS à 4 °C pour la cryoprotection. La cryoprotection est complète lorsque l’œil s’enfonce, ce qui prend généralement de 24 à 48 heures. Pour accélérer la cryoprotection, remplacez la solution initiale de saccharose par une solution fraîche après 8 à 12 heures et/ou gardez l’œil dans une solution de saccharose à RT.

6. Intégration

1. Une fois la cryoprotection terminée, retirez l’œil d’une solution de saccharose à 30 % et placez-le dans une boîte de dissection de 100 mm sous un microscope à dissection. Retournez soigneusement l’œil vers le bas pour qu’il soit orienté vers le bas afin d’éliminer l’excès de solution de saccharose de la partie interne de l’œil.
   REMARQUE : N’essayez pas d’enlever l’excès de solution de la partie interne de l’œil avec une lingette de laboratoire, car la lingette peut coller au corps vitré et entraîner un décollement de la rétine.
2. Avec l’œil vers le bas, essuyez doucement l’excès de solution de saccharose de la partie externe de l’œil à l’aide d’une lingette.
3. Remplissez un moule d’enrobage jetable avec un composé à température de coupe optimale (OCT) jusqu’à une profondeur de 0,5 à 1,0 cm.
   REMARQUE : Cette base garantit que l’œil ne touchera pas le fond du moule, ce qui interfère avec la cryosection plus tard.
4. Placez l’œil dans le moule d’enrobage jetable vers le haut. Remplissez lentement la partie interne de l’œil avec l’OCT en prenant soin d’éviter la formation de bulles dans l’œil. Si des bulles se forment, retirez-les soigneusement ou poussez-les vers le bord du moule à l’aide d’une pince.
5. Assurez-vous que l’œil est complètement immergé dans l’OCT et qu’il ne touche pas les surfaces internes du moule ou n’est pas exposé à l’air. Envelopper le moule d’enrobage jetable contenant l’œil en OCT dans du parafilm ; placer à 4 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : D’après notre expérience, des périodes d’incubation plus courtes ne permettent pas à l’OCT de s’infiltrer complètement dans le vitré. En conséquence, une couche de saccharose reste souvent entre la rétine et l’OCT. Lorsque cela se produit, la rétine se détache souvent ou se déchire complètement du reste du tissu pendant la cryosection, car le saccharose congelé fournit probablement moins de soutien structurel que l’OCT congelé, ce qui rend les coupes de haute qualité difficiles, voire impossibles à obtenir.
6. Le lendemain matin, placez le moule d’encastrement contenant l’œil en OCT dans une boîte de dissection de 100 mm sous un microscope à dissection. Confirmez que la membrane hyaloïde postérieure semble soulevée vers le haut à partir de la rétine interne.
   REMARQUE : Ce soulèvement vers le haut peut obscurcir la vue de la rétine, rendant l’orientation difficile à déterminer.
7. Pour mieux déterminer l’orientation de l’œil, saisissez soigneusement la membrane hyaloïde postérieure vers l’avant et essayez de la décoller avec une pince pour exposer la rétine sous-jacente pendant l’OCT.
   REMARQUE : Parfois, le canal hyaloïde peut être visible, qui se fixe à la tête du nerf optique et peut être utilisé à des fins d’orientation puisque la tête du nerf optique est située dans la partie supérieure de la rétine (Figure 2A). Il n’est pas nécessaire d’enlever complètement la membrane hyaloïde postérieure car l’OCT a déjà infiltré le corps vitré pour tapisser la rétine interne et toute membrane restante n’affectera pas la cryosection (Figure 2B). La membrane hyaloïde postérieure ne doit être retirée que pour l’orientation, si nécessaire. D’autres options pour déterminer l’orientation comprennent la mise en place d’une suture ou d’un autre type de marque avant l’énucléation.
8. Transférez l’œil dans un nouveau moule d’enrobage avec un nouvel OCT rempli à une profondeur de 0,5 à 1,0 cm, puis remplissez avec un nouvel OCT comme aux étapes 6.3-6.5 pour vous assurer que le support d’enrobage final est exempt de débris et/ou d’autres imperfections qui peuvent s’être accumulées pendant la nuit. Si possible, retirez délicatement l’OCT avec une lingette de l’intérieur de l’œil, bien que cela ne soit pas nécessaire.
9. Étiquetez le moule à des fins d’orientation (Figure 2C). L’orientation de l’œil avec l’œil tourné vers le haut dans le moule cryogénique garantit que l’OCT tapissera la rétine interne. Le canal hyaloïde, qui se fixe à la tête du nerf optique, est un point de repère important pour déterminer la partie supérieure de l’œil (Figure 2A).
10. Placez le moule d’enrobage étiqueté contenant l’œil en OCT sur de la glace sèche. Assurez-vous que l’œil ne touche aucune des surfaces intérieures du moule d’enrobage ou n’est pas exposé à l’air. Assurez-vous que le moule touche directement la glace sèche pour accélérer le processus de congélation (Figure 2D).
11. Transférez l’œil encastré dans un congélateur à -80 °C ou directement dans le cryostat pour la coupe (Figure 2E).

