Obtención de criosecciones de alta calidad de ojo de conejo entero

Resumen

Este protocolo describe un método fiable para obtener criosecciones de alta calidad de ojos de conejo enteros. En él se detallan los procedimientos de disección, fijación, inclusión y seccionamiento de ojos de conejo, que pueden adaptarse fácilmente para su uso en cualquier estudio que utilice inmunohistoquímica en ojos más grandes.

Resumen

Este protocolo describe cómo obtener criosecciones de retina de alta calidad en animales más grandes, como conejos. Después de la enucleación, el ojo se sumerge brevemente en el fijador. A continuación, se extraen la córnea y el iris y se deja el ojo toda la noche para una fijación adicional a 4 °C. Después de la fijación, se retira la lente. A continuación, el ojo se coloca en un criomold y se llena con un medio de inclusión. Al retirar el cristalino, el medio de inclusión tiene un mejor acceso al vítreo y conduce a una mejor estabilidad de la retina. Es importante destacar que el ojo debe incubarse en un medio de inclusión durante la noche para permitir una infiltración completa en todo el vítreo. Después de la incubación durante la noche, el ojo se congela en hielo seco y se secciona. Se pueden obtener secciones completas de la retina para su uso en inmunohistoquímica. Se pueden utilizar protocolos de tinción estándar para estudiar la localización de antígenos dentro del tejido de la retina. El cumplimiento de este protocolo da como resultado criosecciones de retina de alta calidad que se pueden utilizar en cualquier experimento que utilice inmunohistoquímica.

Introducción

La retina está compuesta por varias capas de células especializadas dentro del ojo que juntas trabajan para convertir la luz en señales neuronales. Debido a que la retina desempeña un papel fundamental en la visión, la comprensión de su estructura y función puede proporcionar información valiosa sobre algunas de las causas más comunes de pérdida de visión, como la degeneración macular y la retinopatía diabética, entre otras.

Los conejos sirven como un modelo animal conveniente en la investigación de la retina, ya que ofrecen varias ventajas en comparación con otros modelos. Los ojos de conejo son relativamente similares en anatomía a los ojos humanos ^1,2. Por ejemplo, los conejos tienen un área de mayor densidad de fotorreceptores, conocida como raya visual horizontal, que es análoga a la fóvea de los humanos. Otros modelos animales comúnmente utilizados, como los roedores, no tienen un equivalente anatómico. Además, en comparación con los roedores, la vasculatura de la retina de los conejos es bastante similar a la de los humanos. Los ojos de conejo también son relativamente grandes. Esto los hace especialmente adecuados para estudios que implican la administración de fármacos o la intervención quirúrgica dentro del vítreo o la retina que, de otro modo, podrían ser difíciles o imposibles en un ojo más pequeño³.

La inmunohistoquímica (IHQ) es una técnica ampliamente utilizada para estudiar la localización de antígenos dentro de un tejido y tiene amplias aplicaciones en la investigación de la retina ^4,5,6. Debido a que la retina es una estructura delicada, la obtención de resultados útiles a través de IHQ requiere un procesamiento cuidadoso de los tejidos. El desprendimiento de retina y otros artefactos tisulares, como roturas o pliegues de retina, ocurren comúnmente durante el procesamiento y pueden interferir con la interpretación de los resultados. El procesamiento exitoso depende de una variedad de factores, incluyendo la manipulación del tejido, el tipo y la duración de la fijación, el tipo de medio de inclusión y las técnicas de corte 7,8,9,10. A pesar de las ventajas de utilizar conejos como modelo animal en la investigación de la retina, existen muy pocos protocolos que describan el procesamiento exitoso de los tejidos de la retina del conejo. Este artículo describe un método confiable para obtener secciones de retina de alta calidad de ojos de conejo enteros para su uso en IHQ.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad del Sur de California. En el desarrollo de este protocolo se utilizaron catorce (n = 14) conejos de entre 4 y 6 meses de edad. Se utilizaron animales machos y hembras. Todos los animales pesaron entre 2,0 y 2,5 kg. Todos los animales estaban alojados individualmente. Puede encontrar una lista de materiales y equipos recomendados en la Tabla de Materiales.

