Obtention de cryosections de haute qualité d’œil de lapin entier

Résumé

Ce protocole décrit une méthode fiable pour obtenir des cryosections de haute qualité d’yeux de lapin entiers. Il détaille les procédures de dissection, de fixation, d’intégration et de sectionnement de l’œil de lapin, qui peuvent être facilement adaptées pour être utilisées dans toute étude utilisant l’immunohistochimie dans des yeux plus grands.

Résumé

Ce protocole décrit comment obtenir des cryosections rétiniennes de haute qualité chez des animaux de grande taille, tels que les lapins. Après l’énucléation, l’œil est brièvement immergé dans le fixateur. Ensuite, la cornée et l’iris sont retirés et l’œil est laissé toute la nuit pour une fixation supplémentaire à 4 °C. Après la fixation, l’objectif est retiré. L’œil est ensuite placé dans un cryomoule et rempli d’un milieu d’enrobage. En retirant le cristallin, le milieu d’enrobage a un meilleur accès au vitré et conduit à une meilleure stabilité rétinienne. Il est important que l’œil soit incubé dans un milieu d’enrobage pendant la nuit pour permettre une infiltration complète dans tout le vitré. Après une nuit d’incubation, l’œil est congelé sur de la glace sèche et sectionné. Des coupes rétiniennes entières peuvent être obtenues pour une utilisation en immunohistochimie. Des protocoles de coloration standard peuvent être utilisés pour étudier la localisation des antigènes dans le tissu rétinien. Le respect de ce protocole permet d’obtenir des cryosections rétiniennes de haute qualité qui peuvent être utilisées dans toute expérience utilisant l’immunohistochimie.

Introduction

La rétine est composée de plusieurs couches de cellules spécialisées dans l’œil qui, ensemble, convertissent la lumière en signaux neuronaux. Parce que la rétine joue un rôle essentiel dans la vision, la compréhension de sa structure et de sa fonction peut fournir des informations précieuses sur certaines des causes les plus courantes de perte de vision, telles que la dégénérescence maculaire et la rétinopathie diabétique, entre autres.

Les lapins servent de modèle animal pratique dans la recherche rétinienne car ils offrent plusieurs avantages par rapport aux autres modèles. L’anatomie des yeux de lapin est relativement similaire à celle d....

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie du Sud. Quatorze (n = 14) lapins à ceinture hollandaise âgés de 4 à 6 mois ont été utilisés dans l’élaboration de ce protocole. Des animaux mâles et femelles ont été utilisés. Tous les animaux pesaient entre 2,0 et 2,5 kg. Tous les animaux étaient logés individuellement. Une liste des matériaux et équipements recommandés se trouve dans la Table des matériaux.

1. Préparation

1. Préparation fixative.
   1. Préparez du paraform....

Discussion

Avant de mettre en œuvre le protocole ci-dessus, nous rencontrions constamment des difficultés avec le traitement tissulaire des yeux de lapin pour l’IHC. Nous avions adapté plusieurs protocoles à partir des yeux de petits animaux tels que les souris, mais nous avons constaté que ceux-ci entraînaient une fixation inadéquate et des difficultés de section des tissus. Il y a plusieurs considérations importantes qui permettent d’obtenir des sections cohérentes et de haute qualité de la rétine du lapin.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)