7. Cryosectionnement

1. Montez le bloc avec la partie supérieure de l’œil tournée vers le haut et la partie inférieure de l’œil vers l’arrière, avec la cornée et l’iris restants vers la droite (comme sur la figure 2E) ou vers la gauche (non illustré). Vous pouvez également monter le bloc avec une orientation différente, comme vous le souhaitez. Si nécessaire, cassez le moule pour mobiliser le bloc en cassant soigneusement chaque côté du moule un à la fois et en marquant directement le bloc pour ne pas perdre l’orientation de l’œil.
2. Laisser le bloc s’équilibrer à la température à l’intérieur du cryostat pendant 30 à 60 min ; -20 °C est un bon point de départ.
3. Une fois monté, placez une nouvelle lame à l’angle souhaité, généralement parallèle à l’axe vertical de l’œil.
4. Réglez l’épaisseur de la section comme vous le souhaitez : des sections de 10 à 20 μm d’épaisseur sont un bon point de départ. Un exemple de section de 14 μm d’épaisseur est illustré à la figure 3A-C.
   1. De manière lente et contrôlée, commencez à sectionner le bloc. Assurez-vous que la lame coupe le bloc parallèlement à l’axe vertical de l’œil. Si ce n’est pas le cas, ajustez l’angle de contact de la lame avec le bloc ou l’orientation de la platine en conséquence.
   2. Pendant la coupe du bloc, évitez de froisser ou de gonfler la section avec une brosse. Retournez rapidement la section et appliquez une légère pression vers le bas avec une brosse à poils longs pour aplatir la section et minimiser les plis ou les courbures. Façonnez un pinceau séparé avec une pointe pointue pour faciliter la manipulation de la section.
5. Fixez la section à une lame de verre chargée en déplaçant lentement la diapositive vers le bas vers la section. Empêchez la section de se replier sur elle-même ou de se déformer lors de la fixation en faisant rouler doucement la lame de verre sur la section.
   REMARQUE : Ne passez pas la glissière directement sur la section ou ne l’appuyez pas contre la section car cela pourrait endommager ou déformer la section.
6. Laissez les lames sécher pendant la nuit avant de les transférer dans un congélateur à -80 °C ou de passer directement à un protocole d’immunofluorescence standard.

Résultats

Après le traitement des tissus, un protocole d’immunofluorescence standard peut être utilisé pour étudier un certain nombre de processus biologiques dans la rétine. Les figures 3A-C illustrent des images de fluorescence représentatives d’une coupe de rétine obtenues par microscopie confocale. La coupe rétinienne a été immuno-colorée selon un protocole décrit précédemment¹².

Les coupes rét...

Discussion

Avant de mettre en œuvre le protocole ci-dessus, nous rencontrions constamment des difficultés avec le traitement tissulaire des yeux de lapin pour l’IHC. Nous avions adapté plusieurs protocoles à partir des yeux de petits animaux tels que les souris, mais nous avons constaté que ceux-ci entraînaient une fixation inadéquate et des difficultés de section des tissus. Il y a plusieurs considérations importantes qui permettent d’obtenir des sections cohérentes et de haute qualité de la rétine du lapin.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)