1. Preparación

1. Preparación del fijador.
   1. Prepare paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Como mínimo, se requieren 50 ml de fijador por ojo.
2. Preparación de agentes crioprotectores.
   1. Prepare 30% de peso por volumen (p/v) de sacarosa en PBS. Coloque en una coctelera durante al menos 15 minutos para asegurarse de que la sacarosa se disuelva por completo. Como mínimo, se requieren 50 ml de agente crioprotector por ojo.
3. Preparación del instrumento de disección.
   1. Reúna dos pares de pinzas, un par de tijeras curvas, una hoja de bisturí y un plato de disección de 100 mm y colóquelos cerca de un microscopio de disección. En la Figura 1A se muestra un ejemplo de configuración.

2. Fijación inicial

1. Después de la enucleación transconjuntival¹¹, coloque inmediatamente el ojo en al menos 50 mL de PFA al 4% en PBS en hielo. Asegúrese de que el ojo esté completamente sumergido. Si se acumulan burbujas de aire en la superficie exterior del ojo, retírelas agitándolas suavemente.

3. Extirpación de córnea e iris

1. Después de 15 minutos, retire el ojo del PFA al 4% en PBS y colóquelo en una placa de disección de 100 mm bajo un microscopio de disección. Llene el plato con PBS para evitar que el ojo se seque.
2. Retira la córnea.
   1. Comience creando una incisión con una cuchilla quirúrgica 1 mm por delante del limbo, paralela al plano del iris para evitar perforar accidentalmente las estructuras subyacentes (Figura 1B).
   2. Inserte las tijeras curvas en la incisión inicial y continúe cortando circunferencialmente mientras permanece a 1 mm del limbo. Use fórceps para estabilizar el ojo mientras corta (Figura 1C).
   3. Una vez que se complete el corte circunferencial, retire la córnea con pinzas y limpie suavemente el exceso de PBS con una toallita de laboratorio. Coloque la córnea en una solución de sacarosa al 30% a temperatura ambiente (RT) para crioprotegerla o desecharla. La crioprotección se completa cuando la córnea se hunde, lo que suele tardar menos de 1 hora.
3. Retira el iris.
   1. Comienza haciendo un corte inicial con tijeras curvas a través del iris. Separe completamente el iris del resto del tejido mediante un corte circunferencial similar a la extracción de la córnea (Figura 1D).
   2. Una vez que se complete el corte circunferencial, retire el iris con pinzas y limpie suavemente el exceso de PBS con una toallita de laboratorio. Coloque el iris en una solución de sacarosa al 30% en RT para crioprotección o deséchelo como se indicó anteriormente. La crioprotección se completa cuando el iris se hunde, lo que suele tardar menos de 30 minutos.

4. Finalización de la fijación

1. Una vez extirpados la córnea y el iris, coloque el ojo en al menos 50 ml de PFA al 4% recién preparado en PBS y colóquelo en una batidora para una agitación suave. Asegúrese de que el ojo permanezca sumergido durante la agitación.
2. Mantenga el ojo en PFA al 4% en PBS a 4 °C durante la noche.
   NOTA: Hemos encontrado que el PFA al 4% da como resultado una excelente tinción IHQ si se usa entre 16 h y 24 h a 4 °C, con duraciones de fijación más largas que resultan en un aumento de la tinción de fondo inespecífica y el enmascaramiento de epítopos.

5. Extracción de lentes

1. A la mañana siguiente, retire el ojo del PFA al 4% en PBS y colóquelo en una placa de disección de 100 mm bajo un microscopio de disección. Llene el plato con PBS para evitar que el ojo se seque.
2. Retire la lente.
   1. Comience agarrando cuidadosamente la cápsula anterior del cristalino con pinzas.
      NOTA: Tenga mucho cuidado de no empujar o tirar con fuerza de la lente con las pinzas, ya que esto puede crear un desprendimiento de retina.
   2. Inserte con cuidado las tijeras en la cámara posterior con las hojas curvadas hacia atrás a lo largo de la lente. Haz un corte inicial a través de las zonas de la lente con unas tijeras curvas.
      NOTA: Tenga mucho cuidado de no empujar o tirar con fuerza de las zónulas con las tijeras, ya que esto puede crear un desprendimiento de retina (Figura 1E).
   3. Continúe haciendo pequeños cortes a través de las zónulas del cristalino en un patrón circunferencial. Haz de tres a cinco cortes por hora de reloj.
   4. Para comprobar si el cristalino está separado del resto del tejido, sujete suavemente la cápsula anterior del cristalino con pinzas e intente levantarla suavemente. Si el cristalino no se levanta inmediatamente, no intente tirar más, ya que esto puede crear un desprendimiento de retina. En su lugar, haga más cortes a través de las zonas restantes de la lente y vuelva a intentarlo.
   5. Una vez separada del resto del tejido, coloque la lente en una solución de sacarosa al 30% en RT para crioprotección o deséchela como se indicó anteriormente. La crioprotección se completa cuando la lente se hunde, lo que suele tardar unas horas.
3. Coloque el ojo en al menos 50 ml de sacarosa al 30% en PBS a 4 °C para la crioprotección. La crioprotección se completa cuando el ojo se hunde, lo que suele tardar entre 24 y 48 horas. Para acelerar la crioprotección, cambie la solución inicial de sacarosa por una nueva después de 8-12 h y/o mantenga el ojo en solución de sacarosa en RT.

6. Incrustación

1. Una vez completada la crioprotección, retire el ojo de la solución de sacarosa al 30% y colóquelo en una placa de disección de 100 mm bajo un microscopio de disección. Voltee con cuidado el ojo para que mire hacia abajo para eliminar el exceso de solución de sacarosa de la parte interna del ojo.
   NOTA: No intente eliminar el exceso de solución de la parte interna del ojo con una toallita de laboratorio, ya que la toallita puede adherirse al cuerpo vítreo y provocar un desprendimiento de retina.
2. Con el ojo hacia abajo, limpie suavemente el exceso de solución de sacarosa de la parte exterior del ojo con una toallita.
3. Llene un molde de inclusión desechable con compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) a una profundidad de 0,5-1,0 cm.
   NOTA: Esta base asegura que el ojo no toque el fondo del molde, lo que interfiere con la criosección posterior.
4. Coloque el ojo en el molde de inclusión desechable mirando hacia arriba. Rellene lentamente la parte interna del ojo con OCT teniendo especial cuidado para evitar la formación de burbujas dentro del ojo. Si se forman burbujas, retírelas con cuidado o empújelas hasta el borde del molde con pinzas.
5. Termine de llenar el molde de inclusión desechable con OCT. Asegúrese de que el ojo esté completamente sumergido en OCT y no toque las superficies internas del molde ni esté expuesto al aire. Envuelva el molde de inclusión desechable que contiene el ojo en OCT en parafilm; colocar a 4 °C durante la noche.
   NOTA: En nuestra experiencia, los períodos de incubación más cortos no permiten que la OCT se infiltre completamente en el vítreo. Como resultado, a menudo queda una capa de sacarosa entre la retina y la OCT. Cuando esto ocurre, la retina a menudo se desprende o se desgarra por completo del resto del tejido durante la criosección, ya que es probable que la sacarosa congelada proporcione menos soporte estructural que la OCT congelada, lo que dificulta o incluso imposibilita la obtención de secciones de alta calidad.
6. A la mañana siguiente, coloque el molde de inclusión que contiene el ojo en OCT en una placa de disección de 100 mm bajo un microscopio de disección. Confirmar que la membrana hialoidea posterior aparece levantada hacia arriba desde la retina interna.
   NOTA: Este levantamiento hacia arriba puede oscurecer la vista de la retina, lo que dificulta la determinación de la orientación.
7. Para determinar mejor la orientación del ojo, agarre cuidadosamente la membrana hialoides posterior anteriormente e intente despegarla con fórceps para exponer la retina subyacente mientras está en OCT.
   NOTA: A veces, puede ser visible el canal hialoideo, que se une a la cabeza del nervio óptico y se puede usar con fines de orientación, ya que la cabeza del nervio óptico se encuentra en la porción superior de la retina (Figura 2A). No es necesario extirpar completamente la membrana hialoidea posterior, ya que la OCT ya se ha infiltrado en el cuerpo vítreo para revestir la retina interna y cualquier membrana restante no afectará la criosección (Figura 2B). La membrana hialoidea posterior solo debe retirarse para orientarse, si es necesario. Otras opciones para determinar la orientación incluyen la colocación de una sutura u otro tipo de marca antes de la enucleación.
8. Transfiera el ojo a un nuevo molde de inclusión con nuevo OCT relleno a una profundidad de 0,5-1,0 cm y luego llénelo con nuevo OCT como en los pasos 6.3-6.5 para asegurarse de que el medio de inclusión final esté libre de residuos y/u otras imperfecciones que puedan haberse acumulado durante la noche. Si es posible, retire suavemente la OCT con una toallita también desde el interior del ojo, aunque esto no es necesario.
9. Etiquete el molde con fines orientativos (Figura 2C). Orientar el ojo con el ojo hacia arriba en el molde criogénico asegura que la OCT revestirá la retina interna. El canal hialoideo, que se une a la cabeza del nervio óptico, es un punto de referencia importante para determinar la parte superior del ojo (Figura 2A).
10. Coloque el molde de inclusión etiquetado que contiene el ojo en OCT sobre hielo seco. Asegúrese de que el ojo no toque ninguna de las superficies internas del molde de incrustación ni esté expuesto al aire. Asegúrese de que el molde esté en contacto directo con el hielo seco para acelerar el proceso de congelación (Figura 2D).
11. Transfiera el ojo incrustado a un congelador a -80 °C o directamente al criostato para seccionarlo (Figura 2E).

7. Crioseccionamiento

1. Monte el bloque con la parte superior del ojo mirando hacia arriba y la parte inferior del ojo hacia abajo, con la córnea y el iris restantes mirando hacia la derecha (como en la Figura 2E) o hacia la izquierda (no se muestra). Alternativamente, monte el bloque con una orientación diferente, según lo desee. Si es necesario, rompa el molde para movilizar el bloque rompiendo con cuidado cada lado del molde uno a la vez y marcando el bloque directamente para no perder la orientación del ojo.
2. Deje que el bloque se equilibre a la temperatura dentro del criostato durante 30-60 minutos; -20 °C es un buen punto de partida.
3. Una vez montado, coloque una cuchilla nueva en el ángulo deseado, generalmente paralelo al eje vertical del ojo.
4. Ajuste el grosor de la sección como desee: las secciones de 10-20 μm de grosor son un buen punto de partida. En la Figura 3A-C se muestra un ejemplo de una sección de 14 μm de grosor.
   1. De manera lenta y controlada, comience a seccionar el bloque. Asegúrese de que la cuchilla esté cortando el bloque paralelo al eje vertical del ojo. De lo contrario, ajuste el ángulo en que la hoja entra en contacto con el bloque o la orientación de la etapa en consecuencia.
   2. Mientras secciona el bloque, evite arrugar o enroscar la sección con un cepillo. Dale la vuelta rápidamente a la sección y aplica una suave presión hacia abajo con un cepillo de pelo largo para aplanar la sección y minimizar las arrugas o rizados. Forma un pincel separado con una punta puntiaguda para ayudar a la manipulación de la sección.
5. Fije la sección a un portaobjetos de vidrio cargado moviendo lentamente el portaobjetos hacia abajo hacia la sección. Evite que la sección se pliegue sobre sí misma o se deforme durante la fijación haciendo rodar suavemente el portaobjetos de vidrio sobre la sección.
   NOTA: No coloque la corredera directamente sobre la sección ni la presione contra la sección, ya que esto puede dañar o distorsionar la sección.
6. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche antes de transferirlos a un congelador de -80 °C o pasar directamente a un protocolo de inmunofluorescencia estándar.

Resultados

Después del procesamiento de tejidos, se puede utilizar un protocolo de inmunofluorescencia estándar para investigar cualquier número de procesos biológicos dentro de la retina. Las figuras 3A-C ilustran imágenes representativas de fluorescencia de una sección de retina obtenida mediante microscopía confocal. La sección retiniana fue inmunoteñida de acuerdo con un protocolo previamente descrito¹².

...

Discusión

Antes de implementar el protocolo anterior, nos enfrentábamos constantemente a dificultades con el procesamiento de tejidos de ojos de conejo para IHQ. Habíamos adaptado varios protocolos de los ojos de animales más pequeños, como ratones, pero descubrimos que estos conducían a una fijación inadecuada y a dificultades con el corte de tejidos. Hay varias consideraciones importantes que permiten secciones consistentes y de alta calidad de la retina del conejo.

Una consideración es el gran...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)